Conjugado molecular.

Método para formar un conjugado de dos o más moléculas, que comprende:

hacer reaccionar un conector hidrazida tiol

, en el que el compuesto conector hidrazida tiol presenta la fórmula:**Fórmula**

en la que m≥2 a 50,

R2 es H, -CONHNH2 o -CO-A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente que presenta entre 1 y 100 átomos de carbono y X e Y son, independientemente, un enlace o un grupo divalente que presenta 1 a 20 carbonos, presentando una primera molécula un grupo reactivo con hidrazida para formar una primera molécula tiolada, en el que el conector hidrazida tiol con la primera molécula comprende hacer reaccionar bajo condiciones en las que un grupo tiol del conector hidrazida tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma de ácido neutro, y hacer reaccionar la primera molécula tiolada con una segunda molécula, presentando la segunda molécula un grupo reactivo con tiol, para formar el conjugado, en el que el grupo reactivo con hidrazida de la primera molécula comprende un grupo aldehído, y en el que la primera molécula comprende una molécula glucosilada y el grupo aldehído se introduce en la primera molécula mediante oxidación de una parte glucosilada de la primera molécula.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2006/045302.

Solicitante: VENTANA MEDICAL SYSTEMS, INC..

Inventor/es: BIENIARZ, CHRISTOPHER, KERNAG,CASEY A, KOSMEDER,JEROME W, LEFEVER,MARK, ASHWORTH-SHARPE,JULIA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/58 (en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos... > Tioles, sulfuros, hidropolisulfuros o polisulfuros... > C07C323/60 (con el átomo de carbono de al menos uno de los grupos carboxilo unido a átomos de nitrógeno)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos... > Preparación de tioles, de sulfuros, de hidropolisulfuros... > C07C319/02 (de tioles)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/532 (Producción de compuestos inmunoquímicos marcados)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Procedimientos generales de preparación de péptidos > C07K1/13 (Marcaje de péptidos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos... > Acidos tiocarboxílicos > C07C327/28 (que tienen átomos de azufre de grupos tiocarboxilo esterificados unidos a átomos de carbono de radicales hidrocarbonados sustituidos por átomos de oxígeno unidos por enlaces sencillos)

PDF original: ES-2548518_T3.pdf

 

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Conjugado molecular.

Fragmento de la descripción:

Conjugado molecular

Campo

La presente invención se refiere a conjugados moleculares, a conectores para preparar dichos conjugados, a métodos para preparar los conjugados y los conectores, y a métodos de utilización de los conjugados. Más particularmente, la presente invención se refiere a conjugados de anticuerpos específicos de Fc, a conectores de hidrazida tiol para preparar conjugados específicos de Fc y a métodos para preparar conjugados específicos de Fc.

Antecedentes

Se ha desarrollado una amplia diversidad de métodos para unir moléculas entre sí para formar conjugados. Resultan de particular interés los conjugados biomoleculares que se preparan típicamente para combinar las funcionalidades de las moléculas unidas en un solo constructo. Un tipo de conjugado biomolecular combina una molécula biológica que se une específicamente a otra molécula (tal como un ácido nucleico, un anticuerpo, una lectina o una avidina) y un marcaje detectable (tal como un marcaje fluorescente, nanopartícula fluorescente o un enzima) .

Pueden utilizarse conjugados de anticuerpos y marcajes detectables (conjugados de anticuerpos) en inmunoensayos para la detección de moléculas diana específicas en muestras biológicas. La parte anticuerpo de dichos conjugados se une específicamente a una diana en la muestra y el marcaje detectable se utiliza para proporcionar una señal detectable que indica la presencia y/o localización de la diana. Un tipo de conjugado que se ha vuelto ampliamente utilizado, especialmente para el análisis inmunohistoquímico, es un conjugado de un anticuerpo y un enzima (conjugado de anticuerpo-enzima) . Se genera una señal detectable mediante la adición de un sustrato a la muestra bajo condiciones en las que la parte enzima del conjugado de anticuerpo-enzima convierte el sustrato en un producto detectable (tal como un producto coloreado, de color diferente o fluorescente) en el sitio en el que la parte anticuerpo se une a su diana.

Los conjugados de anticuerpos típicamente se preparan utilizando reactivos de acoplamiento que se caracterizan porque presentan por lo menos dos grupos reactivos, uno de los cuales se hace reaccionar con un grupo funcional en el anticuerpo mientras que el otro se hace reaccionar con un grupo funcional en el marcaje detectable. Sin embargo, el acoplamiento puede conducir a la inactivación del anticuerpo o el marcaje detectable o de ambos. En particular, el acoplamiento puede desactivar los conjugados de anticuerpo-enzima mediante efectos estéricos o debido a que los reactivos de acoplamiento reaccionan con grupos funcionales situados en partes del anticuerpo y/o enzima que resultan críticos para su especificidad y/o actividad catalítica. Además, algunos esquemas de acoplamiento conducen a que los conjugados presentan una solubilidad en agua reducida.

Los esquemas de acoplamiento que pueden proporcionar conjugados de anticuerpo-enzima con menores alteraciones de la especificidad del anticuerpo y/o de la actividad enzimática resultan deseables y permiten alcanzar una sensibilidad más alta de los ensayos inmunoquímicos, tales como los ensayos inmunohistoquímicos. Una mayor sensibilidad es de particular importancia para los procedimientos automatizados, en los que etapas de amplificación adicionales no resultan deseables.

Resumen

Se da a conocer un conjugado molecular que incluye un conector hidrazida tiol. En una realización se proporciona el conjugado de anticuerpo y marcaje detectable, incluyendo un conector hidrazida tiol unido covalentemente a la parte Fc del anticuerpo. El conjugado específico para Fc de la presente realización proporciona una sensibilidad de detección mejorada, permitiendo de esta manera que la detección inmunohistoquímica de una molécula diana permita más fácilmente la automatización y las aplicaciones de alto rendimiento.

Se da a conocer además un método para preparar un conjugado que utiliza un conector hidrazida tiol. En una realización, no se requiere un grupo protector para un grupo tiol del conector debido a que el conector se hace reaccionar con una primera molécula bajo condiciones en las que el grupo tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma ácida neutra y, de esta manera, es sustancialmente no reactivo. Bajo dichas condiciones, puede formarse un enlace covalente entre un grupo hidrazida del compuesto conector y una primera molécula, conservando simultáneamente de manera sustancial el grupo tiol para una reacción posterior con un grupo reactivo con el tiol de una segunda molécula.

Se dan a conocer además conectores hidrazida tiol y métodos para preparar conectores hidrazida tiol. Además, se describen métodos para utilizar un conjugado dado a conocer para detectar una molécula diana en una muestra, tal como una sección de tejido o una muestra de citología. Los métodos para detectar una molécula diana pueden

automatizarse fácilmente debido a la sensibilidad mejorada que muestran los conjugados dados a conocer. En determinadas realizaciones, se proporcionan ensayos multiplexados que utilizan los conjugados dados a conocer, por ejemplo ensayos multiplexados que utilizan conjugados de anticuerpo dados a conocer que presentan moléculas fluorescentes o nanopartículas fluorescentes a modo de marcaje detectable.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección de Kappa en tejido de amígdala que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 2 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección de Lambda en tejido de amígdala que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 3 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección del CMV en tejido de pulmón que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 4 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección de EBER en tejido de bazo que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 5 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección del VPH en tejido de xenoinjerto CaSki que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 6 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección del VPH en tejido de xenoinjerto HeLa que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 7 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección del VPH en tejido de xenoinjerto SiHa que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 8 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección del VPH en muestras de citología que utilizan un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina. La FIG. 9 es una serie de imágenes que muestran patrones de tinción para la detección de actina en tejido muscular que utiliza un conjugado dado a conocer de anticuerpo específico de Fc-fosfatasa alcalina y que utiliza un conjugado de estreptavidina-fosfatasa... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para formar un conjugado de dos o más moléculas, que comprende: hacer reaccionar un conector hidrazida tiol, en el que el compuesto conector hidrazida tiol presenta la fórmula:

en la que m=2 a 50, R2 es H, -CONHNH2 o -CO-A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente que presenta entre 1 y 100 átomos de carbono y X e Y son, independientemente, un enlace o un grupo divalente que presenta 1 a 20 carbonos,

presentando una primera molécula un grupo reactivo con hidrazida para formar una primera molécula tiolada, en el que el conector hidrazida tiol con la primera molécula comprende hacer reaccionar bajo condiciones en las que un grupo tiol del conector hidrazida tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma de ácido neutro, y hacer reaccionar la primera molécula tiolada con una segunda molécula, presentando la segunda molécula un grupo reactivo con tiol, para formar el conjugado, en el que el grupo reactivo con hidrazida de la primera molécula comprende un grupo aldehído, y en el que la primera molécula comprende una molécula glucosilada y el grupo aldehído se introduce en la primera molécula mediante oxidación de una parte glucosilada de la primera molécula.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la primera molécula comprende una molécula de unión específica y la segunda molécula comprende un marcaje detectable.

3. Método según la reivindicación 1, en el que la reacción bajo condiciones en las que el grupo tiol del compuesto conector hidrazida tiol se encuentra sustancialmente presente en su forma de ácido neutro comprende la reacción a un pH inferior a aproximadamente 7.

4. Método según la reivindicación 1, en el que la molécula glucosilada comprende un anticuerpo y el grupo aldehído se introduce en una parte Fc del anticuerpo.

5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el grupo reactivo con tiol de la segunda molécula comprende un grupo maleimida introducida en la segunda molécula.

6. Conjugado que comprende un anticuerpo unido covalentemente a un marcaje detectable mediante un

en la que m=2 a 50, R2 es H, -CONHNH2 o -CO-A-CONHNH2, en el que A es un grupo divalente que presenta entre 35 1 y 100 átomos de carbono, y X e Y son, independientemente, un enlace o un grupo divalente que presenta entre 1 y 20 carbonos, y en el que un grupo hidrazida del conector se une covalentemente a una región Fc del anticuerpo.

7. Conjugado según la reivindicación 6, en el que el marcaje detectable comprende un enzima, una molécula fluorescente, un hapteno o una nanopartícula fluorescente.