CONSTRUCCION GENICA PLASMIDICA (PMTTSLUCFF) INCLUYENDO EL PROMOTOR DEL GEN MTT5 DEL CILIADO TETRAHYMENUS THERMOPHILA, PARA LA ELABORACION DUN BIOSENSOR CELULAR UTIL EN LA DETECCION DE METALES PESADOS.

Construcción génica plasmídica pMTT5LucFF, construida a partir del plásmido pBt{dl}-7Luc,

tras insertar la construcción PMTT5::lucFF. Esta construcción está formada por la región promotora del gen MTT5 (codificante para una Cd-metalotioneina) del ciliado T. thermophila y el gen reportero LucFF (codificante de la luciferasa).Este plásmido es la herramienta molecular base para la construcción de un biosensor celular en el ciliado-modelo Tetrahymena thermophila, que sea útil para la detección de metales pesados en muestras acuáticas y/o terrestres presumiblemente contaminadas

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200901621.

Solicitante: GUTIÉRREZ FERNÁNDEZ, JUAN CARLOS.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MADRID.

Inventor/es: MARTIN GONZALEZ,ANA, GUTIERREZ FERNANDEZ,JUAN CARLOS, TURKEWITZ,AARON, AMARO TORRES,FRANCISCO.

Fecha de Solicitud: 22 de Julio de 2009.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 23 de Noviembre de 2011.

Clasificación PCT:

  • C07K14/44 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de protozoos.
  • C12N15/79 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores o sistemas de expresión especialmente adaptados a huéspedes eucariotas.

Descripción:

Construcción génica plasmídica (pMTT5LucFF) incluyendo el promotor del gen MTT5 del ciliado Tetrahymena thermophila para la elaboración de un biosensor celular útil en la detección de metales pesados.

La presente invención se refiere a una construcción génica constituida con el promotor Pmtt5 del gen MTT5 (cuya secuencia ADNc se ha depositado en el GenBank con el número de acceso; DQ517936) codificante de una cadmio-metalotioneina del protozoo ciliado Tetrahymena thermophila y el gen reportero LucFF codificante de la luciferasa. Esta construcción génica fue incorporada en el plásmido pBtΔ-7Luc, originando un nuevo plásmido que hemos denominado pMTT5LucFF. Este plásmido, objeto de la patente que se solicita, es la base para la obtención de un biosensor celular basado en el ciliado T. thermophila, que sea útil para la detección rápida de metales pesados en muestras naturales (acuáticas o terrestres) presumiblemente contaminadas.

Antecedentes de la invención

El promotor Pmtt5, que regula la expresión del gen MTT5 que codifica una cadmio-metalotioneina (Cd-MT) en el microorganismo eucariota (ciliado) T. thermophila, ha sido caracterizado y estudiado por nuestro grupo de trabajo. El análisis comparativo de la expresión de este gen con las dos restantes isoformas que existen de Cd-MTs en este ciliado, ha demostrado que este promotor es el más fuerte de ellos. Por lo que, es una herramienta molecular idónea para sobre-expresar genes heterólogos y/o genes reporteros que sean útiles en la detección de la presencia de factores o elementos que induzcan la apertura del promotor (fundamentalmente metales pesados).

Esta es la primera vez que se utiliza este promotor fuerte para la construcción de un sistema génico reportero de la presencia de metales pesados, siendo esta construcción una herramienta molecular para la obtención de un biosensor celular en T. thermophila, biotecnológicamente útil en la detección de metales pesados en muestras contami- nadas.

Descripción de la invención

Para generar la construcción PMTT5::lucFF, en primer lugar se amplificó la región promotora (1,5 Kb) de MTT5 utilizando los cebadores MTT5UTRA/MTT5UTRB (5'ATAGGATCCGATTAAAATGGAGATCTTTATGAG3'/ 5'ATGAAGCTTGCCATATTTTTAATCTGATATATTATATTGATTAT3'), que añaden las dianas de restricción BamHI y HindIII a los extremos 5' y 3' del promotor de MTT5. El producto de PCR de 1.521 pb obtenido fue clonado, secuenciado e insertado en el sitio específico BamHI/HindIII del vector pBtΔ7Luc, de modo que el gen lucFF quedase bajo control del promotor MTT5, y ambos flanqueados por las regiones 5' y 3' UTR del gen BTU1-1 (β-tubulina 1), lo que permite su inserción en el locus btu1-1 de la cepa CU522 de T. thermophila mediante recombinación homologa. A este nuevo plásmido se le denominó pMTT5LucFF.

Breve descripción de los dibujos

En la figura 1, se muestra un esquema del plásmido pMTT5LucFF. El plásmido completo tiene una longitud de 8.263 pb, y en él se distingue la región insertada 5 'UTRMTT5 (la secuencia nucleotídica de la misma se muestra en la Fig. 2) fusionada con la región del gen reportero lucFF (cuya secuencia nucleotídica se muestra en la Fig. 3). Flanqueando ambos extremos están las regiones 3' y 5'UTR (regiones no codificantes) del alelo 1 del gen de la β-tubulina. Igualmente, con la finalidad de que este plásmido se mantenga y replique en un hospedador bacteriano, tiene el origen de replicación del plásmido ColE1 y el gen de la resistencia a ampicilina (AmpR).

Cepa recombinante MTT5Luc

El plásmido pMTT5LucFF se digiere con las enzimas KpnI y SacI (localizadas más allá de las regiones flanqueantes 3'y 5'UTR del gen btu1-1, lo que libera la construcción reportera completa PMTT5::LucFF, la cual es introducida en el macronucleo de la cepa CU522 de T. thermophila mediante transformación biolística. Una vez introducida en el genoma macronuclear, esta construcción eventualmente recombina con la región homologa cromosómica macronuclear 5' y 3'UTR del gen btu1-1, incorporándose así al genoma. Esta cepa denominada MTT5Luc, constituye un biosensor celular para la detección de metales pesados en muestras contaminadas, como así lo demuestra la validación (utilizando muestras de agua y/o suelo artificialmente contaminadas con metales pesados o muestras naturales contaminadas o no con metales pesados) llevada a cabo en nuestro laboratorio.

Texto libre de la lista de secuencias

Traducción por orden de presentación

Application Project: Proyecto de Solicitud de Patente

<120> Title: Título

<130> AppFileReference: Referencia del Expediente

<140> CurrentAppNumber: Número de Solicitud de Patente en trámite.

<141> CurrentFilingDate: Fecha de presentación de la solicitud en trámite.

Sequence: Secuencia

<213> OrganismName: Nombre del Organismo

<400> PresequenceString: Secuencia

<212> Type: Tipo de secuencia

<211> Length: Longitud

\hskip1cm SequenceName: Nombre de la secuencia

\hskip1cm SequenceDescription: Descripción de la secuencia


 


Reivindicaciones:

1. Construcción génica plasmídica pMTT5LucFF, caracterizada por la fusión del promotor del gen MTT5 (PMTT5) del ciliado Tetrahymena thermophila con el gen reportero LucFF (codificante de luciferasa) PMTT5::LucFF.

2. Cepa transformada (MTT5Luc) de T. thermophila con el plásmido indicado en la reivindicación 1.

3. La utilización de la cepa de T. thermophila indicada en la reivindicación 2, para su utilización como biosensor celular en un bioensayo de detección de metales pesados en muestras acuáticas y/o terrestres.


 

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