Copolímeros de injerto para la cromatografía de intercambio catiónico.

Materiales de separación para la cromatografía de intercambio iónico basados en soportes de base concontenido en grupos hidroxilo en cuya superficie están unidos covalentemente copolímeros,

caracterizadosporque

a) el soporte de base contiene grupos hidroxilo 5 alifáticos,

b) los copolímeros unidos covalentemente están unidos al soporte a través de una unidad monoméricaterminal,

c) los copolímeros contienen al menos dos unidades monoméricas diferentes,

d) las unidades monoméricas están enlazadas de forma lineal,

e) el copolímero contiene al menos una unidad monomérica que lleva una carga negativa en forma de unácido sulfónico o ácido carboxílico y contiene, además, grupos éster o amida y grupos alquilo y/o alquilenoy, como máximo, un total de 8 átomos de C pero ningún grupo arilo, o que lleva una carga negativa enforma de un ácido sulfónico o ácido carboxílico y contiene, además, grupos alquilo y/o alquileno peroningún grupo arilo,

f) el copolímero contiene al menos una unidad monomérica que como grupo hidrófobo lleva alquilo decadena lineal o ramificado con 4 a 18 átomos de C o grupos arilo correspondientes y contiene grupos éstero amida, y

g) la relación entre las unidades monoméricas de carga negativa y las unidades monoméricas con gruposhidrófobos se encuentra en el intervalo de 99:1 a 10:90.

Copolímeros de injerto para la cromatografía de intercambio catiónico La invención se refiere a un material de separación con una capacidad de unión mejorada, a su preparación y a su uso para la separación de biopolímeros cargados a partir de líquidos.

Estado de la técnica

La cromatografía es uno de los métodos más adecuados para el aislamiento de proteínas. Por ejemplo, se pueden purificar anticuerpos monoclonales mediante una cromatografía de afinidad con ligandos de proteína A. La unión a los ligandos del sobrenadante del cultivo celular se puede realizar sin ajustar el valor de pH ni la concentración de sal. Aún así, estos sorbentes se pueden utilizar sólo de forma limitada debido a sus elevados costes y al desprendimiento del ligando.

El uso de resinas de intercambio de iones de alta capacidad es una alternativa económica. Sin embargo, debe reducirse la conductancia en el sobrenadante del cultivo celular para que se produzca una unión al intercambiador de iones. Esto se puede efectuar mediante una desalinización o por dilución del sobrenadante. Ambas opciones son indeseables, en particular en procesos de producción de gran volumen.

En presencia de sales (conductancia elevada) las cargas quedan apantalladas. Para posibilitar aún así la unión a un intercambiador de iones a una conductancia mayor, debe existir, además de la interacción iónica, al menos una segunda interacción entre la proteína y el soporte cromatográfico.

En la bibliografía se conocen materiales de separación que, además de un grupo aniónico, presentan grupos funcionales adicionales y se unen a biopolímeros en presencia de sal.

A partir del documento US 5, 652, 348 (Burton y col.) se conocen resinas cromatográficas y su aplicación, las cuales se obtienen por modificación hidrófoba de ligandos ionizables con ligandos no ionizables. La unión se produce en condiciones que fomentan la interacción hidrófoba. La desorción tiene lugar a otro pH, de manera que la resina se vuelve hidrófila o recibe una carga y la proteína unida (de igual carga) es rechazada.

Burton y col. (Biotechnology and Bioengineering 1997, 56, 45-55) describen la purificación de quimosina en una matriz carboxílica que ha sido modificada parcialmente por acoplamiento con una amina aromática.

En el documento EP 1 094 899 se da a conocer un procedimiento para la separación de biomoléculas, especialmente de proteínas, con intercambiadores de cationes, que se caracteriza porque la unión se produce a >15 mS/cm y la elución a una fuerza iónica mayor. El ligando intercambiador de cationes está unido a través del segundo grupo funcional y de un espaciador a una matriz de soporte.

En el documento US 7, 067, 059 se reivindica un procedimiento para la preparación de geles cromatográficos con ligandos intercambiadores catiónicos de modo mixto, en el que la preparación se realiza usando compuestos de homocisteína cíclicos que, por apertura del anillo, conducen a agrupaciones con al menos dos grupos funcionales.

En los documentos US 6, 852, 230 y EP 1 345 694 se describe y reivindica el uso de intercambiadores de iones para la unión y la separación de biomoléculas cargadas con estructura peptídica, en el que después del paso de desorción está presente una solución sin sal o más pobre en sal, de modo que al mismo tiempo se produce una desalinización.

En el documento US 7, 008, 542 se reivindica un procedimiento para la separación de una sustancia, en particular de moléculas bioorgánicas con un peso molecular superior a 1.000 Dalton, que se realiza usando una matriz de soporte. Esta última presenta al menos dos ligandos estructuralmente diferentes, siendo al menos un ligando un intercambiador de iones. Los ligandos típicos poseen una masa molecular <1.000 Da.

En el documento US 7, 144, 743 se describe un ligando policíclico para cromatografía que está sustituido con un grupo aniónico.

Desde hace muchos años se conocen polímeros lineales funcionalizados que se obtienen injertando monómeros funcionalizados correspondientes sobre numerosas superficies diferentes. Cuando en el caso de la funcionalización se trata de agrupaciones aniónicas ligadas químicamente se pueden usar los materiales correspondientes para la cromatografía de intercambio catiónico (W. Müller, J. Chromatography 1990, 510, 133-140) . En las patentes EP 0 337 144 o US 5, 453, 186 se encuentra un gran número de estructuras poliméricas de injerto posibles que están previstas para el fraccionamiento de biopolímeros. A partir de la bibliografía de patentes también se conocen

polímeros de injerto formados por más de un elemento estructural monomérico y que se obtienen por copolimerización. Sin embargo, en la bibliografía se profundiza poco en la combinación de los monómeros: Para obtener intercambiadores adecuados, los monómeros para la copolimerización se deberán seleccionar de tal manera, que ambos monómeros presenten grupos o bien básicos o bien ácidos, o uno de los monómeros sea neutro. No se mencionan explícitamente mezclas ternarias de monómeros o modificaciones químicas de los polímeros de injerto.

En Biomacromolecules 2003, 4, 273-282, se ha estudiado y discutido la interacción entre proteínas y polielectrolitos sintéticos libres o solubles, como, por ejemplo, entre poli (ácido acrílico) modificado de forma hidrófoba y BSA.

A partir de la bibliografía de patentes y revistas se conocen, pues, muchos enfoques para la modificación de intercambiadores de cationes. También se conocen diferentes métodos para la preparación de adsorbentes con ligandos que trabajan en modo mixto. Sin embargo, sólo existen pocos adsorbentes comerciales adecuados para unir proteínas y, especialmente, anticuerpos a partir de sobrenadantes de cultivos celulares.

El gel cromatográfico descrito en el documento US 7, 144, 743, derivatizado con ácido 2-mercapto-5benzimidazolsulfónico como ligando, puede enlazar hasta 30 mg/ml de IgG. En mediciones propias con Gammanorm, usando un producto correspondiente distribuido en el mercado bajo el nombre MBI HyperCel®, se encontró una unión de 23 mg/ml a pH 5 y NaCl 140 mM (pico no retenido del 10%) .

En el caso de otro producto comercializado por la misma empresa se aprovecha la cromatografía hidrofóbica inducida por carga (Hydrophobic Charge Induction Chromatography, HCIC) . Con este producto se pueden enlazar hasta aproximadamente 32 mg/ml de IgG humana policlonal.

Con el uso de otro producto disponible en el mercado, comercializado bajo el nombre de Capto MMC®, se obtuvo para la IgG humana una capacidad de unión dinámica (pico no retenido del 10%) de 7 mg/ml a pH 5, 5 y NaCl 150 mM. Para la preparación del producto descrito en el documento US 7, 067, 059 se usa un ligando multimodal. Este gel, sin embargo, no se desarrolló específicamente para anticuerpos y enlaza 45 mg/ml de BSA.

Además, existen otros productos disponibles en el mercado con ligandos sintéticos que sólo pueden enlazar anticuerpos a partir de soluciones tamponadas. Cuando se aplican para el tratamiento de sobrenadantes de cultivos celulares se obtiene una unión insatisfactoria o nula. Este resultado se debe probablemente a componentes del sobrenadante del cultivo celular que interfieren.

Sigue siendo necesario proporcionar adsorbentes para la purificación de anticuerpos, que tengan ventajas respecto a la capacidad, el rendimiento, la rentabilidad o la selectividad (J. Chromatography B 2007, 848, 48 – 63) . Los polímeros son en sí extraordinariamente adecuados para la modificación superficial de soportes cromatográficos, puesto que existe un amplio surtido de grupos funcionales para elegir, especialmente también para la formación de materiales multifuncionales, y se pueden formar capas gruesas con un gran número de grupos funcionales. En particular, se pueden producir materiales cromatográficos de alta capacidad recubriendo la superficie con una capa polimérica “blanda” (J. Chromatography 1993, 631, 107 - 114) .

Sin embargo, hasta la fecha no se conocen materiales de separación que se puedan preparar mediante un procedimiento de fácil realización usando materiales de partida económicos y que, al aplicarlos para la separación de sobrenadantes de cultivos celulares o de otros líquidos biológicos, sin reducción significativa de las conductancias, presenten actividades de separación tan elevadas, especialmente en lo referente a anticuerpos monoclonales, que sean adecuados para una aplicación a escala técnica.

Objetivo El objetivo de la presente invención es, por lo tanto, proporcionar un material de separación que presente capacidades de unión mejoradas para proteínas,... [Seguir leyendo]

1. Materiales de separación para la cromatografía de intercambio iónico basados en soportes de base con contenido en grupos hidroxilo en cuya superficie están unidos covalentemente copolímeros, caracterizados porque

5 a) el soporte de base contiene grupos hidroxilo alifáticos,

b) los copolímeros unidos covalentemente están unidos al soporte a través de una unidad monomérica terminal,

c) los copolímeros contienen al menos dos unidades monoméricas diferentes,

d) las unidades monoméricas están enlazadas de forma lineal,

10 e) el copolímero contiene al menos una unidad monomérica que lleva una carga negativa en forma de un ácido sulfónico o ácido carboxílico y contiene, además, grupos éster o amida y grupos alquilo y/o alquileno y, como máximo, un total de 8 átomos de C pero ningún grupo arilo, o que lleva una carga negativa en forma de un ácido sulfónico o ácido carboxílico y contiene, además, grupos alquilo y/o alquileno pero ningún grupo arilo,

15 f) el copolímero contiene al menos una unidad monomérica que como grupo hidrófobo lleva alquilo de cadena lineal o ramificado con 4 a 18 átomos de C o grupos arilo correspondientes y contiene grupos éster o amida, y

g) la relación entre las unidades monoméricas de carga negativa y las unidades monoméricas con grupos hidrófobos se encuentra en el intervalo de 99:1 a 10:90.

20 2. Materiales de separación según la reivindicación 1, caracterizados porque

a) el soporte de base contiene grupos hidroxilo alifáticos,

b) los copolímeros unidos covalentemente están unidos al soporte a través de una unidad monomérica terminal,

c) los copolímeros contienen al menos dos unidades monoméricas diferentes,

25 d) las unidades monoméricas están enlazadas de forma lineal,

e) el copolímero presenta al menos una unidad monomérica de carga negativa, bien de fórmula general (1)

O

HC C C N Y

R1 R2 R3 (1)

en la que significan

R1, R2 e Y independientemente entre sí

30 H o CH3,

R3 R4-SO3M o R4-COOM,

R4 alquileno de cadena lineal o ramificado con 2 a 4 átomos de C y

M H, Na, K o NH4,

bien de fórmula general (2)

O HCCC OZ

R7 R8

(2) en la que significan R7 y R8 independientemente

H o CH3, o R7 COOM cuando Z =M y R8 =H, Z o bien M, R4-COOM o bien R4-SO3M con R4 alquileno de cadena lineal o ramificado con 2 a 4 átomos de C, y

M H, Na, K o HN4, presenta en cada caso al menos una unidad monomérica de fórmula general 1 y de fórmula general (2) y f) el copolímero presenta al menos una unidad monomérica con un grupo hidrófobo de fórmula general 1

que confiere al copolímero un carácter hidrófobo, en la que significan

R1 H o COOM, R2 H o CH3, Y y R3 alquilo de cadena lineal o ramificado con hasta 18 átomos de C, donde Y y R3 llevan juntos al menos 6 átomos de C, o Y H y R3 alquilo de cadena lineal o ramificado con 6 a 18 átomos de C o Y H y

R3 arilo o R6-arilo o Y H o CH3 y

R3 R4-CONHX,

X alquilo de cadena lineal o ramificado con 6 a 18 átomos de C, arilo o R6-arilo

5 R4 alquileno de cadena lineal o ramificado con 2 a 4 átomos de C R6 alquileno de cadena lineal o ramificado con 1 a 4 átomos de C, en el que un grupo metileno puede estar reemplazado por O y puede estar sustituido con COOM

y

M H, Na, K o NH4,

o una unidad monomérica correspondiente de fórmula general (2) ,

10 en la que significan R7 H,

R8 H o CH3,

Z alquilo de cadena lineal o ramificado con 4 a 18 átomos de C, arilo, R6-arilo o R4-CONHX,

15 X alquilo de cadena lineal o ramificado con 6 a 8 átomos de C, arilo, R6-arilo

y R6 un alquileno de cadena lineal o ramificado con 1 a 4 átomos de C,

y

20 g) la relación entre las unidades monoméricas de carga negativa y las unidades monoméricas con un grupo hidrófobo se encuentra en el intervalo de 99:1 a 10:90.

3. Materiales de separación según la reivindicación 1 o 2, caracterizados porque

c) los copolímeros contienen al menos dos unidades monoméricas diferentes,

25 e) el copolímero presenta al menos una unidad monomérica de carga negativa de la serie ácido 2acrilamido-2-metilpropanosulfónico, ácido 2-acrilamidoetanosulfónico, carboximetilacrilamida, carboxietilacrilamida, carboxipropilacrilamida, carboximetilmetacrilamida, carboxietilmetacrilamida, carboxipropilmetacrilamida, ácido maleico, ácido acrílico y ácido metacrílico y

f) el copolímero presenta al menos una unidad monomérica con un grupo hidrófobo de fórmula general (1)

O

HC C C N Y

R1 R2 R3 (1)

30 en la que significan R1 H,

R2 H o CH3,

Y H

y R3 arilo o R6-arilo,

5 o

Y H o CH3

y R3 R4-CONHX con

10 X arilo o R6-arilo, R4 metileno, etileno, propileno y R6 un alquileno de cadena lineal o ramificado con 1 a 4 átomos de C, en el que un grupo metileno puede estar reemplazado por O y estar sustituido con COOM

y

M H, Na, K o NH4.

15 4. Materiales de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizados porque

c) los copolímeros contienen al menos dos unidades monoméricas diferentes,

20 e) el copolímero presenta al menos una unidad monomérica de carga negativa de la serie ácido 2-acrilamido-2-metilpropanosulfónico, ácido 2-acrilamidoetanosulfónico, carboximetilacrilamida, carboxietilacrilamida, carboxipropilacrilamida, carboximetilmetacrilamida, carboxietilmetacrilamida, carboxipropilmetacrilamida, ácido maleico, ácido acrílico y ácido metacrílico y

f) el copolímero presenta al menos una unidad monomérica con un grupo hidrófobo de fórmula general (1)

O

HC C C N Y

R1 R2 R3 (1)

25 en la que significan R1 H, R2 H o CH3,

Y H

y R3 fenilo, bencilo, feniletilo o fenoxietilo,

o

30 Y H o CH3

y

R3 R4-CONHX con X fenilo, bencilo o feniletilo y

R4 metileno, etileno, propileno acriloilfenilglicina o acriloilfenilalanina.

5. Material de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a) el copolímero contiene como unidad monomérica de carga negativa ácido 2-acrilamido-2metilpropanosulfónico o/y ácido 2-acrilamidoetanosulfónico,

b) la relación entre las unidades monoméricas de carga negativa y las unidades monoméricas con un 10 grupo fenilo, bencilo o feniletilo hidrófobo se encuentra en el intervalo de 70: 30 a 30: 70.

6. Material de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a) el copolímero contiene como unidad monomérica de carga negativa ácido acrílico o/y ácido metacrílico y

b) la relación molar entre las unidades monoméricas de carga negativa y las unidades monoméricas con un grupo fenilo, bencilo o feniletilo hidrófobo se encuentra en el intervalo de 95:5 a 70:30.

7. Material de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque a) el copolímero contiene un monómero de la serie ácido 2-acrilamido-2-metilpropanosulfónico y ácido 2acrilamidoetanosulfónico como unidad monomérica de carga negativa y

b) un monómero de la serie ácido acrílico y ácido metacrílico y

b) la relación molar entre las unidades monoméricas de carga negativa y las unidades monoméricas con 20 un grupo fenilo, bencilo o feniletilo hidrófobo se encuentra en el intervalo de 95:5 a 30:70.

8. Procedimiento para la preparación de los materiales de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se polimeriza por injerto al menos una unidad monomérica con un grupo funcional de carga negativa con al menos una unidad monomérica con un grupo hidrófobo y, dado el caso, con un monómero neutro con propiedades hidrófilas, en una reacción de una o varias etapas sobre un material de soporte inorgánico, orgánico o híbrido con contenido en grupos hidroxilo.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque se disuelve al menos una unidad monomérica con un grupo funcional de carga negativa con al menos una unidad monomérica con un grupo hidrófobo y, dado el caso, con un monómero neutro con propiedades hidrófilas en ácido diluido añadiendo un codisolvente de la serie acetona, dimetilacetamida, dimetilformamida, dioxano, tetrahidrofurano en presencia de iones cerio (IV) y

se polimeriza por injerto sobre un soporte de base con contenido en grupos hidroxilo.

10. Procedimiento para la preparación de los materiales de separación según las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado porque a) se polimeriza por injerto al menos un monómero con un grupo carboxilo de fórmula general (1)

O

HC C C N Y

R1R2 R3

(1)

en la que significan R1, R2 e Y independientemente entre sí H o CH3, R3 R4-COOM y R4 alquileno de cadena lineal o ramificado con 2 a 4 átomos de C y

M H, Na, K o NH4, y/o un monómero con un grupo carboxilo de fórmula general (2) O

HCCC OZR7 R8

(2) en la que significan R7 y R8 independientemente ente sí

H o CH3, o R7 COOM cuando Z = M y R8 = H, Z o bien M o bien R4-COOM con R4 alquileno de cadena lineal o ramificado con 2 a 4 átomos de C y

M H, Na, K o NH4,

dado el caso junto con un monómero hidrosoluble, sobre un material de soporte inorgánico, orgánico o híbrido con contenido en grupos hidroxilo y b) a continuación se transforma una parte de los grupos carboxilo polimerizados por injerto en grupos amida mediante acoplamiento con una amina. 20 11. Procedimiento según la reivindicación 10 para la preparación de los materiales de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque a) se disuelve en agua al menos un monómero con un grupo carboxilo de fórmula general (1) O

HC C C N Y R1R2 R3

(1) en la que significan

R1, R2 e Y independientemente ente sí H o CH3, R3 R4-COOM,

R4 alquileno de cadena lineal o ramificado con 2 a 4 átomos de C y

M H, Na, K o NH4,

y/o de fórmula general (2)

O

HCCC OZ

R7 R8

(2)

en la que significan R7 y R8 independientemente entre sí H o CH3,

o R7 COOM cuando Z = M y R8 = H

Z M o R4-COOMR4 alquileno de cadena lineal o ramificado con 2 a 4 átomos de C

y

M H, Na, K o NH4,

dado el caso junto con un monómero hidrosoluble adicional, de manera que la proporción de los grupos de carga negativa ascienda a entre 1 y 100 mol% en relación con la cantidad total de monómeros,

b) la solución obtenida se mezcla con el material de soporte de tal manera, que se usen entre 0, 05 y 100 15 mol de monómeros totales por litro de material de soporte sedimentado,

c) se añade a la suspensión obtenida una sal de cerio (IV) disuelta en ácido mineral, por medio de lo cual se ajusta un valor de pH comprendido en el intervalo de 0 a 5 y una concentración de cerio (IV) de 0, 00001 a 0, 5 mol/l, preferentemente de 0, 001 a 0, 1 mol/l, y

d) la mezcla de reacción se polimeriza por injerto en un plazo de 0, 5 a 72 horas y

e) para la modificación por acoplamiento de los grupos carboxilo polimerzados por injerto se usa una amina o una mezcla de aminas y

f) la cantidad total de aminas se usa en una relación molar de 0, 01 a 100:1 respecto a los grupos carboxilo unidos al soporte y éstos se transforman en grupos amido en presencia de un reactivo de acoplamiento que se usa en una relación molar de 0, 01:1 a 20:1 respecto a los grupos cargados unidos al soporte y

g) para el acoplamiento se usa una alquil-, aril- o arilalquilamina con 6 a 18 átomos de C del grupo formado por anilina, bencilamina, 4-fluorobencilamina, 4-metoxibencilamina, naftilmetilamina, fenacilamina, feniletilamina, fenoxietilamina, triptamina o tiramina, en forma de amina libre o de hidrocloruro.

12. Columna cromatográfica que presenta un material de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7.

13. Uso de los materiales de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7 en una columna cromatográfica.

14. Uso de los materiales de separación según una o varias de las reivindicaciones 1 a 7 para la separación de biopolímeros a partir de medios líquidos.

15. Uso según la reivindicación 13, caracterizado porque el biopolímero está disuelto en un líquido acuoso que 35 presenta una conductividad electrolítica de 1 a 20 mS/cm y un valor de pH superior a 4.

16. Uso según una o varias de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado porque el biopolímero unido al material de separación mediante la interacción con los grupos iónicos y, dado el caso, hidrófobos se desorbe a) por aumento de la fuerza iónica y/o b) por modificación del pH de la solución y/o c) mediante el uso de un eluyente con una polaridad distinta a la del tampón de adsorción.

Fracciones