Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso.

Un conjugado que comprende una uricasa purificada conjugada a poli(etilenglicol) (PEG),

donde al menos 90% dedicha uricasa está en una forma tetramérica

Conjugados de peg-oxidasa de urato y su uso Campo de la invención La presente invención trata sobre la modificación química de proteínas para prolongar su vida en circulación y reducir su inmunogenia. Más específicamente, la invención aborda la conjugación de polietilenglicol u óxido de polietileno con oxidasas de urato, que elimina considerablemente la inmunogenia de la oxidasa de urato sin comprometer su actividad uricolítica.

Antecedentes de la Invención Las declaraciones que aparecen en esta sección no constituyen una admisión de la tecnología anterior, sino que reflejan los comentarios e interpretaciones subjetivas de los inventores sobre el estado que guardaba la tecnología en el momento que se llevó a cabo esta invención. Dichas interpretaciones pueden reflejar las ideas personales de los inventores, y por lo tanto no conocidas, las cuales no forman parte por sí mismas de la arte anterior.

Las oxidasas de urato (uricasas; E. C. 1.7.3.3) son enzimas que catalizan la oxidación del ácido úrico en un producto más soluble, alantaína, un metabolito que es más fácil de excretar. Los seres humanos no producen uricasas activas enzimáticamente como resultado de varias mutaciones del gen para uricasa adquirido durante la evolución de los primates superiores. Wu, X, et al., (1992) J Mol Evol 34:78-84. En consecuencia, en individuos susceptibles, una concentración excesiva de ácido úrico en sangre (hiperuricemia) y en orina (hiperuricosuria) pueden ocasionar artritis dolorosa (gota) , depósitos de urato desfigurantes (tofos) e insuficiencia renal. En algunos individuos afectados, los medicamentos disponibles como el alopurinol (un inhibidor de la síntesis del ácido úrico) producen efectos secundarios limitadores del tratamiento o no alivian los síntomas de manera satisfactoria. Hande, KR, et al., (1984) Am J Med 76:4756; Fam, AG, (1990) Baillière’s Clin Rheumatol 4:177-192. Las inyecciones de uricasa pueden disminuir la hiperuricemia e hiperuricosuria, por lo menos de manera transitoria. No obstante, dado que la uricasa es una proteína extraña en los seres humanos, incluso la primera inyección de proteína no alterada de Aspergillus flavus ha dado lugar a reacciones anafilácticas en diferentes porcentajes de pacientes bajo tratamiento (Pui, C-H, et al., (1997) Leukemia 11:1813-1816) y las respuestas inmunológicas restringen su utilidad para tratamientos crónicos o intermitentes. Donadio, D, et al., (1981) Nouv Presse Méd 10:711-712; Leaustic, M, et al., (1983) Rev Rhum Mal Osteoartic 50:553-554.

Durante varias décadas se ha reconocido que los resultados de los tratamientos disponibles para la hiperuricemia no alcanzan un nivel óptimo. Kissel, P, et al., (1968) Nature 217:72-74. De la misma manera, hace años que se reconoce la posibilidad de que determinados grupos de pacientes con gota severa podrían verse beneficiados por un tratamiento con uricasa inyectable en forma segura y eficaz. Davis, FF, et al., (1978) in GB Broun, et al., (Eds.) Enzyme Engineering, Vol. 4 (pp. 169-173) New York, Plenum Press; Nishimura, H, et al., (1979) Enzyme 24:261-264; Nishimura, H, et al., (1981) Enzyme 26:49-53; Davis, S, et al., (1981) Lancet 2 (8241) :281-283; Abuchowski, A, et al., (1981) J Pharmacol Exp Ther 219:352-354; Chen, RH-L, et al., (1981) Biochim Biophys Acta 660:293-298; Chua, CC, et al., (1988) Ann Int Med 109:114-117; Greenberg, ML, et al., (1989) Anal Biochem 176:290-293. Las uricasas derivadas de los órganos animales son prácticamente insolubles en disolventes que son compatibles con la administración segura mediante inyección. Patente estadounidense 3, 616, 231. Ciertas uricasas derivadas de las plantas o microorganismos son más solubles en disolventes aceptables en términos médicos. Sin embargo, la inyección de enzimas microbianas induce con rapidez respuestas inmunológicas que pueden ocasionar reacciones alérgicas potencialmente mortales o una inactivación o eliminación acelerada de la uricasa de la circulación. Donadio, et al., (1981) ; Leaustic, et al., (1983) . Las enzimas basadas en secuencias de aminoácidos deducidas de uricasas de mamíferos, incluyendo el cerdo y el babuino, o de insectos, como Drosophila melanogaster o Drosophila pseudoobscura (Wallrath, LL, et al., (1990) Mol Cell Biol 10:51145127) , no han sido candidatos aconsejables para su uso clínico, debido a los problemas de inmunogenia e insolubilidad en el pH fisiológico.

Se han utilizado las alteraciones covalentes de las proteínas con polietilenglicol u óxido de polietileno (ambos conocidos como PEG) para aumentar la hemivida de las proteínas y reducir la inmunogenia. Patentes estadounidenses 4, 179, 337, 4, 766, 106 y 4, 847, 325; Saifer, MGP, et al., (1994) Adv Exp Med Biol 366:377-387. La combinación de PEG de peso molecular elevado para producir conjugados con ciclos vitales de circulación prolongada o inmunogenia reducida – mientras que se conserva la actividad funcional– se demostró con anterioridad para otra enzima, la dismutasa de superóxido (Somack, R, et al., (1991) Free Rad Res Commun 12-13:553-562; Patentes estadounidenses 5, 283, 317 y 5, 468, 478) y para otros tipos de proteínas, por ejemplo citocinas (Saifer, MGP, et al., (1997) Polym Preprints 38:576-577; Sherman, MR, et al., (1997) in JM Harris, et al., (Eds.) , Poly (ethylene glycol) Chemistr y and Biological Applications. ACS Symposium Series 680 (pp. 155-169) Washington, DC: American Chemical Society) . Asimismo, se han descrito conjugados de uricasa con polímeros distintos a PEG. Patente estadounidense 4, 460, 683.

Prácticamente todos los intentos registrados de PEGilar la uricasa (es decir, combinar covalentemente PEG con uricasa) , el PEG se agregó predominalmente a grupos amino, incluyendo los residuos amino-terminal y los residuos disponibles de lisina. En las uricasas más utilizadas, el número total de lisinas en cada una de las cuatro subunidades idénticas se encuentra entre 25 (Aspergillus flavus (Patente estadounidense 5, 382, 518) ) y 29 (cerdo (Wu, X, et al., (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9412-9416) ) . Algunas lisinas no están disponibles para la PEGilación en la conformación nativa de la enzima. El método más común para reducir la inmunogenia de la uricasa ha sido combinar grandes cantidades de cadenas de PEG de bajo peso molecular. Esto ha tenido como resultado un gran descenso de la actividad enzimática de los conjugados resultantes.

Los investigadores anteriores utilizaron uricasa inyectada para catalizar la conversión del ácido úrico en alantaína in vivo. Véase Pui, et al., (1997) . Ésta es la base para el uso en Francia e Italia de la uricasa derivada del hongo Aspergillus flavus (Uricozyme®) para prevenir o corregir provisionalmente la hiperuricemia asociada con la terapia citotóxica para neoplasias hematológicas y para reducir de manera transitoria la hiperuricemia grave en pacientes con gota. Potaux, L, et al., (1975) Nouv Presse Méd 4:1109-1112; Legoux, R, et al., (1992) J Biol Chem 267:8565-8570; Patentes estadounidenses 5, 382, 518 y 5, 541, 098. Debido a su corta vida de circulación, Uricozyme® requiere inyecciones diarias y, además, no es muy aconsejable para terapias de largo plazo debido a su inmunogenia.

Una sola inyección intravenosa de un preparado de uricasa derivado de Candida utilis combinado con PEG de 5 kDa redujo el urato sérico a niveles indetectables en cinco sujetos humanos cuyo promedio de concentración de urato sérico antes de la inyección era de 6, 2 mg/dL, lo cual está dentro del intervalo normal (Davis, et al., (1981) . A los sujetos se les administró una inyección adicional cuatro semanas después, pero no se registraron sus respuestas. Utilizando un ensayo de difusión en gel relativamente no sensible, no se detectó ningún anticuerpo a la uricasa después de la segunda (última) inyección. Esta referencia no aportó resultados sobre tratamientos crónicos o subcrónicos en humanos o en animales utilizados con fines experimentales.

Un preparado de uricasa derivado de Arthrobacter protoformiae combinado con PEG de 5 kDa se utilizó para controlar por un tiempo la hiperuricemia en un solo paciente con linfoma cuya concentración de urato sérico antes de la inyección era de 15 mg/dL, Chua, et al., (1988) . Debido al estado crítico del paciente y a la corta duración del tratamiento (cuatro inyecciones en un periodo de 14 días) , no fue posible evaluar la eficacia o seguridad a largo plazo del conjugado.

En esta solicitud, el término «inmunogenia» se entiende como la inducción de una respuesta inmunológica mediante la inyección de un preparado de uricasa modificada con PEG o no modificada (el antígeno) , en tanto que la «antigenia» se entiende como la reacción de un antígeno con anticuerpos ya... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado que comprende una uricasa purificada conjugada a poli (etilenglicol) (PEG) , donde al menos 90% de dicha uricasa está en una forma tetramérica y donde dicho PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 60.000 Daltons.

2. El conjugado de la reivindicación 1, donde dicho PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 30.000 Daltons.

3. El conjugado de la reivindicación 1, donde dicho PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 20.000 Daltons.

4. El conjugado de la reivindicación 1, donde dicho PEG tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 10.000 10 Daltons.

5. El conjugado de la reivindicación 1, donde un promedio de 2 a 10 cadenas de PEG están enlazadas covalentemente a cada subunidad de dicha uricasa.

6. Una composición farmacéutica adecuada para disminuir los niveles de ácido úrico en un fluido corporal o tejido, que comprende el conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.