Procedimiento para el cribado de anticuerpos de alta afinidad.

Procedimiento para la selección de un anticuerpo de unión a antígeno independiente de la temperatura de entre una pluralidad de anticuerpos, por lo que se selecciona un anticuerpo con una entropía de unión de asociación estándar

(ΔSº‡as) de menos de 10 J/K*mol y una entropía de unión estándar absoluta (ΔSº) de 100 J/mol*K o más.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/006136.

Solicitante: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG.

Inventor/es: VON PROFF,LEOPOLD, SCHRAEML,Michael.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/68 (en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de los materiales por... > G01N21/55 (Reflexión especular)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales > C07K16/26 (contra hormonas)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de los materiales por... > G01N21/552 (Atenuación de la reflexión total)
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Procedimiento para el cribado de anticuerpos de alta afinidad.

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DESCRIPCIÓN

Procedimiento para el cribado de anticuerpos de alta afinidad En el presente documento se informa de un procedimiento para la determinación de un anticuerpo de alta afinidad basado en parámetros termodinámicos del anticuerpo, en especial, la termodinámica en el estado de transición para evaluar la entropía de unión tal como la entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) y la carga entrópica durante la etapa de unión a antígeno.

Antecedentes de la invención La generación de anticuerpos de alta afinidad con especificidad de antígeno distinguida y estabilidad del complejo de antígeno extraordinaria es un importante objetivo en el desarrollo de anticuerpos terapéuticos y de diagnóstico.

En lo que respecta a los análisis termodinámicos de las interacciones proteína-proteína, la tecnología preponderante es el ensayo calorimétrico (Chaires, JB, Annu. Rev. Biophys. 37 (2008) 135-51; Perozzo, R., et al., J. Recept. Signal Transduct. Res. 24 (1-2) (2004) 1-52; Li, L, et al., Chem. Biol. Drug Des. 71(6) (2008) 529-32; Liang, Y., Acta Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai) 40(7) (2008) 565-76; Thielges, M.C., et al., Biochemistry 47(27) (2008) 7237-47). La cantidad de muestra requerida para una determinación calorimétrica de la reacción es alta, tal como una concentración de anticuerpo de al menos 125 μg/ml y volúmenes de muestra de al menos 150 μl. Además, la calorimetría de la reacción requiere una alta pureza de la muestra y no tolera ninguna impureza de la muestra ni heterogeneidad de la muestra y los tampones de la muestra influencian directamente los resultados de los resultados de los parámetros termodinámicos. La calorimetría de la reacción sólo puede resolver la termodinámica en el equilibrio.

La instrumentación de la resonancia de plasmón superficial (SPR) (Roos, H., et al., J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 204-10; Van Regenmortel, M.H., et al., J. Mol. Recognit. 11(1-6) (1998) 163-7; Gunnarsson, K., Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18 (2001) Unit 18.6; Drake, A.W., et al., Anal. Biochem. 328(1) (2004) 35-43; Kikuchi, Y., et al., J. Biosci. Bioeng. 100 (3) (2005) 311-7), permite la determinación rápida de perfiles cinéticos dependientes de la temperatura de manera ultrarrápida (véase por ejemplo, Canziani, Georgia, et al., Anal. Biochem. 325(2) (2004) 301-7; Safsten, P., et

al., Anal. Biochem. 353(2) (2006) 181-190; Leonard, P., et al., J. Immunol. Methods 323(2) (2007) 172-9).

Wassaf, D., et al. (Anal. Biochem. 351 (2006) 241-253) informan de la clasificación por afinidad ultrarrápida de anticuerpos usando micromatrices de resonancia de plasmón superficial. Un análisis termodinámico de interacciones de proteínas con tecnología de biosensores se informa en Roos, H., et al., J. Mol. Recognit. 11 (1998) 204-210.

Sumario de la invención La presente invención proporciona un procedimiento para la selección de un anticuerpo de alta afinidad con estabilidad del complejo de antígeno independiente de la temperatura, caracterizado por una asociación de anticuerpo impulsada por entalpía, una carga entrópica negativa y una gran variación de entropía durante la disociación del antígeno.

Un primer aspecto de la invención es un procedimiento para la selección de un anticuerpo de entre una pluralidad de anticuerpos que se unen a un antígeno, dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:  optimizar la respuesta señal en una determinación de resonancia de plasmón superficial basada en el peso molecular del antígeno, en la que Rmáx se mantiene constante en el intervalo de temperatura de la determinación,  realizar una etapa de cribado cinético, que comprende el cálculo de una estabilidad del complejo con antígeno de acuerdo con la fórmula (I) (I) estabilidad del complejo con antígeno = (1-[BL (UR) – SL (UR) / BL (UR)]) en base a la determinación de resonancia de plasmón superficial indicando BL un punto de referencia de unión tardía (Binding Late, BL) establecido poco antes de que termine la inyección del antígeno, indicando SL un punto de referencia de estabilidad tardía (Stability Late, SL) establecido poco antes de la finalización de la fase de disociación del complejo,  seleccionar anticuerpos con estabilidades de complejo mayores que un 95 %,  determinar datos cinéticos dependientes de la temperatura por resonancia de plasmón superficial, a 17 ºC, a 21 ºC, a 25 ºC, a 29 ºC, a 33 ºC y a 37 ºC,  calcular las propiedades termodinámicas en el estado de transición,  seleccionar un anticuerpo en base a una aceleración dependiente de la temperatura de la constante de velocidad de asociación del complejo con antígeno ka [1/Ms] y una constante de velocidad de disociación del complejo con antígeno restante o en disminución kd [1/s].

En un modo de realización de este aspecto es  la generación de datos cinéticos dependientes de la temperatura en base a una determinación de resonancia de plasmón superficial y el cálculo de propiedades termodinámicas de dicho anticuerpo con un cribado termodinámico realizado a 17 ºC con concentración de anticuerpo 107 nM, a 21 ºC con 78 nM, a 25 ºC con 70 nM, a 29 ºC con 64 nM, a 33 ºC con 58 nM y a 37 ºC con 53 nM, y/o  las propiedades termodinámicas de la fase de asociación del complejo con antígeno ΔHº‡as impulsada por entalpía y una entropía de unión ΔSº‡as de menos de 10 J/K*mol, y/o  un anticuerpo seleccionado con una fase de disociación que muestra una energía de activación de disociación negativa o cercana a cero (Eadis [kJ/mol]), una entalpía de disociación negativa (ΔHº‡dis [kJ/mol]), y una gran entropía de disociación negativa (ΔSº‡dis [kJ/mol]).

Un aspecto de la invención es un procedimiento para producir un anticuerpo que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una pluralidad de células, preferentemente células de hibridoma o linfocitos B, que exprese cada una un anticuerpo, b) determinar la cantidad dependiente del tiempo de dicho anticuerpo unido al antígeno respectivo por resonancia de plasmón superficial a diferentes temperaturas y diferentes concentraciones de anticuerpo, c) calcular con la cantidad dependiente del tiempo determinada en b) en base a las ecuaciones (II) a (XIII) (II) ΔGº = ΔHº – T*ΔSº (III) ΔGº = – R*T*lnKD (IV) lnKD = -1/T * (ΔHº/R)/pendiente – (ΔSº/R)/intersección (V) R*T*lnKD = ΔHºT0 – T*ΔSºT0+ΔCºp(T-T0)-T*ΔCpº ln(T/T0) (VI) ka = (kb*T/h)*e(-ΔGº‡/R*T) (VII) lnka/T = -1/T * (ΔHº‡/R)/pendiente + (ΔSº‡*R + lnkb/h)/intersección (VIII) ka = A*e-Ea/R*T (IX) lnka = InA/intersección – (1/T*Ea/R)/pendiente (X) kd = (kb*T/h)*e(-ΔGº‡/R*T) (XI) lnkd/T = -1 /T * (ΔHº‡/R)/pendiente + (ΔSº‡/R + lnkB/h)/intersección (XII) kd = A*e-Ea/R*T (XIII) lnkd = InA/intersección – (1/T*Ea/R)/pendiente al menos los parámetros termodinámicos (i) entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as), (ii) entropía de unión de disociación estándar (ΔSº‡dis), (iii) entropía de unión estándar (ΔSº), (iv) energía libre de Gibbs de unión estándar (ΔGº), (v) energía libre de Gibbs de unión de disociación estándar(ΔGº‡dis), (vi) energía libre de Gibbs de unión de asociación estándar(ΔGº‡as), (vii) -TΔSº, (viii) constante de velocidad de disociación kd, (ix) constante de unión en el equilibrio KD, y (x) constante de velocidad de asociación ka, d) seleccionar una célula que produzca un anticuerpo con al menos dos de los siguientes: i) una entropía de unión de asociación estándar de menos de 10 J/K*mol, ii) una entropía de unión de disociación estándar absoluta de 100 J/mol*K o más, iii) una entropía de unión de estándar absoluta de 100 J/mol*K o más, e) producir un anticuerpo cultivando dicha célula seleccionada bajo condiciones adecuadas para la expresión de dicho anticuerpo y recuperar dicho anticuerpo de las células o/y del medio de cultivo.

En un modo de realización, el procedimiento comprende una o ambas de las siguientes etapas adicionales:  después de a) y antes de b): al) cultivar las células de a) y proporcionar sobrenadantes de cultivo conteniendo cada uno los anticuerpos expresados por dichas células,  después de la etapa d) y antes de la etapa e): d1) aislar el ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo de dicha célula seleccionada, proporcionar en base a dicho ácido nucleico aislado otro ácido nucleico que codifica una variante humanizada y/o deficitaria de epítopo de linfocito T, con injerto de CDR, quimérico, de dicho anticuerpo, proporcionar un plásmido de expresión que contiene dicho ácido nucleico modificado en un casete de expresión, y transferir una célula CHO, una célula NS0, una célula SP2/0, una célula HEK293, una célula COS o una célula PER.C6 con dicho plásmido de expresión.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la selección de un anticuerpo de unión a antígeno independiente de la temperatura de entre una pluralidad de anticuerpos, por ejemplo, para un tratamiento terapéutico, en el que se selecciona un anticuerpo con una entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) de menos de 10 J/K*mol.

En un modo de realización de este aspecto, se selecciona un anticuerpo con al menos dos de a) una entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) de menos de 10 J/K*mol, b) una entropía de unión de disociación estándar absoluta (ΔSº‡dis) de 100 J/mol*K o más, c) una entropía de unión de estándar absoluta (ΔSº) de 100 J/mol*K o más.

En un modo de realización de los procedimientos de acuerdo con la invención, la entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) es de menos de 5 J/K*mol. En otro modo de realización, la entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) es de menos de 0 J/K*mol. En otro modo de realización, la entropía de unión de disociación estándar absoluta (ΔSº‡dis) es de 125 J/mol*K o más. Aún en otro modo de realización, la entropía de unión de disociación estándar absoluta (ΔSº‡dis) es de 150 J/mol*K o más. En otro modo de realización, la entropía de unión estándar absoluta (ΔSº) es de 125 J/mol*K o más. En otro modo de realización, la entropía de unión estándar absoluta (ΔSº) es de 150 J/mol*K o más.

En un modo de realización de la presente invención, los procedimientos se caracterizan por que se selecciona un anticuerpo con una energía libre de Gibbs de unión estándar (ΔGº) de -50 kJ/mol o menos. En otro modo de realización, los procedimientos de acuerdo con la invención se caracterizan por que se selecciona un anticuerpo con una proporción de la energía libre de Gibbs de unión de disociación estándar (ΔGº‡dis) con respecto a la energía libre de Gibbs de unión de asociación estándar (ΔGº‡as) de más de 2,3. En otro modo de realización, los procedimientos se caracterizan por que se selecciona un anticuerpo con un valor de -TΔSº a) de – 80 kJ/mol o menos, o b) de + 40 kJ/mol o más.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la selección de un anticuerpo de unión a antígeno independiente de la temperatura de entre una pluralidad de anticuerpos, por ejemplo, para su uso en una composición farmacéutica, que comprende la etapa de seleccionar un anticuerpo con una constante de velocidad de disociación kd (1/s) que permanece en el mismo orden de magnitud, o disminuye hasta dos órdenes de magnitud con el incremento en la temperatura.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la selección de un anticuerpo de unión a antígeno independiente de la temperatura de entre una pluralidad de anticuerpos, por ejemplo, para su uso en una composición farmacéutica, que comprende la etapa de seleccionar un anticuerpo con una constante de unión en el equilibrio KD (M) que permanece constante o que disminuye con el incremento en la temperatura.

En un modo de realización de los procedimientos de acuerdo con la invención, la temperatura está en el intervalo de desde 13 ºC a 37 ºC.

Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para la selección de un anticuerpo de unión a antígeno independiente de la temperatura de entre una pluralidad de anticuerpos, por ejemplo, para su uso en una composición farmacéutica, que comprende las etapas de i) determinar los datos cinéticos dependientes de la temperatura, ii) calcular las propiedades termodinámicas en el estado de transición (TS), y iii) seleccionar un anticuerpo en base al comportamiento termodinámico.

En un modo de realización, los procedimientos de acuerdo con la invención se caracterizan por que dicho comportamiento termodinámico es una aceleración dependiente de la temperatura de la constante de velocidad de asociación del complejo con antígeno ka [1/Ms] y una constante de velocidad de disociación del complejo con antígeno restante o en disminución kd [1/s]. En otro modo de realización, dicho comportamiento termodinámico es una fase de asociación del complejo con antígeno impulsada por entalpía ΔHº‡as y una entropía de unión ΔSº‡as de menos de 10 J/K*mol. En otro modo de realización, se selecciona un anticuerpo con una fase de disociación que muestra una energía de activación de disociación negativa o cercana a cero (Eadis [kJ/mol]), una entalpía de disociación negativa (ΔHº‡dis [kJ/mol]), y una gran entropía de disociación negativa (ΔSº‡dis [kJ/mol]).

Aún en otro modo de realización, la determinación de los datos cinéticos dependientes de la temperatura es por resonancia de plasmón superficial y comprende una etapa de cribado cinético y una etapa de cribado termodinámico.

En un modo de realización, dicha etapa de cribado cinético comprende el cálculo de una estabilidad del complejo con antígeno de acuerdo con la fórmula (I) (I) estabilidad del complejo con antígeno = (1-[BL (UR) – SL (UR) / BL (UR)]) en base a una determinación de resonancia de plasmón superficial indicando BL un punto de referencia de unión tardía (Binding Late) establecido poco antes de que termine la inyección del antígeno, indicando SL un punto de referencia de estabilidad tardía (Stability Late) establecido poco antes de la finalización de la fase de disociación del complejo. Aún en otro modo de realización, los procedimientos comprenden la etapa de optimizar la respuesta señal en la determinación de resonancia de plasmón superficial en base al peso molecular del antígeno, por lo que Rmáx se mantiene constante en el intervalo de temperatura de la determinación.

En otro modo de realización, los procedimientos de acuerdo con la invención se caracterizan por que dicha determinación por resonancia de plasmón superficial comprende las siguientes etapas: a) inmovilizar un anticuerpo sobre una superficie de soporte sólido por una molécula de captura unida a dicha la superficie de soporte sólido, b) proporcionar una solución que comprende un antígeno, c) hacer fluir una solución que contiene una concentración conocida del antígeno sobre la superficie de soporte sólido para permitir la asociación del antígeno al anticuerpo inmovilizado, d) hacer fluir una solución libre del antígeno sobre la superficie de soporte sólido para permitir la disociación del antígeno del anticuerpo inmovilizado, e) realizar un seguimiento durante las etapas c) y d) de la cantidad dependiente del tiempo de antígeno unido a la superficie de soporte sólido y recoger los datos de unión, en los que las etapas c) y d) se repiten al menos una vez con una concentración diferente del antígeno, y f) calcular los parámetros cinéticos y/o termodinámicos ajustando los datos de unión obtenidos en e) a un modelo predeterminado para la interacción entre el antígeno y el anticuerpo inmovilizado en base a las ecuaciones (II) a (XIII).

En un modo de realización, dicha inmovilización de un anticuerpo es por una molécula de captura de anticuerpo específico de especie.

Un aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo producido con un procedimiento de acuerdo con la invención.

En un modo de realización, la selección de un anticuerpo en el cribado cinético se realiza seleccionando un anticuerpo con estabilidades de complejo mayores de un 95 %. Aún en otro modo de realización, la respuesta señal del antígeno se optimiza en base al peso molecular del antígeno.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para la selección de un anticuerpo por resonancia de plasmón superficial en el que se generan datos cinéticos dependientes de la temperatura para calcular las propiedades termodinámicas en el estado de transición (TS) y se selecciona un anticuerpo en base al comportamiento termodinámico, en el que dicha generación de datos cinéticos dependientes de la temperatura se basa en una determinación de la resonancia de plasmón superficial y cálculo de las propiedades termodinámicas de dicho anticuerpo con un cribado termodinámico realizado a 17 ºC con una concentración de anticuerpo 107 nM, a 21 ºC con 78 nM, a 25 ºC con 70 nM, a 29 ºC con 64 nM, a 33 ºC con 58 nM y a 37 ºC con 53 nM.

Descripción detallada de la invención El presente invención informa de procedimientos para la selección de un anticuerpo que se une a un antígeno, caracterizado por que se generan datos cinéticos dependientes de la temperatura para calcular propiedades termodinámicas en el estado de transición (TS) y se selecciona un anticuerpo en base al comportamiento termodinámico.

Se ha descubierto que los procedimientos cinéticos basados en la resonancia de plasmón superficial tienen varias ventajas sobre los ensayos calorimétricos convencionales:  es posible un procesamiento ultrarrápido,  bajo consumo de muestra,  medida de afinidad en lugar de avidez, y  uso de sobrenadantes celulares en bruto o mezclas de cultivo del complejo.

La superficie del biosensor de plasmón superficial es una matriz de afinidad, que se usa, por ejemplo, para capturar el anticuerpo de los sobrenadantes del cultivo celular. Por tanto, las mezclas en bruto y complejas se pueden usar como muestras. Como uno de los compañeros de interacción se inmoviliza sobre la superficie del sensor y el segundo compuesto se inyecta en el sistema de flujo, es posible la medida de la termodinámica en el equilibrio y en el estado de transición, puesto que el sistema FIA (análisis de inyección de flujo) puede realizar un seguimiento de la fase de asociación y disociación del complejo. Con esta tecnología, es posible el cálculo de los parámetros termodinámicos  energía libre de Gibbs de unión estándar ΔGº,  entalpía de unión estándar ΔHº,  entropía de unión estándar ΔSº, y de los parámetros en el estado de transición  energía libre de Gibbs de asociación estándar ΔGº‡as,  entalpía de asociación estándar ΔHº‡as,  entropía de unión de asociación estándar ΔSº‡as,  energía de activación Eaas,  energía libre de Gibbs de disociación estándar ΔGº‡dis,  entalpía de disociación estándar ΔHº‡dis,  entropía de disociación estándar ΔSº‡dis, y  energía de disociación Eadis.

En caso de usar la ecuación de van’t Hoff no lineal, se determina un valor de ΔCp.

Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para la selección de anticuerpos en base a sus características termodinámicas.

En general, un cribado de anticuerpo cinético basado en SPR (véase, por ejemplo, Steukers, M., et al., J. Immunol.

Methods 310(1-2) (2006) 126-35; Rich, R.L., et al., Anal. Biochem. 361 (1) (2007) 1-6) da resultado por una segunda etapa de análisis SPR termodinámicos de mayor resolución.

Con un procedimiento de acuerdo con la invención se pueden seleccionar anticuerpos, que tienen una afinidad al menos constante o en incremento a temperaturas elevadas, es decir, una estabilidad del complejo con antígeno al menos constante o en incremento a temperaturas elevadas. La estabilidad del complejo con antígeno es un criterio de selección principal en el procedimiento de cribado de anticuerpos. Únicamente se seleccionan cultivos celulares primarios, que producen anticuerpos con complejos con antígeno altamente estables a 25 ºC o 37 ºC, respectivamente.

Los cultivos de células productoras de anticuerpos se producen y se someten, en un modo de realización, a análisis ultrarrápidos, en los que se generan datos cinéticos dependientes de la temperatura para calcular propiedades termodinámicas en el estado de transición (TS). La selección del anticuerpo de acuerdo con el procedimiento de la invención se realiza en base a su comportamiento termodinámico.

En un modo de realización de este aspecto, el anticuerpo seleccionado se caracteriza por una aceleración dependiente de la temperatura de la constante de velocidad de asociación del complejo con antígeno ka[1/Ms] y una constante de velocidad de disociación del complejo con antígeno restante o desacelerada kd[1/s]. Dicho anticuerpo, típicamente, se caracteriza por una fase de asociación del complejo con antígeno impulsada por entalpía ΔHº‡as y una entropía de unión negativa ΔSº‡as, lo que indica en esta solicitud una "carga entrópica". Un anticuerpo seleccionado con el procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza por un mecanismo de interacción con antígeno, que muestra una gran variación entrópica en el equilibrio de unión. Esta contribución entrópica proviene de la etapa de disociación del complejo anticuerpo-antígeno, en la que tiene lugar una gran variación positiva o una gran variación negativa de la entropía de disociación ΔSº‡dis. Además, un anticuerpo seleccionado con el procedimiento de acuerdo con la invención puede tener una anomalía termodinámica que se origina a partir de la fase de disociación de antígeno, donde la constante de velocidad de disociación kd[1/s] disminuye de forma sorprendente e inesperada con el incremento en la temperatura. Dicho anticuerpo se caracteriza por parámetros termodinámicos tales como i) una fase de disociación que muestra una energía de activación de disociación negativa o cercana a cero Eadis [kJ/mol], una entalpía de disociación negativa ΔHº‡dis [kJ/mol] y una gran entropía de disociación negativa ΔSº‡dis [kJ/mol]. Cabe señalar que este es un tratamiento completamente teórico de este efecto.

Por tanto, un procedimiento de acuerdo con la invención permite la selección de un anticuerpo de entre una multitud de anticuerpos de alta afinidad, en base a parámetros termodinámicos, que proporcionan una base para el modo de interacción del anticuerpo seleccionado con el antígeno, es decir que el anticuerpo induce un cambio conformacional en el antígeno o que el anticuerpo sufre un cambio conformacional en sí mismo. Por tanto, el procedimiento es útil para la selección de células que producen anticuerpos con alta estabilidad del complejo con antígeno.

En un modo de realización, el procedimiento de acuerdo con la invención comprende una etapa de cribado cinético y una etapa de cribado termodinámico. Para el cribado cinético, se establece un punto de referencia de unión tardía (BL), poco antes de que finalice la inyección del antígeno y se establece un punto de referencia de estabilidad tardía (SL) poco antes de la finalización de la fase de disociación del complejo. En un modo de realización, los datos de BL y SL se visualizan gráficamente por una curva X-Y mostrando el eje X el valor en unidades de respuesta (UR) del punto de referencia de unión tardía y mostrando el eje Y el valor para el punto de referencia de la estabilidad tardía en UR (para una curva ejemplar véase la figura 1). Adicionalmente, la estabilidad del complejo con antígeno se puede calcular de acuerdo con la fórmula (I) en base a los datos BL y SL: estabilidad del complejo con antígeno = (1-[BL (UR) – SL (UR) / BL (UR)]) (I).

En otro modo de realización, los datos de BL y estabilidad del complejo con antígeno se visualizan gráficamente por una curva X-Y mostrando el eje X el valor en unidades de respuesta (UR) del punto de referencia de unión tardía y mostrando el eje Y el valor en porcentaje para la estabilidad del complejo (para una curva ejemplar véase la figura 2). En un modo de realización, la etapa de cribado cinético se realiza a 25 ºC. En otro modo de realización, el cribado cinético se realiza a 37 ºC. En otro modo de realización, el cribado cinético se realiza para un conjunto de dos o más de temperaturas diferentes entre 13 ºC y 42 ºC.

Antes del cribado termodinámico se cultivan los clones depositados de células individuales, en un modo de realización, en matraces de cultivo con agitador de 100 ml usando medio RPMI 1640. En otro modo de realización, se purifican los anticuerpos del sobrenadante por cromatografía en columna Protein A Sepharose (TM) antes del cribado termodinámico. En un modo de realización, el tampón del sistema es HBS-EP para el cribado termodinámico. En otro modo de realización, se complementa el tampón de muestra con 1 mg/ml de carboximetildextrano para reducir los efectos de la matriz de sensores inespecíficos.

El procedimiento de acuerdo con la invención se describirá a continuación usando como ejemplo el análisis de anticuerpos anti-PTH humana. Este ejemplo no se ha de interpretar como una limitación del procedimiento de acuerdo con la invención, de hecho, se presenta para ejemplificar las enseñanzas del procedimiento de acuerdo con la invención. El alcance de la presente solicitud se expone en las reivindicaciones.

En una primera etapa, se realizó un cribado cinético de sobrenadantes de hibridomas. Los datos de unión tardía y estabilidad tardía de 549 cultivos primarios de hibridoma de varias campañas de inmunización y fusión se ilustran en la figura 1. Se seleccionaron células de hibridomas con una respuesta a antígeno suficiente (BL) y disociación del complejo con antígeno lenta (SL) para etapas de cribado adicionales. Por ejemplo, se usaron las células numeradas 123, 119, 499, 133 y 295 para procesamiento posterior (véase el círculo en la figura 1) y se rechazaron las células numeradas 189, 263 y 341 debido a su estabilidad de complejo insuficiente (véase el cuadro en la figura 1).

Para facilitar la identificación de los anticuerpos con una respuesta a antígeno alta y una estabilidad de complejo alta, se puede usar un diagrama en el que se representó la estabilidad de complejo resultante en [%] frente a la señal de respuesta de unión tardía (véase, por ejemplo, la figura 2). En un modo de realización para la selección de anticuerpos en el cribado cinético se seleccionaron agentes de unión con estabilidad del complejo con antígeno alta con estabilidades de complejo de un 95 % o más.

La mayoría de las publicaciones que usan medidas basadas en SPR no usan sistemas de captura de anticuerpo como tecnología de presentación de sensores de superficie. Normalmente, el anticuerpo o fragmentos del mismo se inmovilizan covalentemente sobre el sensor. Esto tecnología no se puede usar en un formato ultrarrápido, puesto que la superficie no es adecuada para la presentación de anticuerpos polivalente, sino que está limitada técnicamente por el número de sensores que se inmovilizan con ligandos.

Si se usa un sistema de captura para medidas termodinámicas, el nivel de captura de anticuerpo varía debido a la sensibilidad de la temperatura de la cinética (véase la figura 15). El uso de un sistema de captura de anticuerpo para termodinámica es absolutamente necesario para garantizar un nivel de captura de anticuerpo independiente de la temperatura y homogéneo.

Existen dos cuestiones principales para las medidas termodinámicas a bajas temperaturas. En primer lugar, las cinéticas de los sistemas de captura de anticuerpo son demasiado lentas para capturar suficiente anticuerpo secundario para el análisis a temperaturas disminuidas. En segundo lugar, la cinética de las interacciones anticuerpo-antígeno se ralentiza también. La cinética muestra una pérdida fuerte en la resolución de ensayo debido a la lenta cinética a 4 ºC y 11 ºC. No se puede lograr el equilibrio en el intervalo de temperatura completo. Los valores de Rmáx son pequeños y no homogéneos en el gradiente de temperatura. Con el incremento de temperatura, la cantidad de mAb capturado incrementa constantemente debido a una velocidad de asociación más rápida del anticuerpo secundario. La cinética del antígeno se acelera, también, y los valores de Rmáx se incrementan con el incremento en la temperatura. Dado que no se logran los equilibrios, estos valores de Rmáx estimados son más bien propensos a error.

El rendimiento del sensor no homogéneo es responsable de errores considerables en los cálculos termodinámicos. No se puede lograr la significación de un 95 % de los parámetros calculados.

Por lo tanto, es necesario optimizar el gradiente de temperatura usado en el experimento así como la preparación de la superficie del sensor. Se ha descubierto que el rendimiento del sensor se va a optimizar principalmente por una valoración dependiente de la temperatura del sistema de captura de anticuerpo y usando un gradiente de temperatura optimizado y tiempos de inyección adaptados, de modo que en el ciclo completo el valor de Rmáx es constante. El resultado se compara en las figuras 15. El promedio de Rmáx es de 35 UR +/- 3 UR. Se logró el equilibrio a las temperaturas > 30 ºC. El menor temperatura usada aquí es de 15 ºC. La tabla 1 compara el cálculo del parámetro termodinámico para el equilibrio (Van’t Hoff lineal), la fase de asociación (Eyring y Arrhenius) y la fase de disociación (Eyring y Arrhenius), usando el ensayo convencional frente al optimizado.

Tabla 1: Termodinámica de las interacciones en forma no optimizada y optimizada.

no optimizado optimizado Nombre de parámetro Valor de parámetro EE Valor de parámetro EE ΔHº [KJ/mol] -61 9,4 -59 1,2 ΔSº [J/(KJ/mol)] -57 32 -51 38 TΔSº [KJ/mol] -17 95 -15 11 ΔGº [KJ/mol] -44 0,13 -43 0,009 ΔHº‡as [KJ/mol] 34 78 37 064 ΔSº‡as [J/(K•mol)] -49 27 -44 2 1 TΔSº‡as. [KJ/mol] -15 8 -13 0,64 ΔGº‡as [KJ/mol] 49 011 0 005 Ea as [KJ/mol] 37 78 39 0,64 ΔHº‡dis [KJ/mol] 95 16 95 18 ΔSº‡dis. (J/ (K•mol) ] 75 56 76 59 TΔSº‡dis [KJ/mol] 2,2 17 2,3 17 ΔGº‡dis [KJ/mol] 93 0,23 93 0014 Ea dis [KJ/mol] 98 16 98 18 van't Hoff R2 = 0 91,30 R2 = 0 9992 Asociación de Eyring R2 = 0 8280 R2 = 0 9994 Disociación de Eyring R2 = 0 8943 R2 = 0 9993 Intervalo temp.

4 ºC-40 ºC 15 ºC – 40 ºC Valoración temp.

no sí Asociación 2 min 3 min R2 > 95 % no sí Los datos en la fila "no optimizado" muestran errores altos (EE), mientras que los datos "optimizados" muestran errores mucho menores. Todos los valores de R2 del ensayo "no optimizado" tienen una significación por debajo de un 95 %, mientras que el ensayo optimizado muestra R2 > 95 %.

El enfoque es sobre los valores ΔSº‡as, en los que el sistema no optimizado muestra un error de un 55 %, mientras que el ensayo optimizado muestra un error de solo un 5 %.

El intervalo de temperatura apropiado, tiempo de asociación y valoración de la cinética de captura ("valoración de temp.") son parámetros clave para realizar con éxito las medidas termodinámicas en un formato ultrarrápido. Se optimizaron estos parámetros para medir las interacciones anticuerpo antígeno basadas en SPR con errores susceptibles.

Para realizar un cribado termodinámico se ha de establecer un sistema de captura específico de especie una estabilidad del complejo con anticuerpo secundario dependiente de la temperatura apropiada. Por lo tanto, se calibró el biosensor usando un procedimiento de optimización, que es un segundo aspecto de la presente invención. Con este procedimiento, fue posible determinar las características de unión de anticuerpos IgG murinos anti-PTH con especificidades de epítopo variables en un formato ultrarrápido. El cribado termodinámico proporciona un conjunto de datos dependientes de la temperatura (véase la figura 3). A temperaturas más bajas se observó menos respuesta, puesto que se reduce la velocidad de asociación del sistema de captura (véase el ejemplo 5, tabla 2). A temperaturas más altas la velocidad de asociación se acelera, de modo que en un modo de realización, la concentración y/o el tiempo de inyección del anticuerpo en cuestión se tuvo que reducir para no capturar demasiado anticuerpo. En un modo de realización, la respuesta señal del antígeno se optimiza en base al peso molecular del antígeno. Por ejemplo, dependiendo del peso molecular de PTH (9,4 kDa) se optimizó la respuesta señal del antígeno a Rmáx y no excedió de 25 UR.

Por lo tanto, en un modo de realización del procedimiento para la selección de anticuerpos en base a las propiedades termodinámicas, se realiza una etapa de cribado termodinámico a 17 ºC con concentración de anticuerpo (secundario) 107 nM, a 21 ºC con 78 nM, a 25 ºC con 70 nM, a 29 ºC con 64 nM, a 33 ºC con 58 nM y a 37 ºC con 53 nM. Para anticuerpos anti-PTH, se usaron sobrenadantes de hibridoma para capturar un nivel de respuesta de anticuerpos constante de 320 UR sobre la superficie del sensor, donde el anticuerpo 320 UR capturó el analito PTH de 9,4 kDa de longitud completa a 20 UR a Rmáx. En otro modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, el valor de Rmáx se mantiene constante en el intervalo de temperatura de desde 13 ºC a 37 ºC por una optimización de la concentración de anticuerpo en las soluciones aplicadas al chip de resonancia de plasmón superficial de en base al peso del antígeno.

Se ha descubierto que para calcular los parámetros termodinámicos es esencial determinar la KD dependiente de la temperatura tan precisa como sea posible. Además, se ha descubierto sorprendentemente que el error de los parámetros termodinámicos calculados se puede reducir notablemente cuando se logra la saturación del analito-ligando durante la asociación del complejo para calcular un valor de Rmáx global, es decir, constante, para le evaluación de la KD de acuerdo con el modelo de Langmuir. Además se ha descubierto que, a temperaturas por debajo de 13 ºC, la cinética de asociación del sistema de captura es demasiado lenta para una respuesta de anticuerpo suficiente. Por debajo de 13 ºC y por encima de 37 ºC, la determinación de la cinética de unión a antígeno del anticuerpo proporciona datos no linealizables de acuerdo con las ecuaciones de van’t Hoff, Eyring y Arrhenius.

En un modo de realización, se realiza el cribado termodinámico a una temperatura de entre 13 ºC o 17 ºC y 37 ºC. Se ha descubierto que, en este intervalo de temperatura, es posible un cálculo sencillo de los datos de equilibrio termodinámico de acuerdo con la forma lineal de la ecuación de van’t Hoff y un cálculo sencillo de la termodinámica del estado de transición de acuerdo con las ecuaciones de Eyring lineal y de Arrhenius lineal (Wear, M.A., et al., Anal. Biochem. 359(2) (2006) 285-7; véase también la figura 5). En un modo de realización, se realizan todas las medidas bajo las mismas condiciones para realizar un cribado ultrarrápido (HTS) .

Para el cálculo se han usado las siguientes fórmulas para a) los cálculos de van’t Hoff: (II) ΔGº = ΔHº – T*ΔSº (III) ΔGº = – R*T*lnKD (IV) lnKD = -1/T * (ΔHº/R)/pendiente – (ΔSº/R)/intersección (V) R*T*lnKD – ΔHºT0 – T*ΔSºT0+ΔCºp(T-T0)-T*ΔCpº ln(T/T0) b) Fase de asociación de Eyring: (VI) ka = (kb*T/h)*e(-ΔGº‡/R*T) (VII) lnka/T = -1/T * (ΔHº‡/R)/pendiente + (ΔSº‡*R + lnkb/h)/intersección (VIII) ka = A*e-Ea/R*T (IX) lnka = InA/intersección – (1/T*Ea/R)/pendiente c) Fase de disociación de Eyring: (X) ka = (kb*T/h)*e(-ΔGº‡/R*T) (XI) lnkd/T = -1 /T * (ΔHº‡/R)/pendiente + (ΔSº‡/R + lnkB/h)/intersección (XII) kd = A*e-Ea/R*T (XIII) lnkd = InA/intersección – (1/T*Ea/R)/pendiente con ΔHº – entalpía de unión estándar, ΔSº – entropía de unión estándar, ΔGº – energía libre de Gibbs de unión estándar, T*ΔSº – térmico entrópico, ΔHº‡as – entalpía de unión de asociación estándar, ΔSº‡as – entropía de unión de asociación estándar, ΔGº‡as – energía libre de Gibbs de unión de asociación estándar, Ea as – Parámetro de Arrhenius para la asociación, ΔHº‡dis – entalpía de unión de disociación estándar, ΔSº‡dis – entropía de unión de disociación estándar, ΔGº‡dis – energía libre de Gibbs de unión de disociación estándar, Eadis – Parámetro de Arrhenius para la disociación, kD – constante de afinidad, ka – constante de velocidad de asociación, kb – constante de Boltzmann = (1,3806503 x 10-23 m2 kg s-2 K-1), kd – constante de velocidad de disociación, h – constante de Planck, Cp- capacidad calorífica molar.

Se ha descubierto sorprendentemente que usando un intervalo de temperatura simétricamente de alrededor de 25 ºC y en las etapas de +4 ºC (como en un modo de realización en las etapas de 13 ºC, 17 ºC, 21 ºC, 25 ºC, 29 ºC, 33 ºC, 37 ºC) es posible reducir el error absoluto de ΔHº, ΔHº‡as, ΔHº‡dis y ΔSº, ΔSº‡as, ΔSº‡dis (Zhukov, A., et al., J. Mol. Recognit. 20(5) (2007) 379-385). Para valores de ejemplo, véase la tabla 2.

Tabla 2: Parámetros termodinámicos ejemplares de los dos anticuerpos anti-PTH M 9.10.20 y M 1F8.

Anticuerpo 9.10.20 1F8 Parámetro Valor EE Valor EE ΔHº [kJ/mol] -100 9,3 53 1,3 ΔSº [J/(K*mol)] -180 31 350 4,3 T ΔSº [kJ/mol] -53 9,3 100 1,3 ΔGº [kJ/mol] -51 0,032 -51 0,0081 ΔHº‡ as. [kJ/mol] 0,39 33 1,2 ΔSº‡ as. [J/(K*mol)] -14 1,3 -35 4,1 T ΔSº‡ as. [kJ/mol] -4,3 0,39 -11 1,2 ΔGº‡ as. [kJ/mol] 49 0,0013 43 0,0078 Ea as. [kJ/mol] 47 0,39 1,2 ΔHº‡ dis. [kJ/mol] 150 9,1 -20 2,2 ΔSº‡ dis. [J/(K*mol)] 160 -380 7,4 TΔSº‡ dis. [kJ/mol] 49 9,1 -110 2,2 ΔGº‡ dis. [kJ/mol] 100 0,031 -94 0,014 Ea dis. [kJ/mol] 150 9,1 -18 2,2 La dependencia de la temperatura de la energía libre de Gibbs de unión ΔGº se calcula para cada temperatura en el intervalo de 13 ºC a 37 ºC con la fórmula ΔGº = – R*T*ln KD. Si el valor es constante, se usa la forma lineal de la ecuación de van’t Hoff. Si ΔGº cambia, es preferente la forma no lineal.

Las diferentes características de los diferentes anticuerpos anti-PTH se pueden observar a partir de los diagramas y se explican en los siguientes párrafos: a) El anticuerpo anti-PTH M D1.1 como se representa en la figura 4 a) muestra una alta afinidad y una disminución de la afinidad inducida por temperatura (KD) de una afinidad sub-nanomolar a 17 ºC a una afinidad nanomolar a 37 ºC. Esto se debe principalmente a una disminución en la estabilidad del complejo con antígeno a temperatura elevada. La velocidad de disociación cubre una disminución de dos órdenes de magnitud en la estabilidad del complejo. Tanto la constante de velocidad de asociación como la constante de velocidad de disociación se incrementan, es decir, se aceleran la asociación y también la disociación, dando como resultado una afinidad de unión menor global. En la figura 7 a) se representa la constante de velocidad de asociación ka [1/Ms], la constante de velocidad de disociación kd [1/s] y la temperatura [ºC] del anticuerpo anti-PTH M D1.1. El anticuerpo actúa termodinámicamente normal. Tanto la constante de velocidad de asociación como la constante de velocidad de disociación se aceleran con el incremento en la temperatura. La afinidad se calcula como el cociente de kd/ka = KD. El resultado es una afinidad que disminuye exponencialmente KD [M]. La pendiente del gráfico se vuelve negativo. Este anticuerpo no se seleccionaría con el procedimiento de acuerdo con la invención.

b) El anticuerpo anti-PTH M 9.3.1 como se representa en la figura 4 b) muestra una ligera disminución de la afinidad (KD) con el incremento en la temperatura, que permanece en el mismo orden de magnitud. La constante de velocidad de asociación ka se incrementa, de modo que la constante de velocidad de disociación kd fuertemente acelerada puede afectar mucho a la afinidad KD. El anticuerpo M 9.3.1 tiene una afinidad sub-nanomolar por un lado, pero muestra una falta de estabilidad del complejo antígeno-anticuerpo a temperatura elevada. Este anticuerpo es un ejemplo típico de un anticuerpo no seleccionado con el procedimiento de acuerdo con la invención. En la figura 7 b) se muestra la constante de velocidad de asociación ka [1/Ms], la velocidad de disociación kd [1/s] constante y la temperatura [ ºC] para el anticuerpo M 9.3.1. El anticuerpo actúa termodinámicamente normal, lo que significa que tanto la constante de velocidad de asociación como la constante de velocidad de disociación se aceleran con el incremento en la temperatura. La afinidad se calcula como el cociente de kd/ka = KD. El resultado es una afinidad que disminuye exponencialmente KD [M]. Este anticuerpo no se seleccionaría con el procedimiento de acuerdo con la invención.

c) El anticuerpo anti-PTH M 9.10.20 como se representa en la figura 6 a) muestra una aceleración de la constante de velocidad de asociación ka, es decir, un incremento de la velocidad de asociación, con el incremento en la temperatura. La constante de velocidad de asociación cubre dos órdenes de magnitud mientras que las constantes de velocidad de disociación se mantienen dentro de 1 orden de magnitud. El intervalo completo de energía cinética finalmente no se logra antes de 37 ºC. Puesto que la constante de velocidad de disociación kd acelera solo moderadamente, el anticuerpo M 9.10.20 es un ejemplo de un anticuerpo que se seleccionaría con un procedimiento de acuerdo con la invención. El anticuerpo proporciona una estabilidad de complejo alta a 37 ºC. En la figura 8 a) se representa la constante de velocidad de asociación ka [1/Ms], la constante de velocidad de disociación kd [1/s] y la temperatura [ºC] del anticuerpo M 9.10.20. El anticuerpo actúa termodinámicamente normal, pero la afinidad se mantiene constante en el intervalo de 13 ºC a 29 ºC y sólo disminuye ligeramente en el intervalo 29 ºC a 37 ºC. Aunque la velocidad de disociación se incrementa ligeramente a temperaturas más altas, este anticuerpo, no obstante, aún muestra una estabilidad del complejo con antígeno alta a 37 ºC y por lo tanto, es un resultado de cribado positivo obtenido con el procedimiento de acuerdo con la invención.

d) El anticuerpo anti-PTH M 1F8 como se representa en la figura 6 b) muestra un incremento de afinidad (disminuir KD) con el incremento de temperatura debido a una estabilidad del complejo antígeno-anticuerpo extremadamente alta (kd) a temperaturas elevadas. Debido a que la constante de velocidad de asociación ka se incrementa y la constante de velocidad de disociación kd disminuye, es decir, se ralentiza, se puede determinar un incremento en la afinidad a temperaturas más altas. El anticuerpo tiene una KD = 1,7 nM a 17 ºC y una KD = 0,4 nM a 37 ºC. Debido a que la constante de velocidad de disociación kd disminuye, el anticuerpo anti-PTH M 1 F8 es un ejemplo de un resultado de cribado positivo del procedimiento de acuerdo con la invención. Este anticuerpo proporciona la mayor estabilidad del complejo antígeno-anticuerpo a 37 ºC. En la figura 8 b) se representa la constante de velocidad de asociación ka [1/Ms], la constante de velocidad de disociación kd [1/s] y la temperatura [ºC] del anticuerpo M 1F8. Este anticuerpo muestra una anomalía termodinámica. La velocidad de asociación se acelera con el incremento en la temperatura, pero por el contrario, para los anticuerpos M 9.3.1, M D1.1 y M 9.10.20 la velocidad de disociación se reduce con el incremento en la temperatura. Esto da como resultado un incremento en la afinidad con el incremento en la temperatura. La pendiente de la curva se vuelve positiva. Este anticuerpo es un resultado de cribado positivo típico obtenido con el procedimiento de acuerdo con la invención.

Los datos obtenidos en el cribado termodinámico se pueden visualizar en una curva doble logarítmica como se representa en la figura 9 a) en la que las constantes de velocidad cinéticas (kas) ka [1/Ms] y (kdis) kd [1/s] se indican en el eje X y eje Y, respectivamente. Las líneas isométricas (líneas continuas) indican áreas de las mismas afinidades, que se representan en negrita en el lado derecho del diagrama. Puesto que el cociente de kd/ka proporciona la constante de equilibrio KD [M], cada punto de datos es equivalente a una afinidad a una temperatura respectiva. La flecha inferior simboliza el gradiente de temperatura en las etapas de +4 ºC, comenzando a 13 ºC o 17 ºC, respectivamente, y terminando a 37 ºC. Las tendencias de la afinidad dependiente de la temperatura de cada anticuerpo están conectadas por una línea. El cribado de la afinidad dependiente de la temperatura muestra que de los 34 anticuerpos representados sólo un anticuerpo muestra el comportamiento dependiente de la temperatura buscado (rombos negros). Dicho anticuerpo no se seleccionará con el procedimiento de acuerdo con la invención. Se muestran tres tendencias de afinidad ejemplares en la figura 9 b). En este mapa de velocidades, se muestran las KD en las etapas de +4 ºC de tres anticuerpos de ejemplo, en el que uno es un anticuerpo con un incremento en la afinidad con un incremento en la temperatura, otro es un anticuerpo con afinidad constante con un incremento en la temperatura, y otro es un anticuerpo con una disminución en la afinidad con un incremento de la temperatura. La mayoría de los anticuerpos muestran una pérdida de afinidad debido a una falta de estabilidad del complejo con antígeno (como los representados por el cuadrado en la figura 9 b)). La afinidad permanece constante cuando kas y kdis se incrementan (círculos). Por tanto, en un modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se selecciona un anticuerpo que muestra un incremento en kas y kdis con el incremento en la temperatura. En un modo de realización, kas se acelera y kdis se decelera, la afinidad se incrementa y el complejo gana estabilidad a temperaturas más altas (círculos negros). Por tanto, en un modo de realización del procedimiento, se selecciona un anticuerpo que muestra una aceleración de kas y una deceleración de kdis con el incremento en la temperatura en el intervalo de temperatura de desde 17 ºC a 37 ºC. El cribado ultrarrápido de las interacciones de anticuerpo-antígeno estables en temperatura es el núcleo del procedimiento ultrarrápido descrito. En un modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se selecciona un anticuerpo que tiene un incremento en la afinidad o una afinidad constante para un antígeno en el intervalo de temperatura de desde 17 ºC a 37 ºC. En el procedimiento de acuerdo con la invención, se seleccionan anticuerpos como estos. En otro modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se selecciona un anticuerpo que tiene un incremento en la afinidad para un antígeno en el intervalo de temperatura de desde 17 ºC a 37 ºC. Se usa la cinética dependiente de la temperatura para seleccionar anticuerpos con una estabilidad del complejo con antígeno potenciada.

El seguimiento de la cinética dependiente de la temperatura como se muestra en la figura 9 es la base para la selección de anticuerpos con una estabilidad del complejo con antígeno independiente de la temperatura o con incremento en la temperatura con el procedimiento de acuerdo con la invención.

Como ya se ha indicado anteriormente, los anticuerpos M 9.10.20 y M 1 F8 muestran una estabilidad del complejo dependiente de la temperatura y se seleccionarían con el procedimiento de acuerdo con la invención. En la figura 10 a), se representa la afinidad (KD) a 37 ºC de los anticuerpos con respecto a la afinidad a 25 ºC. Sólo un anticuerpo de la misma (N.º 8: anticuerpo anti-PTH M 1F8) muestra un incremento de su afinidad con el incremento en la temperatura. Las demás afinidades de los anticuerpos permanecen constantes o disminuyen. Cuando se observa la figura 10 b) se hace obvio porqué el índice de afinidad es sólo un punto del procedimiento descrito. En la figura 10 b) dos de los 13 anticuerpos anti-PTH muestran suficiente estabilidad del complejo con antígeno (N.º 8: anticuerpo anti-PTH M 1F8 y N.º 13: anticuerpo anti-PTH M 9.10.20). Estos anticuerpos se seleccionarían con el procedimiento de acuerdo con la invención. Por tanto, no se habría seleccionado el anticuerpo M 9.10.20 centrándose sólo en el índice de afinidad, puesto que puebla el corredor de correlación de la curva de afinidad en el lado izquierdo de la figura 10 a).

En la figura 5 en el lado izquierdo, se muestran curvas de datos ejemplares de los cálculos termodinámicos para el anticuerpo anti-PTH M D1.1. En el lado derecho de la figura 5, se muestran la ecuaciones correspondientes. El anticuerpo M D1.1 como ejemplo actúa de forma normal, lo que se verifica por las pendientes negativas de todas las linealizaciones.

La tabla 2 muestra que el anticuerpo M 9.10.20 es un aglutinante entálpico que tiene una entalpía de unión alta (ΔHº = -100 kJ/mol). El valor de entropía negativa alto (ΔSº = – 180 J/mol*K) surge en la fase de disociación (ΔSº‡dis = 160 J/K*mol). El anticuerpo M 1 F8 se lleva al equilibrio por fuerzas entrópicas (ΔHº = 53 kJ/mol, ΔSº = 350 J/mol*K).

Puesto que el anticuerpo M 1F8 incrementa su afinidad con el incremento en la temperatura, los parámetros ΔHº‡dis, ΔSº‡dis y Eadis se vuelven valores negativos (véase la tabla 2, columna derecha, últimas cinco filas). De hecho, esto hace que se deba congelar el complejo M 1F8/PTH para que se pueda disociar. Esto se puede ver como una anomalía termodinámica. Por lo tanto, los valores para el anticuerpo M 1F8 de la fase de disociación implican una corrección simplemente formal de las ecuaciones correspondientes. No obstante, ambos anticuerpos muestran la misma energía libre de Gibbs de unión (ΔGº = -51 kJ/mol). A pesar de las altas variaciones de entropía en el equilibrio, ambos anticuerpos muestran una fase de asociación entálpica y una carga entrópica negativa (M 9.10.20 ΔSº‡as = – 14 J/K*mol, M 1F8 ΔSº‡as = -35 J/K*mol). En un modo de realización, se selecciona un anticuerpo con una fase de asociación entálpica y una carga entrópica negativa. En ambos casos, la etapa limitante de la velocidad de la interacción anticuerpo-antígeno es la fase de disociación (M 9.10.20 ΔGº‡dis = 100 kJ/mol; M 1 F8 ΔGº‡dis kJ/mol = 94). Estos valores son más de doble de los valores de ΔGº‡as y reflejan el cribado cinético y la selección de acuerdo con la estabilidad del complejo con antígeno. Por lo tanto, en un modo de realización del procedimiento, el objetivo del cribado es seleccionar anticuerpos con una proporción ΔGº‡dis ΔGº‡as de al menos 2,3 o mayor. En un modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se selecciona un anticuerpo con una fase de disociación limitante de la velocidad o con una ΔGº‡dis de 80 kJ/mol o más.

En la figura 11, se muestran los parámetros termodinámicos en el equilibrio de 12 anticuerpos anti-PTH ejemplares, calculados de acuerdo con la ecuación de van’t Hoff (III). Los anticuerpos M 1 F8 (izquierda) y M 9.10.20 (derecha) muestran parámetros de equilibrio termodinámico, lo que hace que estos anticuerpos sean los anticuerpos seleccionados de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención. Entre los anticuerpos ejemplificados en la figura 11, los anticuerpos M 1F8 y M 9.10.20 tienen valores de -TΔSº altos. El anticuerpo M 1F8 muestra la mayor contribución entrópica positiva y el anticuerpo M 9.10.12 muestra la mayor contribución entrópica negativa para la interacción con antígeno. Por tanto, en un modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se selecciona un anticuerpo con un valor de -TΔSº de acuerdo con la ecuación de van’t Hoff (III) de a) – 80 kJ/mol o menos o b) de +40 kJ/mol o más. Los anticuerpos que llevan los números 2-10 de la figura 11 no seleccionarían por el procedimiento.

De acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención, se debe resolver el origen de la contribución entrópica. Esto se realiza por el cálculo de los parámetros termodinámicos en el estado de transición. Se ha descubierto que se ha de resolver la termodinámica del estado de transición con resolución temporal y, por tanto, el origen de las fuerzas impulsoras termodinámicas para seleccionar un anticuerpo con propiedades de unión independientes de la temperatura. Esto es particularmente importante para evaluar el riesgo de posibles tendencias de unión a antígeno promiscuas por la determinación de la entropía de unión ΔSº‡as. Por ejemplo, a pesar de que muestra un equilibrio de unión impulsado por entropía, el anticuerpo M 1F8- se caracteriza por una fase de asociación impulsada por entalpía (véase la figura 12 y la tabla 2). El anticuerpo M 9.10.20 se caracteriza por una fase de asociación impulsada por entalpía, además (véanse las figuras 12 y la tabla 2). Como ya se indica y se muestra en la figura 13, ambos anticuerpos M 1F8 y M 9.10.20 muestran una carga entrópica negativa ΔSº‡as. Se ha descubierto que esta carga entrópica indica que los anticuerpos correspondientes se asocian con el antígeno de manera entálpica, es decir, altamente específica. Una fase de asociación impulsada por entalpía se caracteriza por la formación de interacciones no covalentes con el antígeno, tales como enlaces de H, interacciones iónicas, interacciones de van der Waals, pero no se debe a movimientos de la cadena lateral de los aminoácidos o a una reorganización intensiva de las moléculas que rodean la capa de hidrato. Una carga entrópica negativa muestra que se reduce el grado de libertad conformacional del sistema. Después de la unión a antígeno, el complejo inmunitario se hace más rígido debido a ajustes estructurales o debido a un reordenamiento ordenado de las moléculas de agua, de lo que era antes de la formación del complejo. Esta característica se puede observar en una reactividad cruzada muy baja o incluso ausente del anticuerpo. Por tanto, un modo de realización del procedimiento de acuerdo con la presente invención es la selección de un anticuerpo con una fase de asociación impulsada por entalpía con baja o sin reactividad cruzada. Puesto que las contribuciones entrópicas al equilibrio de unión no surgen de las fases de asociación, deben provenir de la fase de disociación (véase la figura 14). Ambos anticuerpos, M 1F8 y M 9.10.20, muestran una gran variación entrópica ΔSº‡dis que se origina de la fase de disociación de antígeno. Por tanto, en un modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se selecciona un anticuerpo con una gran variación de entropía que viene de la fase de disociación. El anticuerpo M 1 F8 muestra la anomalía termodinámica, caracterizada por una variación de entropía negativa ΔSº‡dis = -380 J/K*mol. El anticuerpo M 9.10.20 muestra una gran variación de entropía positiva ΔSº‡dis = +160 J/K*mol. Por tanto, en un modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención, se selecciona un anticuerpo con un valor de ΔSº‡dis absoluto de 100 J/K*mol o más. En un modo de realización, se selecciona un anticuerpo con un valor de ΔSº‡dis absoluto de 150 J/K*mol o más. En un modo de realización, el valor de ΔSº‡dis absoluto está en el intervalo de 100 J/K*mol a 1000 J/K*mol. La entropía de unión negativa ΔSº‡as, la carga entrópica, durante la fase de asociación de antígeno, se correlaciona con una rápida velocidad de asociación del complejo y una baja energía de activación Eaas, lo que es típico de anticuerpos maduros altamente evolucionados (Thorpe, I.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(21) (2007) 8821-6). Por tanto, en un modo de realización, un anticuerpo seleccionado de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención es un anticuerpo que se une a un epítopo conformacional.

Por tanto, también es posible con los procedimientos de acuerdo con la invención seleccionar anticuerpos que tengan reactividad cruzada para diferentes antígenos, del mismo antígeno de diferentes especies, o bien de antígenos estrechamente relacionados, tales como IL-1a e IL-1b. También es posible seleccionar anticuerpos que introducen cambios conformacionales en el antígeno, que son útiles, por ejemplo, como anticuerpos catalíticos.

Se puede producir el anticuerpo de acuerdo con la invención. Los procedimientos para la producción recombinante de anticuerpos son conocidos en el estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procariotas y eucariotas con el posterior aislamiento del anticuerpo y normalmente la purificación a una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de los anticuerpos como se menciona anteriormente en una célula huésped, se insertan ácidos nucleicos que codifican las respectivas cadenas ligeras y pesadas en vectores de expresión por procedimientos estándar. La expresión se realiza en apropiado células huésped procariotas o eucariotas apropiadas como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6 (R), levaduras, o células de E.coli, y el anticuerpo se recupera de las células (sobrenadante o células después de la lisis). Los procedimientos generales para la producción recombinante de anticuerpos son bien conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

El término "célula huésped" como se usa en la presente solicitud indica cualquier tipo de sistema celular que se pueda diseñar para generar los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. En un modo de realización se usan células HEK293 y células CHO como células huésped. Como se usa en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultivo celular" se usan de forma intercambiable y dichas designaciones incluyen la progenie. Por tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto principal y los cultivos derivados de la misma, sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluye la progenie variable que tenga la misma actividad biológica o funcional a la cribada en la célula originalmente transformada.

La expresión en células NS0 se describe, por ejemplo, por Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria se describe, por ejemplo, por Durocher, Y., et al., Nucl. Acids Res. 30 (2002) E9. La clonación de dominios variables se describe por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Se informa de un sistema de expresión transitoria (HEK 293) por Schlaeger, E.-J., y Christensen, K., en Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y por Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan para ayudar a entender la presente invención, el verdadero alcance de ésta se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de las figuras Figura 1 Ilustración de la los datos de unión tardía (BL) y estabilidad tardía (SL) para los anticuerpos anti-PTH ejemplares.

Figura 2 Curva de Unión tardía/Estabilidad del complejo de 549 cultivos primarios de hibridoma: el punto de datos marcado con un círculo muestra una respuesta señal a antígeno suficiente y una estabilidad del complejo de un 100 %, mientras que el punto de datos marcado con un cuadrado muestra una respuesta a antígeno que no es suficiente.

Figura 3 Respuesta de anticuerpo secundario del sistema de captura de anticuerpo <IgGFCγM>R frente al anticuerpo anti-TSH monoclonal de analito a 25 nM, 50 nM, 75 nM y 100 nM y a temperaturas crecientes.

Figura 4 a) Sensogramas dependientes de la concentración ejemplares de la interacción anticuerpo-PTH dependiente de la temperatura del anticuerpo M D1.1. Se midió la cinética de HBS-EP pH 7,4 a 25 ºC, tiempo de asociación de 3 min., tiempo de disociación de 5 min., con ajuste de acuerdo con Langmuir; b) Sensogramas dependientes de la concentración ejemplares de la interacción anticuerpo-PTH dependiente de la temperatura del anticuerpo M D9.3.1. Se midió la cinética de HBS-EP pH 7,4 a 25 ºC, tiempo de asociación de 3 min., tiempo de disociación de 15 min., con ajuste de acuerdo con un modelo de Langmuir; Figura 5 Cálculo de los parámetros termodinámicos de acuerdo con las ecuaciones lineales de van’t Hoff, Eyring y Arrhenius. Curvas ejemplares mostradas para el anticuerpo M D1.1.

Figura 6 a) Sensogramas dependientes de la concentración ejemplares de la interacción anticuerpo-PTH dependiente de la temperatura del anticuerpo M 9.10.20. Se midió la cinética de HBS-EP pH 7,4 a 25 ºC, tiempo de asociación de 3 min., tiempo de disociación de 15 min., con ajuste de acuerdo con Langmuir; b) Sensogramas dependientes de la concentración ejemplares de la interacción anticuerpo-PTH dependiente de la temperatura del anticuerpo M 1F8. Se midió la cinética de HBS-EP pH 7,4 a 25 ºC, tiempo de asociación de 3 min., tiempo de disociación de 5 min., con ajuste de acuerdo con un modelo de Langmuir; Figura 7 a) Mapa de velocidad tridimensional de los datos del anticuerpo M D1.1.

b) Mapa de velocidad tridimensional de los datos del anticuerpo M 9.3.1.

Figura 8 a) Mapa de velocidad tridimensional de los datos del anticuerpo M 9.10.20; b) Mapa de velocidad tridimensional de los datos del anticuerpo M 1F8.

Figura 9 a) Curva doble logarítmica de las características dependientes de la temperatura de 34 anticuerpos ejemplares; b) curva doble logarítmica de las características dependientes de la temperatura de tres anticuerpos ejemplares: círculos negros – anticuerpo con incremento en la afinidad con incremento en la temperatura, círculos blancos – anticuerpo con afinidad constante con incremento en la temperatura, cuadrados – anticuerpo con disminución en la afinidad con incremento en la temperatura.

Figura 10 a) Curva de afinidad de 13 anticuerpos anti-PTH del cribado de PTH que indica afinidades a 25 ºC (eje X) y 37 ºC (eje Y). b) Curva de constante de velocidad de disociación de los mismos anticuerpos que en a) a 25 ºC (eje X) y 37 ºC (eje Y).

Figura 11 Curva de la termodinámica en el equilibrio de 12 anticuerpos anti-PTH anticuerpos ejemplificados calculada de acuerdo con van’t Hoff.

Figura 12 Curva termodinámica del estado de transición de las entalpías de activación ΔHº‡as de 12 anticuerpos anti-PTH ejemplificados calculada de acuerdo con la ecuación de Eyring.

Figura 13 Curva termodinámica del estado de transición de la entropía de activación ΔSº‡as (carga entrópica) calculada de acuerdo con la ecuación de Eyring.

Figura 14 Curva termodinámica del estado de transición de la entropía de disociación ΔSº‡dis de 13 anticuerpos anti-PTH ejemplares calculada de acuerdo con la ecuación de Eyring.

Figura 15 Medidas dependientes de la concentración y de la temperatura de interacciones: a) debidas a una cinética de captura no homogénea en el gradiente de temperatura, el valor de RMáx varía y no se logra el equilibrio en ninguna etapa de temperatura durante las fases de asociación de los diferentes sensogramas; b) debidas una concentración de mAb adaptada y fases de asociación prolongadas los valores de RMáx son homogéneos, el equilibrio se logró a temperaturas > 35 ºC.

Ejemplo 1 Inmunización de ratones Se sometieron a inmunización intraperitoneal ratones Balb/c de 8-12 semanas con 100 μg de derivados de PTH recombinante humana (hormona paratiroidea) formulados como una fusión de KLH (hemocianina de lapa hemocianina) en coadyuvante de Freud completo. Se usaron fragmentos de PTH N-terminales y C-terminales recombinantes así como PTH de longitud completa (1-84) como antígenos. Se produjeron sintéticamente derivados de PTH por síntesis peptídica.

Se realizó la inmunización 4 veces: refuerzo inicial, 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del refuerzo inicial. Se realizó la segunda y tercera inmunización usando coadyuvante de Freud incompleto. Se realizó i.v. el refuerzo final usando 100 μg de antígeno tres días antes de que tuviera lugar la fusión de hibridoma. Se realizó la producción de cultivos primarios de hibridoma de acuerdo con Köhler y Milstein (Kohler, G., et al., Nature 256 (5517) (1975) 495-497).

Se aislaron los hibridomas en placas de microvaloración de 96 pocillos (MTP), por dilución limitada y se cribaron para detectar la unión a antígeno por procedimientos ELISA de acuerdo con el manual del fabricante. Se transfirieron los cultivos de células de hibridoma primarios, que mostraron formación de color positiva tras la unión a antígeno en ELISA, en el procedimiento de cribado cinético.

Ejemplo 2 Preparación del chip de sensor CM5 El sistema BIAcore A100 bajo el control del programa informático V.1.1 se preparó como sigue: Se montó un sensor BIAcore CM5 (serie S) en el sistema y se trató hidrodinámicamente de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se inmovilizó un anticuerpo IgG de conejo policlonal (<IgGFCγM>R, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., EE. UU.) a 30 μg/ml a 10.000 UR sobre los puntos 1, 2, 4 y 5 en las celdas de flujo 1, 2, 3 y 4 por medio de química EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando tampón acetato de sodio 10 mM pH 4,5 como tampón pre-concentración. Finalmente, se bloqueó la superficie del sensor con etanolamina.

Ejemplo 3 Cribado cinético de sobrenadantes de cultivo de hibridomas primarios Se procesaron sobrenadantes de cultivo de hibridomas de diferentes campañas de inmunización de PTH llevados a cabo de acuerdo con el ejemplo 1, como se indica a continuación.

Se usaron los puntos 2 y 4 de un chip de sensor obtenido de acuerdo con el ejemplo 2 como referencia (1-2, 5-4). Con el fin capturar el anticuerpo sobre la superficie del sensor, se diluyeron 1:5 sobrenadantes de cultivo de hibridomas con tampón de desplazamiento HBS-EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, P20 al 0,05 %, BIAcore) y se inyectaron en 30 μl/min durante 1 min. Posteriormente, se inyectó el antígeno respectivo a 30 μl/min durante un tiempo de asociación de 2 min. Se realizó un seguimiento de la fase de disociación durante 5 min. Finalmente, se regeneró la superficie con una inyección de 2 min. de ácido fosfórico 100 mM.

Se preacondicionó el sensor por ciclos repetidos de captura de anticuerpo y regeneración. Se inyectó repetidamente el anticuerpo monoclonal de ratón mAb<TSH>M-1.20 IgGlk (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) durante 2 min. a 30 μl/min a 50 nM en HBS-EP y se regeneró el chip usando H3PO4 100 mM por una inyección de 2 min. a 30 μl/min.

Para la selección de hibridomas primarios se usó el siguiente procedimiento: Se estableció un punto de referencia de unión tardía (BL) poco antes de que finalizara la inyección del antígeno. Se estableció un punto de referencia de estabilidad tardía (SL) poco antes de la finalización de la fase de disociación del complejo. Se visualizaron gráficamente los datos de BL y SL (figura 1). Se usaron los datos para calcular la estabilidad del complejo con antígeno usando la fórmula (I): (I) (1-[BL (UR) – SL (UR) / BL (UR)]) (véase la figura 2). Por ejemplo, los puntos de datos marcados con un círculo muestran una señal de respuesta a antígeno suficiente y una estabilidad del complejo de un 100 %, mientras que punto de datos marcado con un cuadrado muestra una respuesta a antígeno que no es suficiente.

Por tanto, se han seleccionado los mejores hibridomas al 10 % de acuerdo con la señal de respuesta a antígeno y la estabilidad del complejo.

Ejemplo 4 Clonación de hibridomas y producción de anticuerpos Se subclonaron cultivos primarios de hibridomas que producen anticuerpos anti-PTH, que se seleccionaron en el ejemplo 3, usando el clasificador de células FACSAria (Becton Dickinson) bajo el programa informático de control V4.1.2. Se incubaron los clones individuales depositados bajo condiciones adecuadas para la proliferación adicional en placas de 24 pocillos y se transfirieron posteriormente al procedimiento de cribado termodinámico de acuerdo con el ejemplo 5 después de haber determinado la concentración de anticuerpo usando los procedimientos ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 5 Cribado termodinámico de sobrenadantes de cultivo de hibridomas secundarios Después del cribado cinético, en el que se han identificado células de hibridoma secretoras de anticuerpos con estabilidad de complejo anticuerpo-antígeno alta, se caracterizaron adicionalmente los anticuerpos secretados por un cribado termodinámico empleando la determinación de la cinética dependiente de la temperatura para determinar la termoestabilidad del complejo antígeno-anticuerpo y para calcular las propiedades termodinámicas.

Se montó un sensor CM5 serie S en un sistema BIAcore T100 controlado con el programa informático de control V1.1.1 y se preacondicionó en una inyección de 1 min. a 100 μl/min de una mezcla que comprende SDS al 0,1 %, NaOH 50 mM, HCl 10 mM y H3PO4 100 mM.

En caso de cribar anticuerpos de origen murino, se inmovilizó un anticuerpo anti-murino-IgG de conejo policlonal (<IgGFCyM>R, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., EE. UU.) a 30 μg/ml a 6.000 UR en células de flujo 1,2,3,4 con química EDC/NHS de acuerdo con las instrucciones del fabricante usando tampón acetato de sodio 10 mM pH 4,5 como tampón pre-concentración. Finalmente, se bloqueó la superficie del sensor con etanolamina.

Como anticuerpo de referencia, se valoró de forma dependiente de la temperatura el anticuerpo anti-TSH monoclonal murino 1.20 (IgG1k, ratón) a diferentes concentraciones en el sistema de captura preparado anteriormente para determinar la capacidad de captura del sistema (véase la figura 3).

Tabla 3: Niveles de respuesta del anticuerpo anti-TSH monoclonal murino 1.20 a diferentes concentraciones bajo temperaturas crecientes en el sistema de captura de anticuerpo <IgGFCγM>R.

UR en ºC: AK_nM 17 ºC 21 ºC 25 ºC 29 ºC 33 ºC 37 ºC TSH_25 91 106 122 137 153 170 TSH_50 187 206 226 248 273 295 TSH_75 225 248 270 293 318 340 TSH_100 270 292 315 342 369 394 Se usaron estos valores de concentración del anticuerpo anti-TSH monoclonal murino 1.20 como referencia para el cálculo de la captura de anticuerpo a partir de los cultivos de hibridoma para lograr niveles de respuesta de anticuerpo secundario similares a diferentes temperaturas.

Se realizaron medidas cinéticas a diferentes temperaturas a 20 μl/min., el caudal fue de 30 μl/min., 50 μl/min., 100 μl/min., respectivamente. Se realizó la inyección de muestra de PTH 1-84 de longitud completa sintético recombinante (9,4 kDa) durante 30 s, 90 s, 180 s, respectivamente, u otros tiempos de inyección adecuados para lograr la saturación de ligando o la entrada en el equilibrio de unión durante la fase de asociación del complejo (véase la figura 4 a)). Se sometió a seguimiento la velocidad de disociación en primer lugar durante hasta 300 s. y adicionalmente durante 15 min (véase la figura 4 b)). Se repitieron las inyecciones de PTH en diferentes etapas de concentración de al menos cinco concentraciones. Como control, se analizó una etapa de concentración dos veces para controlar la reproducibilidad del ensayo. La célula de flujo 1 sirvió como referencia. Se usó una inyección de tampón en lugar de una inyección de antígeno para una referencia doble de los datos por sustracción de la señal de tampón. Se regeneró el sistema de captura usando H3PO4 100 mM por una inyección de 2 min. a 100 μl/min. Se optimizó el procedimiento de regeneración para garantizar la regeneración de superficie cuantitativa también a 13 ºC, 17 ºC y 21 ºC. A estas temperaturas, se inyectó tres veces la solución de regeneración mientras que a 25 ºC, 29 ºC, 33 ºC y 37 ºC la solución de regeneración se inyectó una vez.

Se evaluaron los datos obtenidos de acuerdo con un modelo de interacción de Langmuir binario 1:1 para calcular la constante de velocidad de asociación ka [1/Ms], la constante de velocidad de disociación kd [1/s] y la constante de afinidad resultante KD [M] a diferentes temperaturas. Se calcularon los datos del equilibrio termodinámico de acuerdo con la forma lineal de la ecuación de Van’t Hoff. Se calculó la termodinámica en el estado de transición de acuerdo con las ecuaciones de Eyring y Arrhenius usando, por ejemplo, el programa informático de evaluación de BIAcore T100 V.1.1.1 o el programa Origin 7sri v. 7.0300.

Ejemplo 6 Ejemplo para la necesidad de ajustar valores de RMAX homogéneos Se montó el dispositivo BIAcore T100 con un sensor BIAcore CM5 series-S, y se inmovilizó con 6000 UR <IgGFCyM>R (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., EE. UU.) en cada célula de flujo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El experimento no optimizado usó anticuerpo de captura 40 nM a 20 μl/min., en tampón HBS-EP (0,05 %, P20). El tampón de muestra fue el tampón del sistema, complementado con 1 mg/ml de CMD.

Se inyectó el antígeno después de la captura del anticuerpo secundario en 6 etapas de concentración de 1,2 nM, 4 nM, 11 nM, 33 nM, 100 nM y 300 nM, de este modo se usó 11 nM como control doble y se usó 0 nM como referencia. Se inyectó el antígeno a 100 μl/min durante una asociación de 2 min. y una disociación de 5 min., seguido de un lavado HBS-EP de 15 min. a 30 μl/min. y una regeneración con glicina 10 mM pH 1,7 a 3 μl/min durante 3 min. Se realizaron medidas dependientes de la concentración a 4 ºC, 11 ºC, 18 ºC, 25 ºC, 32 ºC y 40 ºC.

Se usó el sistema optimizado como se describe anteriormente, pero con la excepciones de que se inyectó el anticuerpo que se va a capturar durante un tiempo de asociación de 3 min. a etapas de concentración diferentes de 100 nM a 15 ºC, 80 nM a 20 ºC, 60 nM a 25 ºC, 50 nM a 30 ºC, 40 nM a 35 ºC y 40 nM a 40 ºC.

Finalmente, se determinaron la cinética y la termodinámica usando el programa informático de evaluación BIAcore.

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento para la selección de un anticuerpo de unión a antígeno independiente de la temperatura de entre una pluralidad de anticuerpos, por lo que se selecciona un anticuerpo con una entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) de menos de 10 J/K*mol y una entropía de unión estándar absoluta (ΔSº) de 100 J/mol*K o más.

2.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado por que la temperatura está en el intervalo de desde 13 ºC a 37 ºC.

3.

Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado por que el procedimiento comprende una etapa de cribado cinético y una etapa de cribado termodinámico.

4.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado por que el cribado termodinámico se realiza a una temperatura de entre 13 ºC y 37 ºC.

5.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado por que el cribado termodinámico se realiza a 13 ºC, 17 ºC, 21 ºC, 25 ºC, 29 ºC, 33 ºC y 37 ºC.

6.

Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que se selecciona un anticuerpo con a) una entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) de menos de 10 J/K*mol, b) una entropía de unión de disociación estándar absoluta (ΔSº‡dis) de 100 J/mol*K o más, c) una entropía de unión de estándar absoluta (ΔSº) de 100 J/mol*K o más.

7.

Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) es de menos de 5 J/K*mol.

8.

Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado por que la entropía de unión de asociación estándar (ΔSº‡as) es de menos de 0 J/K*mol.

9.

Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por que la entropía de unión de disociación estándar absoluta (ΔSº‡dis) es de 125 J/mol*K o más.

10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado por que la entropía de unión de disociación estándar absoluta (ΔSº‡dis) es de 150 J/mol*K o más.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que la entropía de unión estándar absoluta (ΔSº) es de 125 J/mol*K o más.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado por que la entropía de unión estándar absoluta (ΔSº) es de 150 J/mol*K o más.

13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que se selecciona un anticuerpo con una entalpía de unión estándar libre (ΔGº) de -50 kJ/mol o menos.

14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que se selecciona un anticuerpo con una proporción de la energía libre de Gibbs de unión de disociación estándar (ΔGº‡dis) con respecto a la energía libre de Gibbs de unión de asociación estándar (ΔGº‡as) de más de 2,3.

15. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que se selecciona un anticuerpo con un valor -TΔSº de a) 80 kJ/mol o menos, o b) de + 40 kJ/mol o más.

] R

í a [ U

t a r d

n i ó n U

Estabilidad tardía [UR]

] R

í a [ U

t a r d

n i ó n U

Estabilidad del complejo [%]

a i c

a n t i c u e r p o s

p t r ó n e a r g a C