Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

DERIVADOS DE AZABICICLOOCTAN-3-ONA Y SU USO.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen:

Un compuesto seleccionado de **Fórmula** acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo; **Fórmula** ciclopentanocarboxilato de [2-

(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2- il]metilo; y **Fórmula** 2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metiI]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2- il}metilo; o una de sus sales farmaceuticamente aceptable.

Solicitante: APREA AB.

Nacionalidad solicitante: Suecia.

Dirección: NOBELS VAG 3 171 77 STOCKHOLM SUECIA.

Inventor/es: WESTMAN, JACOB, SELIVANOVA,GALINA, BYKOV,VLADIMIR, WIMAN,KLAS.

Fecha de Publicación de la Concesión: 3 de Enero de 2011.

Fecha Solicitud PCT: 22 de Marzo de 2005.

Fecha Concesión Europea: 29 de Septiembre de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: C07D453/02 (.que contienen sistemas cíclicos de quinuclidina sin otra condensación [2]), A61K31/439 (....formando parte el ciclo de un sistema cíclico puenteado, p.ej. quinuclidina (aza-8-biciclo[3.2.1]octanos 31/46) [7]).

Clasificación PCT: A61P35/00 (Agentes antineoplásicos [7]), C07D453/02 (.que contienen sistemas cíclicos de quinuclidina sin otra condensación [2]), A61K31/439 (....formando parte el ciclo de un sistema cíclico puenteado, p.ej. quinuclidina (aza-8-biciclo[3.2.1]octanos 31/46) [7]), C07D453/00 (Compuestos heterocíclicos que contienen sistemas cíclicos de quinuclidina o isoquinuclidina, p. ej. alcaloides de quinina [2]).

Clasificación antigua: A61P35/00 (Agentes antineoplásicos [7]), C07D453/02 (.que contienen sistemas cíclicos de quinuclidina sin otra condensación [2]), A61K31/439 (....formando parte el ciclo de un sistema cíclico puenteado, p.ej. quinuclidina (aza-8-biciclo[3.2.1]octanos 31/46) [7]), C07D453/00 (Compuestos heterocíclicos que contienen sistemas cíclicos de quinuclidina o isoquinuclidina, p. ej. alcaloides de quinina [2]).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

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Descripción:

Campo de la invención

La presente invención se refiere a derivados de azabiciclooctan-3-ona y al uso de los mismos en terapia. Más en particular, la presente invención se refiere a derivados de azabiciclooctan-3-ona para el tratamiento de trastornos y enfermedades tales como, por ejemplo, el cáncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades cardiacas.

Antecedentes de la invención

El objetivo más común de mutaciones en tumores es el gen p53. El hecho de que alrededor de la mitad de todos los tumores humanos lleven mutaciones en este gen es un testimonio consistente de su función crítica como supresor de tumores. p53 detiene el ciclo celular y/o provoca la apoptosis en respuesta a diferentes estímulos de estrés, incluyendo el daño al ADN, hipoxia y activación oncogénica (Ko y Prives, 1996; Sherr, 1998). Tras la activación, p53 inicia las respuestas biológicas dependientes de p53 mediante la transactivación transcripcional de genes objetivo específicos que llevan patrones de unión al ADN de p53. Además, la proteína p53 multifacética puede promover la apoptosis por represión de determinados genes que carecen de sitios de unión de p53 y mecanismos independientes de la transcripción también (Bennett et al., 1998; Gottlieb y Oren, 1998; Ko y Prives, 1996). El análisis de un gran número de genes p53 mutantes en tumores humanos, ha puesto de manifiesto una fuerte selección por mutaciones que inactivan la función de unión al ADN específica de p53; la mayoría de las mutaciones en tumores son mutaciones puntuales agrupadas en el dominio central de p53 (restos 94-292) que albergan la actividad de unión al ADN específica (Béroud y Soussi, 1998).

Tanto la detención del ciclo celular como la apoptosis inducidas por p53 podrían estar implicadas en la supresión de tumores mediados por p53. Aunque la detención del ciclo celular inducida por p53 podría en principio invertirse de diferentes formas, sería ventajoso que la muerte celular inducida por p53 fuera irreversible. De hecho, hay pruebas de modelos animales in vivo (Symonds et al., 1994) y de tumores humanos (Bardeesy et al., 1995) que indican que la apoptosis dependiente de p53 tiene una función principal en la eliminación de tumores emergentes, en particular en respuesta a la señalización oncogénica. Además, la capacidad de p53 para inducir la apoptosis a menudo determina la eficacia de la terapia del cáncer (Lowe et al., 1994). Teniendo en cuenta el hecho de que más de 50% de los tumores humanos llevan las mutaciones de p53, parece muy conveniente restablecer la función de supresión del crecimiento tumoral mediado por p53 genéticamente intacto. La ventaja de este enfoque es que permitirá la eliminación selectiva de células tumorales que llevan el p53 mutante. Las células tumorales son particularmente sensibles a la reactivación de p53, supuestamente por dos razones principales. Primero, las células tumorales están sensibilizadas frente a la apoptosis debido a la activación de oncogenes (revisado en Evan y Littlewood; 1998). Segundo, las proteínas p53 mutantes tienden a acumularse con niveles altos en células tumorales. Por lo tanto, la restauración de la función natural de p53 mutante abundante y supuestamente “activado”, provocaría una respuesta apoptótica masiva en las células tumorales ya sensibilizadas, mientras que las células normales que expresan niveles bajos o indetectables de p53 no deberían afectarse. La viabilidad de la reactivación de p53 como una estrategia anticancerígena está apoyada por el hecho de que una amplia variedad de proteínas p53 mutantes son susceptibles de reactivación. Una estrategia terapéutica basada en el rescate de la apoptosis inducida por p53 debería, por lo tanto, ser poderosa y ampliamente aplicable.

Se puede mostrar que, en general, el mal funcionamiento de la ruta de p53 está implicado en una serie de enfermedades, tales como las enumeradas antes en esta memoria. Realmente, además de enfermedades hiperproliferativas, tales como el cáncer, algunos autores han mostrado la implicación del funcionamiento deficiente de p53 en una serie de otros estados patológicos, p. ej., enfermedades autoinmunes y enfermedades cardiacas.

Así pues, en un artículo de Mountz et al. (1994), se expone que las enfermedades autoinmunes humanas comparten la característica común de un desequilibrio entre la producción y la destrucción de diferentes tipos de células incluyendo linfocitos (LES), células sinoviales (AR) y fibroblastos (escleroderma). Los oncogenes, incluyendo bcl-2, p-53 y myc, que regulan la apoptosis, también son expresados de forma anómala. De acuerdo con los autores, las terapias específicas que inducen apoptosis sin producir efectos secundarios deberían mejorar el tratamiento de la enfermedad autoinmune.

Bonafe M. et al. (2004) presentan datos que sugieren que el polimorfismo del codón 72 de p53 contribuye a una variabilidad genéticamente determinada en la susceptibilidad apoptótica entre la gente mayor, lo cual tiene una función potencialmente relevante en el contexto de una afección patológica relacionada con la edad, tal como la isquemia miocárdica.

Okuda et al. (2003) presentan resultados que sugieren que p53 puede estar implicado en el proceso regulador de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) a través del control de la producción de citoquinas y/o la eliminación apoptótica de células inflamatorias. La EAE como modelo para las enfermedades inflamatorias autoinmunes del sistema nervioso central (SNC) es un modelo ampliamente usado para la enfermedad humana esclerosis múltiple.

Considerados juntos, estos descubrimientos sugieren que la restauración farmacológica de la función de p53 sería beneficiosa en una serie de trastornos y enfermedades.

Los autores de la presente invención han encontrado que el compuesto PRIMA-1 (es decir 2,2-bis(hidroximetil)-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona) (descrito en el documento WO 02/24692), es capaz de inducir la apoptosis de células que llevan p53 mutante. Más tarde también encontraron algunos análogos de Prima-1 que mostraron resultados similares (descritos en el documento WO 03/070250). Además, el documento 04/084893 describe el uso de algunos derivados de azabiciclooctan-3-ona,

p. ej., PRIMA-1, para preparar un medicamento para usar en el tratamiento del melanoma maligno y/o una afección patológica que implica la angiogénesis indeseada. No obstante, sigue existiendo una necesidad general de compuestos que tengan actividad en el tratamiento de trastornos y enfermedades relacionadas con el mal funcionamiento de p53. Preferiblemente, dichos compuestos deben tener propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas mejoradas. Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar dichos compuestos.

Nielsen et al., J. Org. Chem. 31, 1053-1057 (1996), describen el compuesto 2(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona, pero no se menciona su uso médico en este artículo.

Los autores de la presente invención han encontrado sorprendentemente varios derivados de azabiciclooctan-3-ona que presentan una actividad alta en el tratamiento de trastornos y enfermedades relacionadas con el mal funcionamiento de p53. No solo presentan una alta potencia, sino que también se cree que tienen propiedades ADME muy favorables debido a su valor de cLogP más alto, lo que permitirá una absorción celular alta. Varios de los análogos se pueden considerar también como profármacos de Prima-1.

Los derivados de azabiciclooctan-3-ona de la invención se consideran potencialmente útiles en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas, enfermedades autoinmunes y enfermedades cardiacas, y en especial en el tratamiento de trastornos en los que puede estar implicado el mal funcionamiento de la ruta de p53, y este descubrimiento forma la base de la presente invención. Además, se cree que los compuestos en la presente invención tienen efectos adicionales que son positivos para el tratamiento de los trastornos mencionados antes, como se describirá con más detalle a continuación en el presente documento.

Las 3-quinuclidinonas 2-sustituidas se han descrito previamente en el contexto biológico pero no en las áreas terapéuticas mencionadas antes. Así pues, las 2-[N'-(Oalcoxifenil)piperazinometil]-3-quinuclidinonas (Biel et al., patente de EE.UU. nº 3.598.825) se han descrito como depresores del sistema nervioso y las 2-metilen-3quinuclidinonas sustituidas con amina se han descrito como agentes antibacterianos (Elkin et al. patente de EE.UU. nº 3.726.877) y agentes antidepresivos (Biel et al.,

10 patente de EE.UU. nº3.462.422). Biel et al., en la patente de EE.UU. nº 3.384.641, describen un método en el que se hace reaccionar la 2-metilen-3-quinuclidinona con aminas para formar productos intermedios que tras calentamiento podían liberar las aminas. Por lo tanto, los productos intermedios se usan para la purificación de aminas. Sumario de la invención De acuerdo con un aspecto, la presente invención se refiere al uso de un compuesto seleccionado de

**(Ver fórmula)**

2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona;

**(Ver fórmula)**

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

**(Ver fórmula)**

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il]metilo; y

**(Ver fórmula)**

2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metiI]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il}metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptable,

5 para preparar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedades hiperproliferativas, enfermedades autoinmunes y enfermedades cardiacas.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de compuestos de la invención o sus sales farmacéuticamente aceptables, para el 10 tratamiento de enfermedades asociadas con p53 mutante o, más en general, un mal

funcionamiento de la ruta de señalización de p53.

De acuerdo con otro aspecto, la invención proporciona los compuestos mencionados antes para usar en el tratamiento de una enfermedad seleccionada de enfermedades hiperproliferativas, enfermedades autoinmunes y enfermedades cardiacas. De acuerdo con un aspecto adicional, la invención se refiere a un compuesto seleccionado de

**(Ver fórmula)**

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

**(Ver fórmula)**

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il]metilo; y

**(Ver fórmula)**

2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metiI]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il}metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con otro aspecto más, la invención proporciona nuevas

composiciones farmacéuticas que comprenden dichos compuestos o sus sales. Cualesquiera otros aspectos son como se definen en las reivindicaciones.

Breve descripción del dibujo

La figura 1 representa los resultados del análisis por FACS de un compuesto de la invención.

Descripción detallada de la invención

Como se usa en esta memoria, la expresión “alquilo inferior” salvo que se indique lo contrario, significa un radical hidrocarbilo no ramificado o ramificado, cíclico, saturado o insaturado (alquenilo o alquinilo). Cuando es cíclico, el grupo alquilo es preferiblemente C3 a C12, más preferiblemente C5 a C10, lo más preferiblemente C5C7. Cuando es acíclico, el grupo alquilo es preferiblemente C1 a C10, más preferiblemente C1 a C6, más preferiblemente metilo, etilo, propilo (n-propilo, isopropilo), butilo (ramificado o no ramificado) o pentilo, lo más preferiblemente metilo.

Como se usa en esta memoria, el término “arilo” significa un grupo aromático, tal como fenilo o naftilo. Como se usa en el esta memoria, la expresión “grupos funcionales” significa, en el caso de los no protegidos: hidroxi, tiolo, función amino, ácido carboxílico, y en el caso de los protegidos: alcoxi inferior, N-, O-, S-acetilo, éster de ácido carboxílico.

Como se usa en esta memoria, el término “heteroarilo” significa un grupo heteroaromático mono, bi o tricíclico que contiene uno o más heteroátomos seleccionados preferiblemente de N, O y S, tales como piridilo, pirrolilo, quinolinilo, furanilo, tienilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, tiazolilo, oxazolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, imidazolilo, pirimidinilo, indolilo, pirazinilo, indazolilo, pirimidinilo, tiofenetilo, piranilo, carbazolilo, acridinilo, quinolinilo, bencimidazolilo, benzotiazolilo, purinilo, cinolinilo y pteridinilo.

Como se usa en esta memoria, la expresión “heterociclo no aromático” significa un grupo cíclico no aromático que contiene uno o más heteroátomos, preferiblemente seleccionados de N, O y S, tales como pirrolidinilo, piperidilo, piperazinilo, morfolinilo, tetrahidrofuranilo o monosacárido.

Como se usa esta memoria, el término “halógeno” significa flúor, cloro, bromo o yodo.

Como se usa esta memoria, y salvo que se especifique lo contrario, el término “sustituido” significa que los grupos a los que hace referencia están sustituidos con al menos un grupo funcional, tal como hidroxilo, amina, sulfuro, sililo, ácido carboxílico, halógeno, arilo, etc.

Los compuestos de la invención serán útiles para tratar diferentes enfermedades tales como enfermedades hiperproliferativas, p. ej., cáncer, enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide y el síndrome de Sjorgen, y enfermedades cardiacas tales como la cardiomiopatía idiopática hereditaria. El tratamiento puede ser preventivo, paliativo o curativo.

Los ejemplos de sales de adición farmacéuticamente aceptables para usar en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen las derivadas de ácidos minerales, tales como ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, tales como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico. Los excipientes farmacéuticamente aceptables descritos en esta memoria, por ejemplo, vehículos, adyuvantes, soportes o diluyentes, son bien conocidos para el experto en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. El vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser uno que sea químicamente inerte para los compuestos activos y no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso. Se encuentran formulaciones farmacéuticas, p. ej., en “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 19ª edición, Mack Printing Company, Eastin, Pennsylvania (1995).

La composición de acuerdo con la invención se puede preparar por cualquier vía de administración, p. ej., oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular o intraperitoneal. La naturaleza precisa del vehículo u otro material dependerá de la vía de administración. Para una administración parenteral, se usa una disolución acuosa aceptable por vía parenteral, que está exenta de pirógenos y tiene el pH, isotonicidad y estabilidad requeridos. Los expertos en la materia pueden preparar disoluciones adecuadas y se describen numerosos métodos en la bibliografía. Se encuentra también una breve revisión de procedimientos de suministro de fármacos, p. ej., en Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

La dosis administrada a un mamífero, en particular a un ser humano, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para producir una respuesta terapéutica en el mamífero a lo largo de un periodo de tiempo razonable. Un experto en la técnica reconocerá que la dosificación dependerá de una variedad de factores incluyendo la potencia del compuesto específico, la edad, afección y peso corporal del paciente, así como de la estadio/gravedad de la enfermedad. La dosis también estará determinada por la vía (forma de administración), tiempo y frecuencia de administración. En el caso de administración oral, la dosificación puede variar de

10 aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg por día de un compuesto de la invención o la correspondiente cantidad de una de sus sales farmacéuticamente aceptable. Los compuestos de la presente invención se pueden usar o administrar en combinación con uno o más fármacos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas. Los componentes pueden estar en la misma formulación o en formulaciones separadas para la administración simultánea o secuencial. Los compuestos de la presente invención también se pueden usar o administrar en combinación con otro tratamiento tal como la radiación para el tratamiento del cáncer.

20 En su estudio de los compuestos de la invención, los presentes autores encontraron un metabolito común de muchos de los compuestos de la invención, en concreto la metilen-quinuclidinona. Los autores de la invención han mostrado que este metabolito puede formar conjugados con el glutatión (GSH) (Esquema de reacción 1).

**(Ver fórmula)**

25 Esquema de reacción 1 Sin querer estar ligados por ninguna teoría, los autores de la invención creen que los compuestos de la presente invención pueden potenciar de forma sinérgica el efecto de compuestos farmacéuticamente activos adicionales que in vivo son metabolizados por una ruta que comprende la reacción con glutatión. La explicación sería que los compuestos de la invención aumentan la potencia del compuesto farmacéuticamente activo adicional al reducir la cantidad de glutatión intracelular. Los ejemplos de dichos compuestos farmacéuticamente activos adicionales son adriamicina, melfalán, cisplatino.

En el siguiente esquema de reacción 2 se representan ejemplos de síntesis de algunos compuestos azabiciclooctan-3-ona:

**(Ver fórmula)**

5 Esquema de reacción 2

De acuerdo con el esquema de reacción 2, se usa el hidrocloruro de quinuclidinona (1) como material de partida para la síntesis de los productos intermedios (2), (7) y (8). La 2,2-bis-hidroximetil-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (2) se forma por tratamiento del compuesto (1) con un exceso de formaldehído y carbonato potásico de acuerdo con los métodos descritos por Nielsen et al. (1966). La 2hidroximetil-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (7) se forma por tratamiento del hidrocloruro de quinuclidinona con 1 equivalente de formaldehído y carbonato potásico. La 2metilen-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (8) se forma a partir del compuesto 7 por un procedimiento de deshidratación. Estos métodos también son descritos por Nielsen et al. (1966). El compuesto 8 también está disponible en el comercio en forma de su sal de hidrocloruro.

La 2,2-bis-hidroximetil-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (2) forma ésteres por tratamiento con cloruros de ácido y una base adecuada tal como trietilamina, piridina o DMAP en un disolvente orgánico, siguiendo protocolos habituales para la acilación. La esterificación también se puede llevar a cabo usando ácidos carboxílicos y reactivos de acoplamiento tales como DCC y HOBT. También se pueden formar carbonatos y carbamatos por métodos conocidos por el experto en la técnica. Usando solo 1 equivalente del reactivo, se pueden obtener los derivados monoacoplados. El derivado monoacilado y el correspondiente monocarbonato y monocarbamato se pueden separar de los derivados disustituidos por cromatografía de líquidos.

El compuesto 15 y sus análogos se pueden formar por reacción entre la 2metilen-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (8) y aminas en disolventes orgánicos y a temperatura elevada, de la misma forma descrita por Singh et al. (1969) o por Elkin et al. (patente de EE.UU. nº3.726.877).

El compuesto 6 y sus análogos se pueden formar a partir de la 2,2bishidroximetil-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (2) por alquilación, sea con haluros de alquilo usando un método como describen Schieweck et al. (2001) o usando un ortoéster como describen Sampath Kumar et al. (1997).

El compuesto 10 también se puede formar a partir del compuesto 8 o a partir del compuesto 1, por un método como describen Toender et al. (2000).

El compuesto 14 se puede formar haciendo reaccionar el compuesto 8 con alcoholes en condiciones básicas como describen Nielsen et al. (1966) o por alquilación del compuesto 7 con haluros de alquilo de acuerdo con Schieweck et al. (2001).

La síntesis de los compuestos 11, 12, 13 a partir del compuesto 7 se puede llevar a cabo por procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica.

Ejemplos Ejemplo 1. Síntesis de 2,2-bis-hidroximetil-1-azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona

(2) (producto intermedio)

La reacción del hidrocloruro de quinuclidinona (1) (disponible en el comercio) (16,9 g, 0,1 mol) con formalina (al 37% en p/p, 150 ml, 2,0 mol) en presencia de carbonato potásico (15,9 g, 0,11 mol) consumió el material de partida después de 1 h a 52ºC. A la conversión le siguió la CL-EM. La mezcla de reacción con base acuosa se extrajo con cloruro de metileno (4x80 ml) y las fases orgánicas combinadas se secaron sobre MgSO4. El disolvente se separó por evaporación y se añadió heptano (500 ml) al residuo. Después de calentar durante 1 hora, se descargó el extracto de heptano caliente. Se añadió benceno (400 ml) al residuo seguido de calentamiento durante 8 horas. La mezcla resultante se filtró del polímero que se había formado durante el calentamiento hasta transparencia y la disolución transparente se evaporó hasta sequedad. El residuo se extrajo con heptano hirviendo (300 ml).

5 Después de decantar el heptano, se añadió benceno hirviendo (400 ml) al residuo. La filtración hasta transparencia y enfriamiento (a 6ºC) seguido de aislamiento por filtración del precipitado sólido, dio 5,1 g de 2,2-bis-hidroximetil-1azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona (2) (p. f.: 136-138ºC). Se aisló una segunda cosecha de las aguas madres combinadas y el material de la extracción con heptano después de

10 precipitación en benceno, dando 2,9 g del producto. En total 37% de rendimiento. Ejemplo 2. Métodos para la O-acilación de la 2,2-bis-hidroximetil-1azabiciclo[2.2.2]octan-3-ona

2.1. Éster de 2-isobutiriloximetil-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]octilmetilo del ácido isobutírico

**(Ver fórmula)**

15 A una disolución agitada del bismetilol de la 3-qunuclidinona (0,25 g, 1,35 mmol) en diclorometano seco (15 ml), se añadieron 4-dimetilaminopiridina (33 mg, 0,27 mmol) y trietilamina (0,75 g, 7,4 mmol) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC, se añadió lentamente cloruro de isobutirilo (0,31 g, 0,9 mmol) 20 a 0ºC y se continuó agitando durante 18-20 h a temperatura ambiente (26-27ºC). La mezcla de reacción se inactivó con agua fría (25 ml), se extrajo con diclorometano (3 x 50 ml), las capas orgánicas se lavaron con disolución de NaHCO3 al 10%, salmuera y se secaron sobre sulfato sódico, se filtraron y se concentraron para dar el producto bruto. El producto bruto se purificó en forma de un líquido viscoso (225 mg, 52%) por 25 cromatografía en columna en gel de sílice, usando metanol: cloroformo 0,8:99,2 como eluyente.

Ensayos biológicos

La línea celular de carcinoma de pulmón H1299-His175 humana que lleva una construcción de p53 mutante regulada por tetraciclina, se usó para estudiar los efectos 30 antiproliferativos y de inducción de apoptosis de los presentes compuestos.

Protocolo del ensayo WST-1 Cultivo celular

Las células se cultivaron en medio Dulbecco modificado por Iscove complementado con suero bovino fetal al 10%, L-glutamina y gentamicina.

Sembrado de las células

Las células se cogieron para el experimento cuando estaban aproximadamente al 75-100% de confluencia. Después de tripsinización, las células se diluyeron hasta una concentración celular de 30.000 células/ml en el medio de cultivo. Las células se pusieron en placas de 96 pocillos con fondo plano con 100 µl/pocillo (3000 células/pocillo). La última columna de la placa se llenó con medio solo, 100 µl/pocillo, para usar como blanco. Después las células se incubaron durante la noche en el incubador celular.

Tratamiento de las células

Después de aproximadamente 16-24 horas de incubación en placas de 96 pocillos, las células se trataron con los diferentes compuestos. Los fármacos se disolvieron en DMSO a una concentración de 0,1 M y después se diluyeron más a las concentraciones deseadas en PBS. Después se añadieron 5 µl de cada compuesto a cada pocillo. Normalmente se dejó una columna de células sin tratar como control. Las placas de células se volvieron a poner en el incubador de células.

Adición del reactivo de WST-1

Después de 96 horas en el incubador de células, se añadió el reactivo de WST1 a las placas. Se añadieron 10 µl de reactivo a cada pocillo de las placas (incluyendo las células no tratadas y los pocillos con medio solo). Se midió la absorbancia de las muestras en un espectrofotómetro a 450 nm después de aproximadamente 1-2 horas de incubación en el incubador de células. Antes de leer las placas, se comprobaron visualmente comparando el color en los pocillos con el medio solo y el color en los pocillos con células no tratadas. El medio debería permanecer rojo-rosa, mientras que las células no tratadas deberían cambiar de rojo-rosa a naranja.

Análisis de WST-1

Se calculó la media de los valores de absorbancia para las células no tratadas para cada placa. El % de supresión de crecimiento se calculó como:

100 – ((Absmuestra/Abscélulas no tratadas) x 100).

Los resultados del análisis de WST-1 se expresan como valores de CI50, es decir, la concentración que suprime el crecimiento de al menos 50% de las células. Los valores de CI50 de los compuestos de acuerdo con la invención, así como de un compuesto de referencia que no es de acuerdo con la invención, se muestran en la Tabla 1. En aquellos casos en los que el compuesto de acuerdo con la invención se ha ensayado en forma de una sal de adición de ácido, se muestra el correspondiente ácido en la Tabla 1.

Tabla 1. Ejemplos de compuestos ensayados y valores de CI50 del ensayo WST-1

**(Ver fórmula)**

**(Ver fórmula)**

aCompuesto no de acuerdo con la invención. 5 Análisis por FACS

Las células H1299-His175 se cultivaron en placas de 6 pocillos con una densidad inicial de 10.000 células/cm2, se cultivaron durante la noche y se trataron con compuestos de la invención. Después de 24 horas de tratamiento, se recogió el medio que contenía las células que flotaban y se mezcló con las células adherentes recogidas. Las células se lavaron una vez en PBS y se volvieron a suspender en 200 µl de PBS. Se añadió etanol al 70% enfriado con hielo mientras se mezclaba con flujo vortical, y las células se almacenaron a -20ºC durante 24 horas. Después, se recogieron las células fijadas por centrifugación, se lavaron una vez en PBS y se incubaron en 100 µl de tampón de tinción con PI (PI 5 µg/ml y RNasaA 250 µg/ml)

15 durante 30 minutos a 37ºC. Las muestras se ensayaron usando un citómetro de flujo FACSCalibur y se cuantificó el pico sub-Go/G1 usando el software CELLQuest. Los resultados obtenidos con un compuesto de acuerdo con la invención se muestran en la figura. Referencias Bardeesy et al., Cancer Res. 55, 215-9 (1995). Bennett, M. et al., Science 282, 290-293 (1998). Béroud, C. & Soussi, T. , Nucl. Acids Res. 26, 200-204 (1998). Biel et al., patente de EE.UU. nº3.384.641

- 15 -Biel et al., patente de EE.UU. nº3.462.442 Biel et al., patente de EE.UU. nº3.598.825 Evan, G. & Littlewood, T., Science, 281, 1317-1322 (1998). Elkin et al., patente de EE.UU. nº3.726.877 Gottlieb and Oren, Semin. Cancer Biol. 8, 359-68 (1998). Ko, LJ. & Prives, C., Genes Dev. 10, 1054-1072 (1996). Lowe et al., 1994 Science 266, 807-10 (1994). Morgan et al., J. Med. Chem. 30, 2559-2569 (1987). Nielsen et al., J. Org. Chem. 31, 1053-1057(1966). Sakamuri et al., Tetrahedron Lett. 41, 9949-9952 (2000). Sampath Kumar et al., Tetrahedron Lett. 38, 3619-3622 (1997). Schieweck et al., J. Chem, Soc., Perkin Trans. 1, 3409-3414 (2001). Sherr, C.J., Genes Dev., 12, 2984-2991 (1998). Singh et al., Med. Chem. 12, 524-526 (1969). Symonds et al., Cell 78, 703-711 (1994). Toender et al., Tetrahedron. 56, 1139-1146 (2000). Documento WO 02/24692 Documento WO 03/070250




Reivindicaciones:

1. Un compuesto seleccionado de

**(Ver fórmula)**

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

**(Ver fórmula)**

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il]metilo; y

**(Ver fórmula)**

10 2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metiI]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il}metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptable.

2. Un compuesto seleccionado de

**(Ver fórmula)**

2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona;

**(Ver fórmula)**

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

**(Ver fórmula)**

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il]metilo;

**(Ver fórmula)**

5 2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metiI]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il}metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, para usar como un medicamento.

3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, que 15 comprende al menos un compuesto farmacéuticamente activo adicional.

5. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el al menos un compuesto farmacéuticamente activo adicional es un compuesto útil en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas.

6. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5, en la que el compuesto farmacéuticamente activo adicional se selecciona de adriamicina, melfalán y cisplatino.

25 7. Un compuesto seleccionado de

**(Ver fórmula)**

2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona;

**(Ver fórmula)**

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

**(Ver fórmula)**

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il]metilo;

**(Ver fórmula)**

2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metiI]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-210 il}metilo;

o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, para usar en el tratamiento de un trastorno seleccionado de enfermedades hiperproliferativas, enfermedades autoinmunes y enfermedades cardiacas.

8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el trastorno es cáncer.

9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 7 o reivindicación 8, para usar

en combinación con uno o más fármacos adicionales útiles en el tratamiento de 20 enfermedades hiperproliferativas.

10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 9, en la que el uno o más fármacos adicionales útiles en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas se seleccionan de adriamicina, melfalán y cisplatino.

11. El compuesto de acuerdo con la reivindicación 8, para usar en combinación con tratamiento de radiación.

12. El uso de un compuesto seleccionado de

**(Ver fórmula)**

2-(hidroximetil)-2-(metoximetil)quinuclidin-3-ona;

**(Ver fórmula)**

acetato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2-il]metilo;

**(Ver fórmula)**

ciclopentanocarboxilato de [2-(metoximetil)-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il]metilo; y

**(Ver fórmula)**

2-metilpropanoato de {2-[(isobutiriloxi)metiI]-3-oxo-1-azabiciclo[2.2.2]oct-2il}metilo; y una de sus sales farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento de un trastorno seleccionado de enfermedades hiperproliferativas,

20 enfermedades autoinmunes y enfermedades cardiacas.

13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que el trastorno es cáncer.






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