Procedimiento para la preparación de conjugados de insulina.

Un procedimiento para la preparación del producto conjugado de insulina-oligómero IN-105 de fórmula insulina- CO-CH2-CH2-

(OCH2CH2)3-OCH3, comprendiendo el procedimiento:

i) clonación y expresión del precursor del polipéptido sintético IP-F que tiene el SEQ ID NO: 2, en Pichia pastoris;

ii) fermentación del clon de Pichia pastoris que expresa IPF;

iii) aislamiento y purificación del IP-F;

iv) conjugación del IP-F con un derivado de succinimida de C14H23NO8 (Núm. CAS 622 405-78-1) en Lys- B29 de la cadena B en IP-F para obtener el producto conjugado de oligómero IP-F IP-F-CO-CH2-CH2- (OCH2CH2)3-OCH3;

v) tratamiento del producto conjugado de IP-F-oligómero IP-F-CO-CH2-CH2-(OCH2CH2)3-OCH3 con una proteasa para obtener el producto conjugado de insulina-oligómero activo insulina-CO-CH2-CH2- (OCH2CH2)3-OCH3.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IN2005/000338.

Solicitante: BIOCON LIMITED.

Nacionalidad solicitante: India.

Dirección: 20TH K.M. HOSUR ROAD, ELECTRONICS CITY P.O. BANGALORE 560 100 KARNATAKA INDIA.

Inventor/es: GOEL, ANUJ, SURYANARAYAN, SHRIKUMAR, KHEDKAR, ANAND, DAVE,Nitesh, KRISHNAN,Gautam, HAZRA,Partha, MANJUNATH,H.S, IYER,Harish, ROY,NITA, MANIKAM,GOVINDASAMY, SACHDEV,GOLDY, GARG,MAYANK.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/62 (Insulinas)

PDF original: ES-2546016_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la preparación de conjugados de insulina Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento para un producto conjugado de insulina-oligómero de fórmula insulina-oligómero. El procedimiento implica clonar y expresar un precursor IP-F de fórmula G-A-V-R-[Cadena B]-RD-A-D-D-R-[Cadena A] y someter el precursor biosintético expresado a conjugación con un oligómero activado seguido detratamiento con proteasa y purificación para obtener un producto conjugado de insulina-oligómero activo.

Antecedentes de la invención Las células beta de los islotes pancreáticos secretan un precursor de cadena sencilla de insulina, conocido como pro-insulina que después de la proteolisis da como resultado el polipéptido biológicamente activo insulina. La molécula de insulina está altamente conservada en todas las especies y generalmente consiste en dos cadenas de aminoácidos unidos por enlaces disulfuro. La molécula natural de insulina humana (p.m. 5.807 Daltons) , tiene una cadena de 21 residuos de aminoácidos con glicina en el extremo amino; y una cadena B de 30 residuos de aminoácidos con fenilalanina en el extremo amino. La insulina puede existir como un monómero o puede agregarse en un dímero o un hexámero formado a partir de tres de los dímeros. El monómero tiene la capacidad de unirse a los receptores y es la forma biológicamente activa.

Polipéptido de insulina es la principal hormona responsable de controlar el transporte, la utilización y el almacenamiento de la glucosa en el organismo. Un defecto en el metabolismo de los carbohidratos como resultado de una producción insuficiente de insulina o de una reducción de la sensibilidad del receptor a la insulina conduce al trastorno biológico de diabetes. La diabetes afecta la capacidad normal a utilizar la glucosa, como resultado aumenta los niveles de azúcar en la sangre (hiperglucemia) . A medida que la glucosa se acumula en la sangre, los niveles excesivos de azúcar son excretados en la orina (glucosuria) . Otros síntomas de la diabetes incluyen el aumento del volumen y la frecuencia de micción, sed, picor, hambre, pérdida de peso y debilidad. La diabetes cuando se deja sin tratar conduce a cetosis, seguida de acidosis con náuseas y vómitos. A medida que los productos tóxicos continúan acumulándose, el paciente entra en un coma diabético, lo que conduce a la muerte del paciente. Hay dos tipos de diabetes. La de tipo I es la diabetes mellitus insulinodependiente o DMID. La DMID era anteriormente conocida como "diabetes de inicio juvenil". En la DMID, la insulina no es secretada por el páncreas y debe ser proporcionada desde una fuente externa. La diabetes tipo II o de inicio en la edad adulta normalmente puede ser controlada por la dieta, aunque en algunos casos avanzados se requiere insulina.

Tradicionalmente se utilizó casi exclusivamente insulina bovina y porcina para el tratamiento de la diabetes en los seres humanos. Con el desarrollo de la tecnología recombinante, fue posible la fabricación a escala comercial de insulina humana mediante fermentación. Además, se han desarrollado análogos de insulina mediante ingeniería genética que tienen una actividad biológica comparable a la de la insulina humana natural para combatir la enfermedad. Sin embargo, el tratamiento de la diabetes normalmente requiere inyecciones regulares de insulina. Debido a la incomodidad de las inyecciones de insulina, se han intentado diversos enfoques para formular insulina para su administración por vías no inyectables. Una lista de tales publicaciones incluye: el documento US 4.338.306 (Kitao et al.) informa de composiciones farmacéuticas de insulina y ácidos grasos que tienen de 8 a 14 átomos de carbono y sus sales no tóxicas para la administración rectal de insulina; el documento US 4.579.730 (Kidron et al) informa de composiciones de insulina con recubrimiento entérico con un ácido biliar o sal de metal alcalino del mismo para la administración oral de insulina; el documento US 5.283.236 (Chiou et al.) informa de una composición de insulina con un agente para mejorar la penetración para ayudar a la absorción sistémica de polipéptidos de peso molecular superior, así como inhibidores de peptidasa parala liberación sistémica de insulina a través de los ojos, en donde el fármaco se excreta al conducto nasolagrimal y se pasa a ser absorbido a la circulación; el documento US

5.658.878 (Backstrom et al.) informa de una sal de insulina y sodio de un ácido graso saturado de longitud de cadena carbonada de 10 (es decir, caprato de sodio) , 12 (laurato de sodio) , o 14 (miristato de sodio) que mejora la absorción de insulina en el tracto respiratorio inferior; el documento US 5.853.748 (New et al.) -informa de una composición con recubrimiento entérico de insulina, sal biliar o ácido biliar, e iones carbonato o bicarbonato, que se utiliza para ajustar el pH del intestino a un pH de 7, 5 a 9, para la administración oral de insulina. El documento US

6.200.602 (Watts et al) informa de una composición de liberación de fármacos deinsulina para liberación colónica de insulina con un promotor de absorción que incluye una mezcla de ácidos grasos que tienen de 6 a 16 átomos de carbono y sus sales o una mezcla de mono/diglicéridos de ácidos grasos de cadena media junto con un agente dispersante, en un recubrimiento para prevenir la liberación de insulina y promotor de absorción hasta que el comprimido, cápsula o gránulo alcanza el colon proximal.

Varios intentos para liberar insulina por medio de administración oral se encuentran en la bibliografía. Los problemas asociados con la administración oral de insulina para lograr la normoglucemia en pacientes diabéticos están bien documentados en la bibliografía médica y farmacéutica. Las enzimas digestivas en el tracto GI degradan

rápidamente la insulina, dando como resultado productos de degradación biológica. En el estómago, por ejemplo, la insulina administrada oralmente sufre proteólisis enzimática y degradación ácida. La supervivencia en el intestino se ve obstaculizada por la proteolisis excesiva. En el lumen, la insulina es bombardeada por una variedad de enzimas incluyendo enzimas gástricas y pancreáticas, exo-y endopeptidasas, y peptidasas de borde en cepillo. Incluso si la insulina sobrevive a este ataque enzimático, las barreras biológicas que deben ser atravesadas antes de que la insulina puede alcanzar sus receptores in vivo pueden limitar la administración oral de insulina. Por ejemplo, la insulina puede poseer baja permeabilidad de membrana, lo que limita su capacidad para pasar del lumen al torrente sanguíneo.

Se han conjugado polipéptidos farmacéuticamente activos tales como la insulina con mezclas polidispersas de polietilenglicol o mezclas polidispersas de polietilenglicol que contiene polímeros para proporcionar mezclas polidispersas de productos conjugados de fármaco-oligómero; el documento US 4.179.337 (Davis et al) Informa de la conjugación de polipéptidos tales como insulina con diversos polietilenglicoles tales como MPEG-1 900 y MPEG5000 suministrados por Union Carbide. El documento US 5.567.422 (Greenwald) Informa de la conjugación de nucleófilos biológicamente activos con polietilenglicoles tales como m-PEG-OH (Union Carbide) , que tiene un peso molecular medio numérico de 5.000 Daltons.

La conjugación de polipéptidos tales como insulina con polímeros de glicolípidos modificados con polietilenglicol y polímeros de ácidos grasos modificados con polietilenglicol se presentan en el documento US 5.359.030 (Ekwuribe et al.) .

El documento US 6.011.008 (Domb et al.) informa de un método para producir un producto conjugado de polisacárido soluble en agua de una sustancia sensible a la oxidación que comprende activar el polisacárido... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la preparación del producto conjugado de insulina-oligómero IN-105 de fórmula insulina-CO-CH2-CH2- (OCH2CH2) 3-OCH3, comprendiendo el procedimiento:

i) clonación y expresión del precursor del polipéptido sintético IP-F que tiene el SEQ ID NO: 2, en Pichia pastoris; ii) fermentación del clon de Pichia pastoris que expresa IPF; iii) aislamiento y purificación del IP-F; iv) conjugación del IP-F con un derivado de succinimida de C14H23NO8 (Núm. CAS 62.

40. 78-1) en Lys-

B29

de la cadena B en IP-F para obtener el producto conjugado de oligómero IP-F IP-F-CO-CH2-CH2 (OCH2CH2) 3-OCH3; v) tratamiento del producto conjugado de IP-F-oligómero IP-F-CO-CH2-CH2- (OCH2CH2) 3-OCH3 con una proteasa para obtener el producto conjugado de insulina-oligómero activo insulina-CO-CH2-CH2 (OCH2CH2) 3-OCH3.

2. Un procedimiento de la reivindicación 1, en donde el precursor de IP-F se aísla a partir del caldo mediante cromatografía de intercambio iónico seguido de cristalización.

3. Un procedimiento de la reivindicación 2, en donde la cristalización se lleva a cabo en fenol y ZnCl2. 20

4. Un procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde la conjugación de IP-F con el derivado de succinimida de C14H23NO8 (Núm. CAS 62.

40. 78-1) se lleva a cabo en uno o más disolventes seleccionados entre tampón de borato, acetonitrilo, DMSO.

5. Un procedimiento de la reivindicación 1 a 4, en donde el oligómero conjugado de IP-F IP-F-CO-CH2-CH2 (OCH2CH2) 3-OCH3 se somete adicionalmente a cristalización.

6. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la proteasa se selecciona entre tripsina o carboxipeptidasa B o mezcla de las mismas. 30

7. Un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el producto conjugado de insulina-oligómero activo insulina-CO-CH2-CH2- (OCH2CH2) 3-OCH3 se purifica mediante RP-HPLC y cristalización.