Procesos de depuración para la obtención de cps de Estreptococos.

Un método para purificar un polisacárido capsular a partir del Estreptococo agalactiae que se compone de una fase de filtración en la que se utiliza un filtro adherente

, donde el método no incluye una fase de tratamiento con detergente catiónico para precipitar el polisacárido capsular, seguida de una fase de resolubilización del polisacárido capsular.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2008/003729.

Solicitante: NOVARTIS AG.

Nacionalidad solicitante: Suiza.

Dirección: LICHTSTRASSE 35 4056 BASEL SUIZA.

Inventor/es: NORELLI, FRANCESCO, COSTANTINO, PAOLO, OLIVIERI, ROBERTO, BERTI,Francesco, CICALA,CONCETTA MARIA, BAZZOCCHI,GIULIA, FONTANI,SILVIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/04 (Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/20 (Bacterias; Sus medios de cultivo)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales que contienen antígenos... > A61K39/04 (Mycobacterium, p. ej. Mycobacterium tuberculosis)

PDF original: ES-2535080_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procesos de depuración para la obtención de cps de Estreptococos.

Ã?MBITO DE LA INVENCIÓN 5

Esta invención se encuentra en el ámbito de los cultivos bacterianos y se refiere, preferentemente, a los novedosos métodos de purificación para mejorar la producción de polisacáridos capsulares bacterianos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 10

Los polisacáridos capsulares (cps) son importantes inmunógenos que se hallan en la superficie de la bacteria implicada en varias enfermedades bacterianas. Esta propiedad les ha llevado a ser un importante componente en el diseño de las vacunas. Se ha demostrado su utilidad para desencadenar respuestas inmunes, especialmente cuando están vinculados a proteínas portadoras (ref. 1) . 15

Habitualmente, los polisacáridos capsulares se producen utilizando cultivos discontinuos en medios complejos (Estreptococo del grupo B, Estafilococo aureus, Estreptococo pneumoniae y Hemófilus influenzae) y alimentan los cultivos discontinuos (H. influenzae) o continuos (Estreptococo del grupo B y Lactobacilo rhamnosus) , (refs. 2-7) . La mayoría de los estudios utilizaron sistemas de cultivo discontinuos en los cuales la tasa de 20 crecimiento, los niveles de nutrientes y las concentraciones metabólicas cambian durante la incubación. En tales sistemas, la alteración de un factor se traduce en cambios en otros factores asociados con el crecimiento que pueden afectar, de forma impredecible, a los rendimientos. Los cultivos continuos permiten al investigador separar y definir los parámetros que son interdependientes durante el crecimiento del cultivo discontinuo como, por ejemplo, la tasa de crecimiento, las concentraciones de nutrientes y productos, así como la densidad celular. Durante el cultivo 25 continuo, se añade el medio fresco al cultivo a una tasa fijada y se extraen tanto las células como el medio a una tasa que mantiene un volumen constante de cultivo. Se prefirió el cultivo continuo para la producción de polisacáridos capsulares cuando se demostró que dependía de las condiciones (ref. 8) .

Para el Estreptococo del grupo B (S. agalactiae, GBS) , la tasa de crecimiento celular se presentó como el 30 principal factor que regula la producción de polisacáridos capsulares. Además, se mostró la producción del tipo III de polisacáridos capsulares para que se produjeran independientemente del nutriente limitante del crecimiento. Los mayores rendimientos específicos (hasta, aproximadamente, 90 mg/g CDW) se obtuvieron cuando las células soportaron un tiempo de duplicación (td) de masa más rápido (0, 8, 1, 4 ó 1, 6 h) en lugar de un tiempo más lento (td= 2, 6 u 11 h) (refs. 8-10) . 35

Existe la necesidad de simplificar los protocolos de purificación que pueden utilizarse en la producción a gran escala de polisacáridos capsulares postfermentivos. El enfoque se pone de manifiesto en el WO 2007/052168, basado en el método divulgado en el WO 2006/082527, el cual incluye extracción, precipitación alcohólica, diafiltración, tratamiento con detergente catiónico y resolubilización. Este procedimiento es altamente eficiente y, 40 habitualmente, brinda una preparación para los polisacáridos capsulares que es pura en, aproximadamente, un 80%. Sin embargo, la fase del tratamiento con detergente catiónico se traduce en la precipitación del polisacárido capsular. La subsiguiente separación del precipitado a partir del sobrenadante (p.ej., mediante centrifugación) así como la resolubilización son laboriosas y pueden traducirse en la pérdida de polisacáridos capsulares, reduciéndose así su rendimiento. La eficiencia del tratamiento con detergente catiónico puede depender también de la pureza 45 inicial del polisacárido capsular. Cuanto menor sea la pureza inicial del polisacárido capsular, menos eficiente puede ser el tratamiento con detergente catiónico y más restrictivo su rendimiento. En consecuencia, existe la necesidad de simplificar el procedimiento de purificación, lo cual producirá mayores niveles de pureza con un menor número de complicadas y/o costosas fases de purificación. Existe también la necesidad de un procedimiento de purificación que proporcione un buen rendimiento del polisacárido capsular, cualquiera que sea la pureza inicial del polisacárido. 50

RESUMEN DE LAS MATERIALIZACIONES DIVULGADAS

La invención proporciona un método para purificar un polisacárido capsular a partir del Estreptococo agalactiae y comprende una fase de filtración utilizando para ello un filtro adherente, donde el método no incluye la 55 fase del tratamiento con detergente catiónico para precipitar el polisacárido capsular, seguida de una fase de resolubilización del polisacárido capsular. El filtro adherente es uno de los que une los contaminantes que pueden estar presentes en el polisacárido capsular , p.ej., las proteínas y/o los ácidos nucleicos, mientras que permite que el polisacárido capsular pase a través del filtro. Los inventores han descubierto que los filtros adherentes pueden utilizarse para purificar los polisacáridos capsulares en lugar del tratamiento con detergente catiónico descrito en el 60 WO 2007/052168 y en el WO 2006/082527. El uso de un filtro adherente hace que sea inútil aplicar un detergente catiónico, lo que significa que no hay precipitación del polisacárido capsular en esta etapa del método. Esto, a su vez, hace que sea inútil separar el precipitado del sobrenadante, simplificándose así el método y previniendo cualquier pérdida de polisacárido capsular que pueda producirse durante esta separación. El uso de un filtro adherente puede, en consecuencia, mejorar el rendimiento del método de purificación. La eficiencia del filtro 65 adherente también depende menos de la pureza inicial del polisacárido capsular.

El experto es capaz de identificar los filtros adherentes adecuados para utilizarlos en este método. Habitualmente, el principal contaminante en el polisacárido capsular es la proteína y el filtro adherente es, en consecuencia, un filtro de proteína adherente. Los inventores han descubierto que los filtros de carbono son particularmente adecuados. Se componen, habitualmente, de carbono activado (p. ej., como el lecho de carbono granular o como el bloque de carbono prensado o extrudido) que actúa como filtro para la purificación de la muestra. 5

El experto es capaz de identificar los filtros de carbono adecuados. Habitualmente y para su uso en la presente invención, un filtro de carbono contiene carbono activado inmovilizado en una matriz. La matriz puede ser cualquier filtro poroso en un medio permeable para la muestra. La matriz puede estar compuesta de un material de apoyo y/o un material aglutinante. El material de apoyo puede ser un polímero sintético o un polímero de origen 10 natural. Los polímeros sintéticos adecuados pueden contener poliestireno, poliacrilamida y polimetacrilato mientras que los polímeros de origen natural pueden contener celulosa, polisacárido, dextrano y agarosa. Habitualmente, el material de apoyo polimérico presenta la forma de una red de fibra para proporcionar rigidez mecánica. El material aglutinante puede ser una resina. La matriz puede tener la forma de una lámina de membrana. Habitualmente, el carbono activado e inmovilizado en la matriz puede presentar la forma de un cartucho. Un cartucho es un organismo 15 independiente que contiene carbono activado en polvo, inmovilizado en la matriz y preparado con la forma de una lámina de membrana. La lámina de membrana puede capturarse en un soporte de plástico permeable para formar un disco. Opcionalmente, la lámina de membrana puede estar enrollada en espiral. Para incrementar el área de superficie del filtro, se pueden apilar varios discos, uno encima de otro. En particular, los discos apilados uno encima de otro tienen... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

Reivindicaciones

1. Un método para purificar un polisacárido capsular a partir del Estreptococo agalactiae que se compone de una fase de filtración en la que se utiliza un filtro adherente, donde el método no incluye una fase de tratamiento con detergente catiónico para precipitar el polisacárido capsular, seguida de una fase de resolubilización del 5 polisacárido capsular.

2. El método de la reivindicación 1, donde el filtro adherente es un filtro adherente de proteína.

3. El método de la reivindicación 1, donde el filtro adherente es un filtro de carbono. 10

4. El método de la reivindicación 3, donde el filtro de carbono contiene carbono activado e inmovilizado en una matriz.

5. El método de cualquiera de lasa reivindicaciones 1-4, donde la fase de filtración en la que se utiliza un filtro 15 adherente viene precedida por las siguientes fases:

i) precipitación alcohólica de las proteínas contaminantes y/o los ácidos nucleicos y

ii) diafiltración.

6. El método de la reivindicación 5, donde la diafiltración es una diafiltración de flujo tangencial.

7. El método de la reivindicación 6, donde se realizan dos ciclos de diafiltración de flujo tangencial y el material retenido del primer ciclo de diafiltración se trata con una solución de acetato ácido acético/sodio entre el primer y el segundo ciclo. 25

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la fase de filtración en la que se utiliza un filtro adherente viene seguida por las siguientes fases:

iv) Re-N-acetilación, 30

v) Diafiltración.

9. El método de la reivindicación 8, donde la diafiltración es una diafiltración de flujo tangencial.

10. El método de la reivindicación 9, donde se realizan dos ciclos de diafiltración de flujo tangencial y donde el 35 material retenido del primer ciclo de diafiltración se trata con una solución de acetato ácido acético/sodio entre el primer y el segundo ciclo.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 donde el Estreptococo agalactiae se selecciona a partir de los serotipos 1a, 1b, 3, 4 y 5. 40

12. El método de la reivindicación 11, donde el Estreptococo agalactiae se selecciona a partir de las cepas 090, 7357, H36b, DK21, M781, 2603 y CJB111.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, donde la filtración en la que se utiliza un filtro adherente 45 viene seguida por otra filtración en la que se utiliza un filtro de 0.45/0.2 mm.

14. Un método para conjugar un polisacárido capsular a partir del Estreptococo agalactiae, con una proteína portadora, donde el método se compone de:

a) el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, seguido de

b) conjugación del sacárido con una proteína portadora.

15. El método de la reivindicación 14, donde la proteína portadora es el toxoide de difteria, el toxoide del tétano o el CRM 197, mutante de la toxina de la difteria. 55

16. El método de las reivindicaciones 14 ó 15, donde el conjugado se obtiene mediante la oxidación del polisacárido seguida de una aminación reductora con la proteína.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, donde el conjugado tiene una proporción de sacárido 60 proteína (p/p) de entre 1, 5 y 5, 1.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-17 que se compone, adicionalmente, de la fase de mezcla de los conjugados individuales preparados a partir de uno o más de los Estreptococos del Grupo B de los serogrupos Ia, Ib, o II, I para proporcionar un preparado polivalente. 65

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-18 que se compone, adicionalmente, de la fase de mezcla de los conjugados individuales para proporcionar un preparado bivalente, trivalente, tetravalente, pentavalente, hexavalente, heptavalente o undecavalente.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 14-19, donde se combina el conjugado con un portador 5 farmacéuticamente aceptable.