CONJUGADOS DE HIDROXIALQUILALMIDÓN-PRINCIPIO ACTIVO.

La presente invención se refiere a compuestos que comprenden un conjugado de un hidroxialquilalmidón (HAS) y un principio activo, estando el hidroxialquilalmidón unido directamente covalentemente al principio activo mediante un grupo azometino -CH=N- o un grupo metilenamino -CH 2-NH- selectivamente mediante el grupo terminal reductor del HAS y siendo el principio activo una proteína, oligopéptido o polipéptido. La invención se refiere además a procedimientos para la preparación de un conjugado covalente de HAS-principio activo en el que HAS y un principio activo se hacen reaccionar entre sí en un medio de reacción selectivamente mediante el grupo terminal reductor de HAS, realizándose la reacción mediante el grupo terminal de HAS reductor selectivamente oxidado o haciendo reaccionar entre sí HAS y el principio activo directamente con formación de una base de Schiff, caracterizado porque el medio de reacción es agua o una mezcla de agua con disolvente orgánico que comprende al menos el 10 % en peso de agua, y siendo el principio activo una proteína, un oligopéptido o un polipéptido. La invención también se refiere al uso médico de los conjugados. ANTECEDENTES TÉCNICOS El uso clínico de muchos principios activos farmacéuticos está afectado por una serie de problemas (véase Delgado y col., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, vol. 9 (3, 4), (1992) pág. 249-304). Las proteínas nativas parenteralmente administradas están sometidas, por ejemplo, a la secreción por el sistema reticuloendotelial, el hígado, el riñón y el bazo. A este respecto, la secreción se realiza en función de la carga de las cadenas de los hidratos de carbono, la presencia de receptores celulares para la proteína y de la forma y tamaño de la molécula. El límite de secreción de la filtración glomerular del riñón se encuentra, por ejemplo, en aproximadamente 67 kD. Como resultado de la degradación proteolítica debe observarse además una pérdida rápida de la actividad biológica. Las proteínas bacterianamente expresadas, así como otras proteínas recombinantes, pueden presentar una elevada inmunogenicidad y provocar reacciones de hipersensibilidad potencialmente mortales. Reacciones correspondientes evitan naturalmente el uso médico de estos productos. Por este motivo, en el estado de la técnica ya se investigó sistemáticamente desde finales de los años 70 la mejora de las propiedades de proteínas exógenas mediante modificación química, especialmente polimerización o acoplamiento a polímeros macromoleculares. A este respecto, muchos trabajos se concentraron en la preparación de conjugados de, por una parte, proteínas u otros principios activos y, por otra parte, polietilenglicol (PEG) (véase el documento US 4.179.337). Las ventajas que se esperaron de estas reacciones de acoplamiento comprenden semivida in vivo mejorada de las proteínas, toxicidad reducida, estabilidad mejorada y solubilidad mejorada de los principios activos (Abuchowski y Davis, Enzymes as drugs, Holcenberg y Rubberts, Herausgeber, pág. 367-383, John Wiley & Sons N.Y. (1981). Sin embargo, el procedimiento para el acoplamiento de los principios activos demostró ser problemático ya que el grupo activo de la proteína se inactivó mediante acoplamiento a PEG o las reacciones proporcionaron el producto de reacción en rendimiento no útil. Para conseguir una unión específica que no perjudique la actividad del principio activo, grupos activos se introdujeron en PEG o el principio activo o los compuestos se unieron entre sí con un adaptador. Normalmente, el PEG se provee para esto de un grupo activo que a continuación se une covalentemente al grupo capaz del acoplamiento de una proteína. Así, por ejemplo, se describió la pérdida de la actividad de unión de los anticuerpos y sus fragmentos después de su acoplamiento a PEG (Kitamura y col., Cancer Res., vol. 51 (1991), pág. 4310-4315; y Pedley y col., Br. J. Cancer, vol. 79 (1994), pág. 1126-1130). Para la solución de este problema, Chapman y col. (Nature Biotech., vol. 17 (1999), pág. 780-783) proponen unir el PEG a determinados sitios de unión del anticuerpo. La pérdida de actividad del componente de acoplamiento se describe además en el documento WO 95/13090. Para la solución se propone activar el PEG con un grupo reactivo y unir el PEG a -interferón mediante este grupo reactivo en presencia de un tensioactivo. Como grupo reactivo preferido se menciona carbonato de N-succinimida que formará un enlace uretano bajo las condiciones mencionadas con el grupo -amino de la lisina. El documento WO 96/41813 también da a conocer procedimientos para la preparación de un conjugado de polímeropolipéptido en el que el polímero (especialmente PEG) se derivatiza en un sitio específico y a continuación se une a un polipéptido. A este respecto se incorpora preferiblemente un grupo amino-oxi-acetilo en PEG y este compuesto se une a continuación a un polipéptido, especialmente a IL-8, hG-CSF y IL-1. Por tanto, en la bibliografía se encuentra múltiples ejemplos de conjugados correspondientes; véanse conjugados de PEG-insulina en el documento US 4.179.337, conjugados bovinos de PEG-hemoglobina en el documento US 2   4.412.989, conjugados de PEG-ribonucleasa y conjugados de PEG-superóxidodismutasa en Veronese y col., Applied Biochem. Biotech., vol. 11, 141-152 (1995), conjugados de PEG-IL-2 o conjugados de PEG-IFN- en el documento US 4.766.106, conjugados de PEG-polimixina en el documento WO 90/15628 y conjugados de PEG-IL-2 en el documento WO 90/07939. Algunos conjugados encuentran mientras tanto en aplicación clínica. Por ejemplo, las propiedades de la enzima asparaginasa pudieron mejorarse mediante la formación de conjugados con PEG, y puede obtenerse comercialmente un conjugado de PEG-asparaginasa con la marca Oncaspar para la terapia contra el cáncer. La Agencia estadounidense del medicamento (US Food and Drug Administration) autorizó recientemente un G-CSF acoplado a PEG (Pegfilgastim). Un gran número de otros productos pegilados se encuentra en las distintas fases de desarrollo clínico, entre ellos, por ejemplo, PEG-CDP870, PEG-dronabinol, etc. (véase PEG-Pipeline en www.enzon.com o www.inhale.com). No sólo proteínas, sino también otros compuestos se acoplaron a PEG y otros polímeros según este esquema. Los documentos WO 97/33552 y WO 97/38727 dan a conocer, por ejemplo, el acoplamiento de paclitaxel a PEG y el uso del conjugado para el tratamiento de tumores. El uso de un conjugado de PEG-camptotecina para el tratamiento de tumores está siendo investigado por la empresa Enzon en la fase clínica I. También se han acoplado ya antibióticos a PEG. Dowling y Russell informaron, por ejemplo, de la farmacocinética de un conjugado de oxitetraciclina-PEG (J. Vet. Pharmacol. Ther., vol. 23 (2000), 107-110). Para la obtención de nuevas funciones, en el estado de la técnica también se derivatizaron antibióticos mediante otros procedimientos. Por ejemplo, se preparó una penicilina retardada que es un derivado de la penicilina procaína, es decir, la sal de la penicilina con la base de procaína. Este derivado posee una duración prolongada del efecto y se usa, por ejemplo, para la terapia de la sífilis. También se han descrito reacciones de acoplamiento con más de dos compuestos. El documento WO 93/23062 da a conocer, por ejemplo, la preparación de un producto de acoplamiento de un anticuerpo dirigido contra un linfoma de linfocitos B, PEG activado y una toxina. Sin embargo, los conjugados de PEG-principio activo no presentan estructuras naturales para las que hayan descrito rutas de descomposición in vivo. Entre otras cosas, por este motivo, además de los conjugados de PEG también se han generado otros conjugados y polímeros de proteínas para la solución de los problemas anteriormente mencionados. Por tanto, hay múltiples procedimientos para la reticulación de distintas proteínas y la unión de proteínas a macromoléculas (véase el resumen en Wong, S.S., Chemistry of protein conjugation and cross linking, CRCS, Inc. (1993)). El hidroxietilalmidón (HES) se descompone en el cuerpo por la -amilasa como derivado de una amilopectiva que se produce naturalmente. La preparación de conjugados de HES-proteína también se ha descrito ya en el estado de la técnica (véanse los conjugados de HES-hemoglobina en los documentos DE 26 16 086 o DE 26 46 854). La hemoglobina es una proteína que podría tener una gran importancia clínica como agente de transporte de sustitutos de la sangre y el oxígeno (el llamado transportador de oxígeno basado en hemoglobina, de Hämoglobin- Based-Oxigen Carrier, HBOC). Sin embargo, aunque la necesidad de un producto de este tipo ya se apreció pronto (véase Rabiner, J. Exp. Med. 126, (1967) 1127), ninguno de los productos de HBOC conocidos hasta la fecha ha conseguido el estatus de un fármaco... [Seguir leyendo]

1.- Procedimiento para la preparación de un conjugado covalente de HAS-principio activo en el que el HAS y un principio activo se hacen reaccionar selectivamente entre sí mediante el grupo terminal reductor en un medio de reacción, realizándose la reacción mediante el grupo terminal reductor selectivamente oxidado del HAS o haciéndose reaccionar entre sí directamente el HAS y el principio activo con formación de una base de Schiff, caracterizado porque el medio de reacción es agua o una mezcla de agua con disolvente orgánico, que comprende al menos el 10 % en peso de agua, siendo el principio activo una proteína, un oligopéptido o un polipéptido. 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se usa hidroxietilalmidón con un peso molecular promedio (media ponderada) de 1 a 300 kDa. 3.- Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que se usa hidroxietilalmidón con un peso molecular promedio (media ponderada) de 1 a 150 kDa. 4.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se usa hidroxietilalmidón con un peso molecular promedio (media ponderada) de 2 a 40 kDa. 5.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que se usa hidroxietilalmidón con un grado de sustitución promedio de 0,1 a 0,8 y una relación de sustitución de C2:C6 en el intervalo de 2 a 20, referido en cada caso a los grupos hidroxietilo. 6.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el principio activo es una enzima, un inhibidor de enzimas, un receptor, un fragmento de receptor, una insulina, un factor VIII, un factor IX, una citocina, un interferón, una interleucina, un factor de crecimiento, un antibiótico peptídico, una proteína de la cápside vírica, una hemoglobina, una eritropoyetina, una albúmina, un TPAh, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario. 7.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el principio activo es una vacuna, un antibiótico o un antidiabético. 8.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que un grupo amino del principio activo se hace reaccionar con HAS de manera que se forma una base de Schiff. 9.- Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el HAS se une a un grupo -NH 2, grupo -NH 2 o grupo - C(NH 2) 2 del principio activo. 10.- Procedimiento según la reivindicación 8 ó 9, en el que el grupo azometino -CH=N- de la base de Schiff se reduce dando un grupo metilenamino -CH 2-NH-. 11.- Procedimiento según la reivindicación 10, en el que como agente reductor se usa BH 4. 12.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el grupo terminal reductor del HAS se oxida selectivamente antes de la unión al principio activo. 13.- Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el HAS se une a un grupo -NH 2, grupo -NH 2, grupo SH, grupo COOH o grupo -C(NH2) 2 del principio activo. 14.- Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, en el que el grupo terminal reductor oxidado del HAS reacciona con un grupo amino del principio activo con formación de una amida. 15.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el HAS se une a un adaptador antes de la preparación del conjugado. 16.- Procedimiento según una de las reivindicaciones 12 a 14, en el que el principio activo se une a un adaptador antes de la preparación del conjugado. 17.- Procedimiento para la preparación de un fármaco o agente de diagnóstico que comprende las etapas en las que se prepara un conjugado covalente de HAS-principio activo según una de las reivindicaciones 1 a 16 y se mezcla con un vehículo, un adyuvante o un coadyuvante farmacéuticamente compatibles. 18.- Conjugado de HAS-principio activo, en el que el principio activo está directamente unido covalentemente al HAS, que puede obtenerse mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 11. 19.- Conjugado de HAS-principio activo, en el que el principio activo está directamente unido covalentemente a HAS   mediante un grupo azometino -CH=N- selectivamente mediante el grupo terminal reductor del HAS, siendo el principio activo una proteína, un oligopéptido o un polipéptido. 20.- Conjugado de HAS-principio activo, en el que el principio activo está directamente unido covalentemente a HAS mediante un grupo metilenamino -CH2-NH- selectivamente mediante el grupo terminal reductor del HAS, siendo el principio activo una proteína, un oligopéptido o un polipéptido. 21.- Conjugado de HAS-principio activo según la reivindicación 19 ó 20, en el que el HAS está unido a un grupo - NH 2, grupo -NH 2 o grupo -C(NH 2) 2 del principio activo. 22.- Conjugado de HAS-principio activo según una de las reivindicaciones 19 a 21, en el que se usa hidroxietilalmidón con un peso molecular promedio (media ponderada) de 1 a 150 kDa. 23.- Conjugado de HAS-principio activo según una de las reivindicaciones 19 a 22, en el que se usa hidroxietilalmidón con un grado de sustitución promedio de 0,1 a 0,8 y una relación de sustitución de C2:C6 en el intervalo de 2 a 20, referido en cada caso a los grupos hidroxietilo. 24.- Conjugado de HAS-principio activo según una de las reivindicaciones 19 a 23, en el que el principio activo es una enzima, un inhibidor de enzimas, un receptor, unfragmento de receptor, una insulina, un factor VIII, un factor IX, una citocina, un interferón, una interleucina, un factor de crecimiento, un antibiótico peptídico, una proteína de la cápside vírica, una hemoglobina, una eritropoyetina, una albúmina, un TPAh, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario. 25.- Conjugado de HAS-principio activo según una de las reivindicaciones 19 a 23, en el que el principio activo es una vacuna, un antibiótico o un antidiabético. 26.- Composición farmacéuticas que presenta un compuesto según una de las reivindicaciones 18 a 25. 27.- Composición farmacéutica según la reivindicación 26 que presenta además un vehículo farmacéuticamente compatible. 21   Información de picos Pico nº Tiempo de Altura Superficie reacción de pico de pico 22 Minutos Fig. 1: Cromatograma de GPC del acoplamiento III de ox-HES 130 kD a HSA   Información de picos Pico nº Tiempo de Altura Superficie reacción de pico de pico 23 Minutos Fig. 2: Cromatograma de GPC del acoplamiento IV de ox-HES 130 kD a HSA   Información de picos Pico nº Tiempo de Altura Superficie reacción de pico de pico 24 Minutos Fig. 3: Cromatograma de GPC del acoplamiento V de ox-HES 130 kD a HSA (tiempo de reacción 2 h)   Información de picos Pico nº Tiempo de Altura Superficie reacción de pico de pico Minutos Fig. 4: Cromatograma de GPC del acoplamiento V de ox-HES 130 kD a HSA (después de la reacción completa)   26 Minutos Fig. 5a: Analítica de GPC de la cinética de reacción del acoplamiento V de ox-HES 10 kD a HSA después de 2 h   27 Minutos Fig. 5b: Analítica de GPC de la cinética de reacción del acoplamiento V de ox-HES 10 kD a HSA después de 16 h   28 Minutos Fig. 6: Analítica de GPC de la mezcla de reacción después de 24 h de incubación del acoplamiento VII de ox-HES 130 kD a HSA   29 Minutos Fig. 7: Cromatograma de GPC del acoplamiento V de HES 130 kD a HSA y reducción con borohidruro   Tinción con plata Transferencia de Western + detección de glicanos Productos Acoplamiento III 130 (A) Transferrina Creatinasa HSA Fig. 8: Fotografía superior: SDS-PAGE de las reacciones de acoplamiento III (procedimientos A y B) entre HSA y ox-HES 130 kD y HES 130 kD, respectivamente, con tinción con plata (carril 1: acoplamiento III, procedimiento A); carril 2: transferrina; carril 3: creatinasa; carril 4: HSA sin modificar; carril 5: acoplamiento III (procedimiento B); carril 6: marcador. Fotografía inferior: transferencia Western con detección de glicanos de las mismas muestras, haciendo la transferrina (carril 2) de control positivo y la creatinasa (carril 3), así como el HSA (carril 4), de control negativo. Acoplamiento III 130 (B) Marcador   Fig. 9: SDS-PAGE, teñido con plata, 12 % de PAA (arriba) y transferencia Western/glicano (abajo) de la mezcla de reacción del acoplamiento V de ox-HES 10 kD con HSA 31   Representación esquemática de la reacción de acoplamiento entre amina-HES, SMCC y tio-ADN: ADNS Estructura de la modificación con tiol del ADN Estructura del SMCC 32 ADN Extremo 5' del oligonucleótido   33 Tio-ADN 1 Tio-ADN 1 cortado