CONJUGADOS DE UNIÓN CON UN RECEPTOR.

Un conjugado de unión con un receptor, que consiste en: i) Un anticuerpo o anticuerpos humanos,

o fragmentos o construcciones de los mismos, ii) un radionucleido o una mezcla de radionucleidos, iii) un folato unido químicamente al componente (i), en el que dicho anticuerpo o anticuerpos, o fragmentos o construcciones de los mismos en el conjugado retienen una capacidad para combinación de antígeno significativa

La presente invención se refiere a un conjugado de unión con un receptor, que consiste en un anticuerpo, un radionucleido y folato, en el que el conjugado posee o no una doble capacidad de unión. La presente invención también se refiere a un método para preparar tales conjugados, así como un método para usarlos. Además se describe el uso de un conjugado de acuerdo con la presente invención para preparar una solución farmacéutica.

El uso de folato y derivados de folato para marcar como diana tumores que expresan proteína de unión con folato (FBP), una proteína de la membrana de la célula unida a glicosil-fosfatidil-inositol implicada en la absorción celular de folatos oxidados por medio de endocitosis, ha llamado la atención entre los investigadores [Kranz et al, 1996; Reddy et al, 1998; Shinoda et al, 1998; Trippet et al, 1999]. Dado que se ha demostrado que varios tipos de células cancerosas humanas sobreexpresan FBP, este receptor puede ser una posible diana para el suministro de radioisótopos terapéuticos conjugados con folato. Se ha demostrado que podrían usarse varios tipos de conjugados de bajo peso molecular de folato-quelato-radionucleido, para marcar como diana células que expresan FBP tanto in vitro como in vivo [Mathias et al, 1998]. Sin embargo, la farmacocinética puede no favorecer a las moléculas pequeñas por cuanto generalmente tales moléculas son rápidamente eliminadas del cuerpo, y exponiendo así a los receptores de folato en los riñones a una concentración más alta de sustancias radiofarmacéuticas. Además, la absorción tumoral se limitaría, ya que la concentración en sangre en los tejidos diana disminuye rápidamente.

El documento EP-A-282057 describe ciertos conjugados de anticuerpos con radioisótopos y agentes quimioterapéuticos. En el documento US-4336185 se describen ciertos conjugados de proteína y derivados radioyodados de folato, y en Critical Reviews in Therapautic Drug Carrier Systems 15 (6): 587-627 1998 se revisa el uso del folato en el señalamiento como diana.

En un estudio anterior, Shinoda et al. (1998) evaluaron albúmina de suero bovino (BSA) conjugada con folato marcada con el radionucleido indio-111, y encontraron que había una diferencia significativa en la farmacocinética y la biodistribución de BSA no marcada con folato en comparación con la BSA marcada con folato. Una elevada absorción en el hígado y rápido aclaramiento o clearance en la sangre indicaron que la versión de 111In-BSA marcada con folato no era particularmente adecuada para el suministro de radionucleido a células tumorales que expresan proteína de unión con folato.

En el alcance del conocimiento de los presentes inventores, la combinación de folato-anticuerpo-radionucleido no ha sido presentada anteriormente, si bien la combinación de folato y anticuerpo si que ha sido evaluada para otros usos. Kranz, et al. (1996) conjugaron folato con un anticuerpo anti célula efectora con el intento de (1) unir el folato-anticuerpo a proteína de unión con folato en las células diana y (2) realizar la lisis de las células señaladas como diana debido a la porción de unión con el antígeno del anticuerpo interaccionado con una célula efectora. Sin embargo, el sistema receptor FBP no ha sido aún usado con éxito para dirigir radionucleidos a células cancerosas.

Para dirigir radionucleidos a los tumores que contienen FBP en escenarios locorregionales en particular, puede ser ventajoso usar vehículos más grandes que no se difundan con demasiada rapidez desde la zona en la que son inyectados. Se han desarrollado anticuerpos monoclonales contra la FBP (Campbell et al., 1991), pero el problema con los anticuerpos monoclonales es que normalmente contienen proteína completa o secuencias de péptidos procedentes de especies no humanas, y por consiguiente son inmunógenos en diversos grados cuando se usan en personas. Esto puede impedir el uso de anticuerpos monoclonales en protocolos que requieren inyecciones repetidas a causa de la aparición de anticuerpos anti-ratón humanos o anticuerpos anti-quiméricos humanos, que causan la inmunocomplejación y la biodistribución desfavorable de los radioinmunoconjugados (Bruland et al., 1995; Meredith et al., 1993). También, los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos suelen ser tan solo monovalentes o bivalentes (es decir, no multivalentes) con respecto a los sitios de combinación con el antígeno.

Por tanto el objeto de la presente invención es proporcionar un agente efectivo de señalamiento como diana del tumor selectivo para el receptor (conjugado) preparado a partir de una molécula portadora (es decir, un anticuerpo), un radionucleido y folato que está unido químicamente al portador. El conjugado debe también al mismo tiempo retener una capacidad significativa de combinar antígeno para el antígeno original; es decir, el conjugado posee doble capacidad de unión. Además, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para preparar y usar tales conjugados. Estos objetos han sido obtenidos por la presente invención, caracterizada por las reivindicaciones anexas.

La presente invención se refiere a una nueva clase de derivados de folato (conjugados), así como a un método para preparar y usar tales conjugados. El conjugado consiste en (1) un anticuerpo o anticuerpos preferentemente de la clase de IgG o IgM, o fragmentos o construcciones de las mismas (p. ej. un minicuerpo), (2) un radionucleido y (3) folato. De acuerdo con la presente invención, el conjugado contiene solamente proteínas/péptidos humanos y puede tener una mayor avidez, debido a la posibilidad de conjugar múltiples folatos por anticuerpo, y de esta forma aumentar la probabilidad de unir el conjugado a las células diana. El anticuerpo que se usa es un anticuerpo inerte o bien un anticuerpo monoclonal con afinidad hacia un antígeno asociado a un tumor. En el primer caso, se construye un conjugado con afinidad para FBP solo, mientras que en el segundo caso se hace un conjugado con afinidad por el receptor potencialmente doble, ya que el antígeno retiene una significativa capacidad de combinar antígeno para el antígeno original, así como capacidad de unión para el folato a FBP. La principal ventaja de la doble afinidad por el receptor es que se reducirá la abundancia de células diana sin al menos un receptor para el conjugado, aumentando las oportunidades de un señalamiento como diana con éxito. A juicio de los presentes inventores, ellos son los primeros en proponer el uso de folato-anticuerpo-radionucleido para suministrar radiación a células tumorales.

La presente invención se describirá ahora con más detalle, con referencia a las figuras y los ejemplos.

Figura 1. Ensayo de unión para folato marcado con tritio (3H-FA; grafica de arriba) y para IgG humana policlonal marcada con folato y yodo-125 IgG (125I-FA-HIgG; gráfica de abajo).

Figura 2. Unión de folato-TP IgG-125I a células HELA-S3; intervalo de 10 - 50 ng/ml.

Figura 3. Ensayo de unión de Folato-HIgG-125I en células HELA-S3, intervalo de 1 - 10 ng/ml.

Figura 4. Unión de folato-TP-3 IgG-125I a células OVCAR-3; intervalo de 0,1 - 20 ng/ml.

Figura 5. Unión específica de conjugado a las células.

Figura 6. Ensayos de unión de anticuerpo monoclonal TP-3 IgG marcado con folato frente a no marcado con folato en células OHS.

Con el fin de desarrollar una nueva clase de derivados de folato, es decir, de crear un nuevo compuesto (conjugado) que podría, si se prefiere, contener solamente proteína/péptidos humanos, que es multivalente para FBP y que posee o no posee doble capacidad de unión, se dilucidó la posibilidad de usar anticuerpos marcados con folato y radioisótopo. Las ventajas de usar anticuerpos en tales conjugados son dobles: El mayor tamaño del anticuerpo, en comparación con los compuestos de bajo peso molecular, afecta a la farmacocinética de los conjugados, es decir, si se inyectan por vía intravenosa producen un aclaramiento de la sangre más lento y el mantenimiento de la concentración de sustancia radiofarmacéutica, y por tanto una absorción por el tumor potencialmente más alta; si se inyectan de forma intracavitaria hacen más lento el aclaramiento de radioisótopo de la región [Larsen et al. 1995]. Dependiendo del grado de conjugación de folato (es decir, de la avidez, o número de unidades combinantes de receptor), este conjugado puede ser multivalente con respecto a los sitios de unión combinante de FBP. Además, conjugando folato con anticuerpos que tienen capacidad de unión de antígeno hacia un antígeno diferente de... [Seguir leyendo]

1ª.Un conjugado de unión con un receptor, que consiste en:

tos o construcciones de los mismos en el conjugado retienen una capacidad para combinación de antígeno significativa.

2ª.Un conjugado según la reivindicación 1ª, en el que dicho conjugado tiene una doble capacidad de unión con una diana.

3ª.Un conjugado según la reivindicación 2ª, en el que dicho anticuerpo humano, fragmento de anticuerpo o construcción de anticuerpo tiene afinidad hacia un antígeno distinto de la proteína de unión con folato.

4ª.Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que dicho anticuerpo humano, fragmento de anticuerpo o construcción de anticuerpo es monoclonal.

5ª.Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que dicho anticuerpo humano, fragmento de anticuerpo o construcción de anticuerpo es policlonal.

6ª.Un conjugado según la reivindicación 1ª, en el que dicho conjugado no tiene una doble capacidad de unión con una diana.

7ª.Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 6ª, en el que cada uno de dichos anticuerpos es de la clase de IgG o IgM.

8ª.Un conjugado según la reivindicación 1ª, en el que cada uno de dichos anticuerpos es policlonal, de la clase de IgG y en el que dicha construcción no tiene doble capacidad de unión.

9ª.Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 8ª, en el que dicho radionucleido o dicha mezcla de radionucleidos se eligen cada uno de ellos entre el grupo que consiste en emisores alfa, emisores beta, emisores gamma, emisores de positrones y emisores de rayos X.

10ª.Un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 8ª, en el que dicho radionucleido o dicha mezcla de radionucleidos es útil para cirugía radioguiada.

11ª.Un conjugado según la reivindicación 9ª, en el que dicho radionucleido o dicha mezcla de radionucleidos se eligen cada uno de ellos entre el grupo de emisores alfa que consiste en 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 225Ac, 223Ra, 224Ra y 227Th.

12ª.Un conjugado según la reivindicación 9ª, en el que dicho radionucleido o dicha mezcla de radionucleidos se eligen cada uno de ellos entre el grupo de emisores beta que consiste en 131I, 90Y, 153Sm.

13ª.Un conjugado según la reivindicación 9ª, en el que dicho radionucleido o dicha mezcla de radionucleidos es cada uno de ellos 211At o 125I.

14ª.Un método para preparar un conjugado de receptor según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª, comprendiendo dicho método:

a) generar un éster activado en las posiciones α- o γ-carbonilo del folato y a continuación acoplarlo a un anticuerpo humano, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo:

b) acoplar un agente radioactivo a un anticuerpo humano, un fragmento de anticuerpo o una construcción de anticuerpo mediante acoplamiento amina o marcaje con yodógeno de tirosina;

en donde la etapa de acoplamiento a) puede realizarse antes, al mismo tiempo o después de la etapa de acoplamiento b).

15ª.Un método según la reivindicación 14ª, en el que la etapa de acoplamiento a) se lleva a cabo de forma que una unidad de folato se une a dicho anticuerpo, fragmento de anticuerpo o construcción de anticuerpo, y en el que dicho agente radioactivo es un radionucleido útil para radioterapia.

16ª.Un método según la reivindicación 14ª o según la reivindicación 15ª, en el que el acoplamiento de la etapa b) se lleva a cabo por medio de un enlazador.

17ª.Un método según la reivindicación 14ª o según la reivindicación 15ª, en el que el acoplamiento de la etapa b) se lleva a cabo sin usar un enlazador.

18ª.El uso de un conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 13ª para la elaboración de una solución farmacéutica adecuada para inyección o infusión a mamíferos.

19ª.El uso según la reivindicación 10ª, en el que dicha solución farmacéutica es adecuada para inyección o infusión en mamíferos por al menos una vía de administración elegida entre las vías intravenosa, regional e intratumoral. 20ª. El uso según la reivindicación 18ª o la reivindicación 19ª para la elaboración de una solución farmacéutica para la formación de imágenes de células que contienen receptores.

21ª. El uso según la reivindicación 18ª o la reivindicación 19ª para la elaboración de una solución farmacéutica para suministrar radiación potencialmente terapéutica a células malignas o tejido maligno que expresan al menos un receptor de unión de folato. 22ª. El uso según la reivindicación 21ª en el que dicho tejido maligno es cáncer de cerebro, pulmón, cuello del útero, ovario o mama.

23ª. El uso según la reivindicación 18ª o la reivindicación 19ª para la elaboración de una solución farmacéutica para ser usada en combinación con uno o más tratamientos elegidos entre la administración de IgG, IgM o fragmentos de las mismas, marcadas con folato y radiomarcadas y varios radioinmunoconjugados, otras formas de terapia radiofarmacéutica, quimioterapia, terapia de haz externo y cirugía, para tratar estados malignos que expresan la proteína de unión con folato.