Derivados funcionalizados de boscalid.

La presente invención se refiere a nuevos derivados funcionalizados químicamente de boscalid.

Además la presente invención se refiere a inmunógenos de boscalid, a los derivados conjugados o marcados y a los anticuerpos que se obtienen a partir de los inmunógenos de la presente invención.

Derivados funcionalizados de boscalid.

La presente invención se refiere a nuevos derivados funcionalizados químicamente de boscalid. Además la presente invención se refiere a inmunógenos de boscalid, a los derivados conjugados o marcados y a los anticuerpos que se obtienen a partir de los inmunógenos de la presente invención.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los fungicidas son el grupo de plaguicidas que con mayor frecuencia aparece en los programas de vigilancia y control. Esto es así no sólo por su elevado uso, sino principalmente porque estos productos de protección vegetal se emplean para combatir las infecciones causadas por hongos en momentos muy próximos a la cosecha o incluso con posterioridad (fungicidas postcosecha) . Este hecho incrementa considerablemente la probabilidad de que residuos de dichos tratamientos permanezcan cuando el alimento llegue al consumidor, lo que obliga a los organismos de regulación y control a estar más vigilantes e idealmente a aumentar los controles. Los ataques por hongos en frutos almacenados constituyen uno de los motivos principales de pérdidas económicas en agricultura. El uso intensivo de fungicidas convencionales, como el tiabendazol o el imazalil, ha llevado en los últimos años a la aparición de cepas resistentes y por tanto a una menor eficacia de los tratamientos con estos productos. Ante esta circunstancia, las empresas agroquímicas pusieron en marcha programas de I+D encaminados a desarrollar nuevos productos que presentaran mecanismos de acción innovadores y que permitieran combatir de forma eficaz las infecciones fúngicas, al tiempo que fueran seguros y compatibles con los programas de gestión integrada de plagas. Estos productos están comenzando a sustituir progresivamente a los productos más antiguos, que resultan menos aceptables desde un punto de vista toxicológico y medioambiental.

Entre los fungicidas más relevantes desarrollados en la última década con aplicaciones en postcosecha destaca el boscalid [H.J. Rosslenbroich y D. Stuebler, Crop Protection 2000, 19, 557-561]. El boscalid (2-cloro-N- (4-clorobifenil2-il) nicotinamida) es un producto fitosanitario desarrollado por BASF y lanzado al mercado en la temporada 2003/2004. Se trata del único fungicida desarrollado hasta la fecha de la familia de las carboxamidas. En la actualidad ha sido ya registrado para combatir más de 80 enfermedades que afectan a más de 100 cultivos en aproximadamente 50 países. El boscalid ha sido incluido muy recientemente (2008) en el Anexo I de la directiva 91/414/EEC de la Unión Europea relativa a la introducción en el mercado de productos fitosanitarios. El boscalid combate a los hongos mediante la inhibición de la enzima succinato-ubiquinona reductasa, también conocida como complejo II de la cadena de transporte electrónico mitocondrial. Esta enzima, además de canalizar el transporte de electrones a través del cosustrato ubiquinol (QH2) , ocupa un lugar central en el metabolismo del hongo, ya que también cataliza la oxidación del succinato a fumarato como parte del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. De este modo, se bloquean al mismo tiempo tanto la producción de energía como la biosíntesis de los aminoácidos y lípidos esenciales para el desarrollo de las células fúngicas. Por tanto, el boscalid presenta una doble actividad, y resulta extraordinariamente eficaz frente a Botr y ris cinerea y Penicillium spp. Entre los cultivos para los que la UE ha establecido Límites Máximos de Residuos de forma explícita para boscalid figuran la fruta de hueso y de pepita (2-3 ppm) , uva y kiwi (5 ppm) , fresa (10 ppm) , patata (0.5 ppm) , y tomate, pimiento y berenjena (1-3 ppm) .

Las metodologías analíticas empleadas para el análisis de estos fungicidas son fundamentalmente de tipo instrumental, en especial cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) , acopladas a diferentes detectores según el tipo de compuesto a analizar y la sensibilidad requerida [J.L. Tadeo, Analysis of Pesticides in Food and Environmental Samples, CRC Press, Boca Raton, 2008]. Estas técnicas se caracterizan por su capacidad para analizar simultáneamente varios residuos con una elevada precisión y exactitud. Sin embargo, pese a que resultan imprescindibles en muchas circunstancias, con frecuencia implican la utilización de metodologías laboriosas y de elevado coste, que deben realizarse por personal altamente cualificado en laboratorios centralizados bien equipados y habitualmente alejados de las zonas de producción. Estas limitaciones condicionan la idoneidad de estas técnicas para acometer el análisis de grandes números de muestras y para obtener resultados en breve plazo, dos aspectos que contribuirían a garantizar la seguridad de los alimentos comercializados y a la realización de estudios más exhaustivos sobre la exposición de los consumidores a estos fungicidas a través de los alimentos.

Los inmunoensayos son técnicas bioanalíticas basadas en la interacción de un antígeno (el analito) con un anticuerpo que lo reconoce específicamente. No obstante, un plaguicida es una molécula orgánica pequeña que constituye un único sitio de unión al anticuerpo. Por esta razón, la interacción entre el analito y el anticuerpo se realiza por desplazamiento de la unión entre el anticuerpo y un análogo marcado del analito. De este modo, en presencia del analito se establece una competencia entre éste y el análogo marcado por la unión al anticuerpo. Habitualmente, el marcaje se realiza con una actividad enzimática, dando así lugar a los enzimoinmunoensayos. Los primeros inmunoensayos enzimáticos para plaguicidas se desarrollaron durante la primera mitad de los años 80 [F. Jung et al., Pest. Sci. 1989, 26, 303-317]. Desde entonces hasta la actualidad, el número de plaguicidas para los cuales se han desarrollado inmunoensayos ha aumentado espectacularmente, suponiendo varias decenas y cubriendo los principales grupos de compuestos: insecticidas, herbicidas y fungicidas [V.S. Morozova et al., J. Anal. Chem. 2005, 60, 202-217]. Un gran número de estos ensayos están disponibles comercialmente en forma de kits con diferentes formatos. La creciente aceptación de los inmunoensayos como técnicas complementarias a las cromatográficas para el análisis de pequeñas moléculas orgánicas se debe a que se trata de una metodología sencilla, rápida y de bajo coste, exhibiendo al mismo tiempo una elevada sensibilidad y especificidad. Los inmunoensayos permiten detectar específicamente el analito diana en mezclas muy complejas, simplificando considerablemente los laboriosos procedimientos de preparación de la muestra, lo que a su vez redunda en un aumento en la capacidad de muestreo. Además, los inmunoensayos pueden realizarse en formatos portátiles, lo que los independiza de los laboratorios centralizados y los convierte en idóneos para el análisis en los puntos de producción. Las excelencias analíticas atribuidas a los inmunoensayos ya han sido demostradas en muchas aplicaciones prácticas, donde han competido favorablemente con las técnicas cromatográficas [M.C. Hennion, Analysis 1998, 26, 149-155; A. Abad et al., J. Chromatogr. A 1999, 833, 3-12; A. Abad et al., J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 1707-1712; N.A. Lee y I.R. Kennedy, J. AOAC Int. 2001, 84, 1393-1406].

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Hasta la fecha no se han sintetizado derivados funcionalizados de boscalid ni existen anticuerpos contra dicho plaguicida. Los reactivos que se describen en la presente invención son los primeros derivados funcionalizados y conjugados de boscalid, producidos para la obtención de anticuerpos y el desarrollo de inmunoensayos contra este fungicida. En primer lugar, se describe la síntesis de haptenos funcionalizados de boscalid por diferentes posiciones. Con estos derivados se prepararon conjugados a proteínas transportadoras necesarias para la obtención de anticuerpos y la realización de inmunoensayos. Finalmente, se describen anticuerpos con elevada afinidad y selectivos de boscalid.

Un primer aspecto de la presente invención describe haptenos de boscalid funcionalizados para generar inmunógenos, conjugados y anticuerpos contra el boscalid. Dichos haptenos activados están representados por los compuestos de fórmula general (I) :

B-X-L-Y

(I)

donde B se selecciona entre un radical 2- (nicotinamido) bifenilo (R-I) , un radical 2- (2-cloronicotinamido) bifenilo (R-II) , un radical 4'-cloro-2- (nicotinamido) bifenilo (R-III) y un radical 4'-cloro-2- (2-cloronicotinamido) bifenilo (R-IV) ;

4' 4'

3' 5'

5'3' N Cl 6'... [Seguir leyendo]

1. Un compuesto de fórmula general (I) :

B-X-L-Y

(I)

donde 5 B se selecciona entre uno cualquiera de los siguientes radicales (R-I) , (R-II) , (R-III) y (R-IV) :

4'4'

3'3'

N Cl

2'

N

2' 62

6 2

H

H

N

N

3 44

O

O

(R-II) 5

(R-I)

Cl Cl 3'

3'

N

2'

N Cl

2'6

2 3

H

H

N

N

3 4

O

4 O

4 5

(R-III) (R-IV)

;

X puede estar presente o no y se selecciona entre O, S, NH y un átomo de carbono saturado o insaturado;

L representa un espaciador de 0 a 40 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada y que puede comprender hasta dos estructuras de anillo y entre 0 y 20 heteroátomos siendo los heteroátomos seleccionados entre S, O y N, con la condición de que no más de dos heteroátomos puedan unirse en secuencia; e Y es un grupo funcional seleccionado entre -COOH, -OH, -NH2, -NH-, -N3, -CH2Cl, -CHCI-, -CH2Br, -CHBr-, -CH2I, -CHI-, -CHO, -SH, -S-S-, -SO3H, -SO3H, -OSO2Ph, -OSO2Ar, -NH-NH2 y -C (=N-NH2) -.

15 2. El compuesto según la reivindicación 1, donde X se selecciona entre S y C.

3. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.

4. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Y es un grupo funcional conjugable seleccionado entre un -COOH, -CHO, -NH2 y -SH.

20 5. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se selecciona entre:

S (CH2) 4CO2HCl (CH2) 5CO2H OCHN

Cl NHCONHCO

ClS (CH2) 4CO2H N NN

, Cl y

.

6. Un compuesto de fórmula general (II) :

[B-X-L-Z]n-P

(II) donde B se selecciona entre uno cualquiera de los siguientes radicales (R-I) , (R-II) , (R-III) y (R-IV) :

4'

4'

3' 3'

N Cl

2'

N

2' 6

2 3

H

3 5

H N

N

3 44

O

O

4 5

5 (R-II) (R-I)

(R-III) (R-IV)

;

X puede estar presente o no y se selecciona entre O, S, NH y un átomo de carbono saturado o insaturado;

L representa un espaciador de 0 a 40 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada y que puede comprender hasta dos estructuras de anillo y entre 0 y 20 heteroátomos siendo los heteroátomos seleccionados entre S, O y N, con la condición de que no más de dos heteroátomos puedan unirse en secuencia;

Z es un grupo funcional seleccionado entre -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH (C=NH) -, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH- y O

O

;

P se selecciona del grupo formado por péptidos, polipéptidos, polisacáridos o polímeros sintéticos; y n es un número entero seleccionado entre 1 y 50 por cada 50 kilodaltons de peso molecular de P.

7. El compuesto según la reivindicación 6, donde X se selecciona entre S y C.

8. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, donde L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.

9. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde Z se selecciona entre un grupo -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S- y

O

.

10. El compuesto según las reivindicaciones 6 a 9, donde P se selecciona, del grupo formado por albúmina, tiroglobulina, hemocianina, beta-galactosidasa, peroxidasa, fosfatasa u oxidasa.

11. Un compuesto de fórmula general (III) :

[B-X-L-Z]n-Q

(III)

donde B se selecciona entre uno cualquiera de los siguientes radicales (R-I) , (R-II) , (R-III) y (R-IV) :

4'

4' 3'

5'3'5' N Cl 6' 2'

N 6' 2'

2 1'

H

5

H N

3

N 2

3 44

O

6 4

O

4 5

5 (R-II)

(R-I)

ClCl 4'4' 3'

3' 5'5'

N Cl 6'

2' 6 N 6' 2'

6 2

2 1'

HH

N 2 4

N

3 4

O 64 O 6

(R-III) (R-IV)

;

X puede estar presente o no y se selecciona entre O, S, NH y un átomo de carbono saturado o insaturado;

L representa un espaciador de 0 a 40 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal o ramificada, saturada o insaturada y que puede comprender hasta dos estructuras de anillo y entre 0 y 20 heteroátomos siendo los heteroátomos seleccionados entre S, O y N, con la condición de que no más de dos heteroátomos puedan unirse en secuencia;

Z es un grupo funcional seleccionado entre -CONH-, -NHCO-, -NHCONH-, -NHCSNH-, -OCONH-, -NHOCO-, -OCSNH-, -SCONH-, -S-, -S-S-, -NH (C=NH) -, -CO-, -CHOH-, -N=N-, -NH- y O

; 10 Q es un marcador químico isotópico o no isotópico; y n es un número entero entre 1 y 50 por cada 50 kilodaltons de peso molecular de Q.

12. El compuesto según la reivindicación 11, donde X se selecciona entre S y C.

13. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, donde L representa un espaciador de 0 a 8 átomos de carbono dispuestos en una cadena lineal.

14. El compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, donde Z se selecciona entre un grupo -CONH-, -NHCO-, -NH-, -S- y 15. El compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, donde Q se selecciona, entre biotina, fluoresceína y sus derivados, fluoróforos de cianinas, de rodaminas o de cumarinas, bipiridilos de rutenio, derivados de TEXAS RED y de BODIPY, luciferina y derivados, ésteres de acridinio, así como partículas de oro coloidal, de carbón o de látex.

16. Un anticuerpo generado en respuesta a un inmunógeno de fórmula general (II) :

[B-X-L-Z]n-P

(II)

tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.

17. Método de detección de boscalid en una muestra aislada que comprende las siguientes etapas:

a. poner en contacto una muestra aislada con el anticuerpo generado según la reivindicación 16;

b. incubar la muestra aislada y el anticuerpo del paso (a) durante un periodo de tiempo adecuado para que tenga lugar una reacción inmunoquímica y

c. determinar la existencia de reacción inmunoquímica tras la incubación del paso (b) .

18. El método según la reivindicación 17, donde la determinación de la reacción inmunoquímica en el paso c se realiza mediante un inmunoensayo.

19. Kit de detección de boscalid, que comprende los anticuerpos según la reivindicación 16.

MeO OMe Br (CH2) 4CO2H (2) CO2H

CO2H CO2H (COCl) 2-DMF cat

KOH-NaHCO3 N SH H2O, 4h, rtN S (CH2) 4CO2H Me3SiCl, 7d, rtN S (CH2) 4CO2Me CH2Cl2, 24h 89% 85%

13 4

NaOHi) MeOH-H2O

CO2Cl2-amino biphelyl 11 CONHCONH

4h, rt

Cl Cl DMAP

S (CH2) 4CO2H Py-CH2Cl2 S (CH2) 4CO2Me ii) H3O+ N S (CH2) 4CO2Me N N

89%

7 (Hapteno BLa5)

91%

4. ClPhB (OH) 2 (9)

H2N

O2N

Fe-NH4Cl Pd (PPh3) 4 -K3PO4

EtOH-H2O

dioxane-H2O

O2N

reflux, 1h

I 85ºC, 48h

89% Cl Cl 90%

FIG. 1

C (CH2) 3CO2tBu

I HC C (CH2) 3CO2tBu (14)

I

C

p-Cl-Ph-B (OH) 2 (9)

HNO3 fumante (Ph3P) 2PdCl2

Pd (Ph3) 4, K3PO4

0ºC O2N

ICu, Et3N, DMF O2N I 95% I I 85ºC, 21h

60%

13 15

83%

C (CH2) 3CO2tBu (CH2) 5CO2tBu (CH2) 5CO2tBuC

COCl RhCl (PPh3) 3 O2N

Fe, NH4Cl H2N (19) O2N

N Cl H2, THF, 1h

EtOH-H2O; reflujo, 1h 95%

THF, t.a. 24h

98%

95%

16 Cl 17 Cl 18

Cl FIG. 2

SH

i) Br (CH2) 4CO2tBu (24)

S (CH2) 4CO2tBu SH o-I-Ph-NO2 (8)

K2CO3 - NaI

HOCH2CH2OH MgSO4

Pd (Ph3) 4-K3PO4

O

CH3CN, t.a., 5h

B

dioxane-H2OEt2O, 30 min, t.a. O ii) silica gel BHO

reflujo, 18h (HO) 2B 93% OH

22 23 85%

86%

S (CH2) 4CO2HS (CH2) 4CO2tBu

S (CH2) 4CO2tBu COCl (19)

Cl N HCOOH

NHCO

t.a. 1h Cl Cl R THF, t.a., 3h 97% 87% NN

26: R = NO2

Fe, NH4Cl 28 29 (Hapteno BLc5) EtOH-H2O; reflujo, 1h

27: R = NH2 90%

FIG. 3

Título del antisuero (x103)

Antisuero FIG. 4

0 1e-3 1e-2 1e-1 1e+0 1e+1 1e+2 1e+3 1e+4 [Boscalid] (nM)

FIG. 5