Método para producción de polipéptidos.

Método para producción de un polipéptido amidado C-terminal en el cual el método comprende los pasos siguientes

a) cultivo de una cepa de levadura que tiene un gen KEX1 no-funcional y que comprende una secuencia de DNA que codifica un polipéptido con un Gly C-terminal en condiciones para expresión del polipéptido en la cepa de levadura

, b) α-amidación in vitro del polipéptido expresado del paso a) o directamente en la célula de producción si la célula tiene la maquinaria necesaria para α-amidación in vivo y c) aislamiento y purificación del péptido amidado en el terminal C.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2010/068178.

Solicitante: NOVO NORDISK A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: Novo Allé 2880 Bagsværd DINAMARCA.

Inventor/es: ANDERSEN, ASSER SLOTH, NØRGAARD,PER, LAUTRUP-LARSEN,INGER.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/47 (de mamíferos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/06 (preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/81 (para levaduras)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/60 (de levadura)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/48 (actúan sobre los enlaces peptídicos, p. ej. tromboplastina, aminopeptidasa de la leucina (3.4))

PDF original: ES-2550761_T3.pdf

 

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Método para producción de polipéptidos.

Fragmento de la descripción:

Método para producción de polipéptidos Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para producción de polipéptidos en una cepa de levadura modificada genéticamente.

Antecedentes de la invención

La expresión de proteínas heterólogas en levadura después de transformación de células de levadura con vectores de expresión adecuados que comprenden secuencias de DNA que codifican dichas proteínas ha tenido éxito para muchas especies de polipéptidos, tales como precursores de insulina, glucagón, péptidos afines a glucagón y sus análogos funcionales.

Sin embargo, a menudo se encuentra que el producto de expresión es una mixtura heterogénea de especies del precursor del polipéptido deseado que tienen longitudes de cadena de aminoácidos diferentes. Esto es debido a que la levadura produce varias enzimas proteollticas que son responsables del procesamiento de moléculas precursoras mayores para liberación del polipéptido maduro. Varias proteasas que incluyen los productos de los genes PEP4 y KEX1 son responsables de tal degradación de las proteínas de levadura.

El uso de cepas interrumpidas de KEX1 para expresión de proteínas recombinantes ha sido descrito anteriormente. Así, EP341.215 y US 6.103.515 describen el uso de una cepa de levadura que carece de KEX1 para producción de péptidos que no contienen terminal C básico de aminoácido alguno, v.g. hANP, EGF, péptido III activador del tejido

conectivo, hirudina, y variantes de hirudina.

Más de la mitad de los péptidos neurales y endocrinos conocidos están amidados en a y, en la mayoría de los casos, esta característica estructural es esencial para el reconocimiento de receptores, la transducción de señales, y por tanto, la función biológica. La amldaclón en a se deriva de una glicina C-terminal que se convierte enzimáticamente en una amida.

Un péptido amidado en a puede producirse directamente en la célula productora si la célula tiene la maquinaria necesaria para a-amidación in vivo. Sin embargo, algunos organismos con inclusión de las levaduras no son capaces de producir la a-amidación por que no expresan la enzima necesaria para a-amidación ¡n vivo y por tanto los péptidos producidos por la célula tienen que ser amidados en a por un paso in vitro subsiguiente.

Si se utiliza levadura como la célula de producción recombinante, una solución es producir un polipéptido precursor con una glicina C-terminal que se convierte luego, en un proceso in vitro subsiguiente, en el péptido a-amidado utilizando una enzima de a-amldaclón (D. J. Merkler (1994). C-Terminal amidated peptides: Production by the ¡n vitro enzymatic amidation of glycine extended peptides and the importance of the amide to bioactivity. Enzyme Microb. Technol.: 16(450-456).

No obstante, sorprendentemente, los autores de la presente invención han descubierto que la glicina C-terminal es escindida por numerosos péptidos expresados por Saccharomyces cerevisiae, haciendo imposible la conversión subsiguiente en un péptido a-amldado.

La presente invención ofrece una solución a este problema por utilización de una cepa de levadura genéticamente modificada que no es escindida del residuo glicina C-terminal.

Sumario de la invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para producción de un polipéptido con una Gly C- terminal en levadura, en el que la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional.

El gen KEX1 puede hacerse no-funcional por el uso de técnicas bien conocidas. Así, en una realización, el gen KEX1 se deleciona simplemente, y en otra realización, el gen KEX1 se hace no-funcional por mutación con especificidad de sitio, v.g. por recombinación homologa.

En una realización, la invención se refiere a un método para producción de un polipéptido en una cepa de levadura que tiene un gen KEX1 no-funcional, en el cual el polipéptido tiene como su residuo de aminoácido C-terminal una glicina, y en donde el método comprende los pasos siguientes

a) cultivo de la cepa de levadura que comprende una secuencia de DNA que codifica el polipéptido en condiciones para expresión del polipéptido en la cepa de levadura y

b) aislamiento del polipéptido expresado.

El polipéptido expresado puede aislarse del cultivo celular o de las células de levadura dependiendo de si el polipéptido expresado es secretado por la célula de levadura.

La glicina C-terminal es especialmente lábil cuando el penúltimo aminoácido del extremo C-terminal es uno de los residuos de aminoácido siguientes: Tyr, Phe, Met, Leu, Trp, Ala, lie y Arg. Así, en una realización, el penúltimo aminoácido del extremo C-terminal es Tyr, Phe, Met, Leu, Trp, Ala, lie o Arg.

Con "penúltimo aminoácido del extremo C-terminal" se entiende el residuo de aminoácido unido al extremo N- terminal del residuo de aminoácido C-terminal, que en este caso es un residuo glicina.

En particular, la glicina C-terminal es más lábil cuando el penúltimo aminoácido del extremo C-terminal es un residuo de aminoácido hidrófobo y en particular un residuo de aminoácido aromático. Así, en una realización adicional, el residuo de aminoácido próximo al Gly C-terminal es Tyr, Trp, Phe, Val, Leu, lie o Met y en una realización adicional el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es Val, Leu, lie o Met, y en una realización adicional el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es Tyr, Phe o Trp.

En otra realización adicional más, el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es Tyr.

La cepa de levadura puede tener otros genes de proteasa no-funcionales además del gen KEX1 no-funcional. Así, en una realización la cepa de levadura puede tener al menos un gen adicional de proteasa no-funcional seleccionado del grupo constituido por PEP4, YPS1, MKC7, YPS3, YPS5, YPS6, YPS7, PRB1, STE13 and KEX2.

El tamaño del polipéptido en cuestión puede tener también relevancia y, en una realización adicional, el polipéptido tiene desde aproximadamente 25 a aproximadamente 75 residuos de aminoácido en la cadena principal. En una realización adicional, el polipéptido tiene desde aproximadamente 25 a aproximadamente 60 residuos de aminoácido en la cadena principal, y en otra realización adicional, el polipéptido tiene desde aproximadamente 25 a aproximadamente 45 residuos de aminoácido en la cadena principal.

La cepa de levadura puede ser cualquier cepa de levadura que sea capaz de expresar y secretar DNA extraño. Sin embargo, en una realización la cepa de levadura es una cepa de Saccharomyces cerevisiae.

El método de la invención puede comprender una conversión enzimática adicional del polipéptido expresado y secretado. Así, en una realización de la invención, el polipéptido expresado y secretado con un Gly C-terminal se convierte en una amida por conversión enzimática con una enzima de a-amidación en un paso in vitro ulterior.

Descripción detallada de la invención

La expresión de péptidos con una glicina C-terminal en una cepa de S. cerevisiae ha resultado, como se ha mencionado, problemática dado que la glicina se escinde eficientemente en especial si el penúltimo aminoácido del extremo C-terminal es una tirosina como en PP (polipéptido pancreático), PYY y amilina, y conforme a la presente invención se ha encontrado que en cepas de levadura la proteasa responsable de la escisión de la glicina C-terminal es la proteasa Kex1 p.

Con "Kex1" o "Kexlp" se entiende una serina-carboxipeptidasa que cataliza preferentemente la eliminación de los residuos C-terminales lisil y/o arginil (Shilton BH, Thomas DY, Cygler M 1997 Crystal structure of Kex1 deltap, a prohormone-processing carboxypeptidase from Saccharomyces... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para producción de un polipéptido amidado C-terminal en el cual el método comprende los pasos siguientes

a) cultivo de una cepa de levadura que tiene un gen KEX1 no-funcional y que comprende una secuencia de DNA que codifica un polipéptido con un Gly C-term¡nal en condiciones para expresión del polipéptido en la cepa de levadura, b) a-amidación ¡n vitro del polipéptido expresado del paso a) o directamente en la célula de producción si la célula tiene la maquinaria necesaria para a-amidación in vivo y c) aislamiento y purificación del péptido amidado en el terminal C.

2. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual el polipéptido se aísla del medio de cultivo.

3. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es del grupo constituido porTyr, Phe, Met, Leu, Trp, Ala, lie y Arg.

4. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es del grupo constituido por Tyr, Trp, Phe, Val, Leu, lie y Met.

5. Método conforme a la reivindicación 4, en el cual el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es Val, Leu, lie o Met.

6 Método conforme a la reivindicación 4, en el cual el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es Tyr,

Trp o Phe.

7. Método conforme a la reivindicación 6, en el cual el residuo de aminoácido unido al Gly C-terminal es Tyr.

8. Método conforme a cualquiera de las realizaciones 1-7, en el cual la cepa de levadura tiene al menos un gen adicional de proteasa no-funcional seleccionado del grupo constituido por PEP4, YPS1, MKC7, YPS3, YPS5, YPS6, YPS7, PRB1, STE13 y KEX2.

9. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido por PEP4, YPS1 y MKC7.

10. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4, YPS1 e YPS3.

11. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4, YPS3 y MKC7.

12. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 e YPS1.

13. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4, e YPS3.

14. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 y MKC7.

15. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3, YPS1 y MKC7.

16. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 e YPS1.

17. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 y MKC7.

18. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 e YPS5.

19. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 e YPS6.

20. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 e YPS7.

21. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 y PRB1.

22. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 y STE13.

23. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of PEP4 y KEX2.

24. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 e YPS5.

25. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 e YPS6.

26. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 e YPS7.

27. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 y PRB1.

28. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 y STE13.

29. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS3 y KEX2.

30. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS1 y PRB1.

31. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS1 y STE13.

32. Método conforme a la reivindicación 8, en el cual la cepa de levadura tiene un gen adicional de proteasa no- funcional seleccionado del grupo constituido of YPS1 y KEX2.

33. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen PEP4 no-funclonal.

34. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen YPS1 no-funcional.

35. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen MKC7 no-funcional.

36. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen YPS3 no-funclonal.

37. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen YPS5 no-funclonal.

38. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen YPS6 no-funclonal.

39. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen YPS7 no-funcional.

40. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen PRB1 no-funcional.

41. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen STE13 no-funclonal.

42. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene un gen KEX1 no-funcional y un gen KEX2 no-funclonal.

43. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene una silenciación del gen KEX1 y uno solo de los genes de proteasa seleccionados del grupo siguiente PEP4, YPS1, MKC7(YPS2), YPS3(YPS4), YPS5, YPS6, YPS7, PRB1, STE13 y KEX2.

44. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene una silenciación del gen KEX1 y dos de los genes de proteasa seleccionados del grupo siguiente PEP4, YPS1, MKC7(YPS2), YPS3(YPS4), YPS5, YPS6, YPS7, PRB1, STE13 y KEX2.

45. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene una silenciación del gen KEX1 y tres de los genes de proteasa seleccionados del grupo siguiente PEP4, YPS1, MKC7(YPS2), YPS3(YPS4), YPS5, YPS6, YPS7, PRB1, STE13 y KEX2.

46. Método conforme a la reivindicación 1, en el cual la cepa de levadura tiene una silenciación del gen KEX1 y cuatro de los genes de proteasa seleccionados del grupo siguiente PEP4, YPS1, MKC7(YPS2), YPS3(YPS4), YPS5, YPS6, YPS7, PRB1, STE13 y KEX2.

47. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el gen KEX1 ha sido delecionado.

48. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el gen KEX1 se ha hecho no- funcional por mutación, v.g. por recombinación homologa.

49. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el polipéptido tiene de 25 a aproximadamente 45 residuos de aminoácidos en la cadena principal.

50. Método conforme a cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el cual el polipéptido se selecciona del grupo constituido por amilina, análogos de amilina, PP y análogos de PP, PYY y análogos de PYY, GLP-1 y análogos de GLP1, oxitocina, vasopresina, calcitonina, gastrina, NPY, FMRF-amida, secretina, GFHR, CRF, neuroquinina A, péptido liberador de gastrina, y a-MSH.

51. Método conforme a la reivindicación 49-50, en el cual el polipéptido se selecciona del grupo constituido por PP, PYY y amilina.

52. Método conforme a la reivindicación 49-50, en el cual el polipéptido es amilina.

53. Método conforme a la reivindicación 49-50, en el cual el polipéptido es PP.

54. Método conforme a la reivindicación 49-50, en el cual el polipéptido es PYY.