Conjugado de detección y método de análisis policromático.

Combinación de reactivos para detectar analitos en muestras, que incluye un primer reactivo quepresenta un conjugado de detección con una parte de unión (1) específica para un analito,

una partefluorocromo (5) asociada a la parte de unión (1) y un enlazante de oligonucleótido (4) asociado porsu primer extremo a la parte fluoro cromo y que, al menos en una sección, consiste en unoligonucleótido que presenta en su secuencia de ácidos nucleicos una sección de agente deextinción (4b) y un segundo reactivo que presenta un agente de extinción (6) asociado al extremode un oligonucleótido (7) que es hibridable con la sección de agente de extinción (4b) y que durantela hibridación con el enlazante de oligonucleótido (4) se sitúa junto al primer extremo de éste.

Conjugado de detección y método de análisis policromático La invención se refiere a conjugados de detección con una parte anticuerpo, a procedimientos para la detección de analitos mediante conjugados de detección y a la utilización de estos conjugados de detección en procedimientos para la detección específica de analitos, por ejemplo de antígenos específicos, que están unidos en solución, extracelular o intracelularmente, a células suspendidas o unidas a un sustrato soporte, en particular que se encuentran en células vivas o desnaturalizadas y permeabilizadas en suspensión o unidas a un sustrato soporte. Como alternativa a la parte anticuerpo, ciertos conjugados de detección contienen una parte de unión específica a un analito, por ejemplo un ligando de receptor, un receptor, una molécula de unión específica, por ejemplo una lectina, biotina, avidina, un oligosacárido, en cada caso como parte de unión del conjugado de detección.

Los conjugados de detección según la invención incluyen una parte de unión y una parte fluorocromo asociada a ésta y con un primer extremo de un enlazante. La parte de unión puede estar dispuesta en el segundo extremo del enlazante opuesto al primero, de modo que el enlazante está situado entre la parte de unión y la parte fluorocromo. Los conjugados de detección se caracterizan porque el enlace unido a la parte fluorocromo del conjugado está diseñado para desactivar la actividad óptica de la parte fluorocromo del conjugado mediante interacción con un reactivo. En una primera forma de realización, la parte de unión puede estar asociada a la parte fluorocromo, mientras que el enlace está asociado a la parte fluorocromo a través de su primer extremo.

La preparación según la invención del enlazante para desactivar la actividad óptica de la parte fluorocromo en caso de estar presente un reactivo, consistente en un compuesto que reacciona específicamente con el enlazante, hace posible un procedimiento de detección donde se utilizan simultánea y/o sucesivamente al menos dos conjugados de detección de especificidad diferente, en cada caso con el paso de desactivación, específico de un enlazante, de la actividad óptica de la parte fluorocromo del conjugado, por ejemplo después de detectarse un conjugado de detección, de forma que, si se utiliza por ejemplo como alternativa a la decoloración con partes iguales y diferentes del fluorocromo de los conjugados, no se produce perturbación esencial alguna, por ejemplo interferencia alguna, o no se produce la excitación recíproca de los fluorocromos. De este modo se evita una reducción no específica de la señal óptica de un fluorocromo o que se genere una señal óptica no específica de un conjugado residual procedente de un paso de análisis previo. Preferentemente, los enlazantes de conjugados que entran en contacto sucesiva o simultáneamente con la misma muestra tienen diferentes especificidades de unión para un reactivo específico dado en cada caso para desactivar la parte fluorocromo.

Estado de la técnica Mahnke y Roederer (Clin. Lab. Med. 2007, 27 (3) (2007) ) han descrito cómo se pueden adaptar uno tras otro múltiples conjugados de anticuerpos para detectar antígenos celulares en citometrías de flujo con el fin de evitar, en caso de utilización simultánea, interferencias de aquellas partes fluorocromo que tienen en cada caso espectros de emisión diferentes con el fin de hacerse distinguibles. Para separar los espectros de emisión solapados, en particular en caso de excitación no específica de un fluorocromo por transferencia de energía de otro fluorocromo, se propone evaluar las señales de forma asistida por ordenador, eliminándose las señales de emisión no específicas de fondo.

Hennig, Adams y Hansen, Cytrometr y Part A, 362 - 370 (2009) , describen el análisis de células unidas a soportes con marcado sucesivo mediante anticuerpos marcados por fluorescencia. Entre los pasos de marcado individuales se inactivaron los colorantes de fluorescencia por decoloración.

Mittag y col., Cytometr y Part A, 691 - 703 (2006) , describen el análisis celular en citometrías de flujo con tinción simultánea de las células con hasta ocho fluorocromos conjugados de diferentes anticuerpos. La distinción de los fluorocromos se produce mediante medidas sucesivas a longitudes de onda diferentes en cada caso y filtros de detección, a continuación los datos se superponen.

La WO 2004/057023 A1 describe el análisis de ácidos nucleicos mediante unión con oligonucleótidos capturadores inmovilizados y unión a oligonucleótidos marcados con colorantes, inactivándose ópticamente los oligonucleótidos marcados con colorantes no unidos mediante oligonucleótidos complementarios específicos con un agente de extinción (quencher) .

La WO 2006/002167 A2 describe una sonda de detección con una estructura en horquilla cuyos extremos hibridados están unidos, por un lado, a moléculas fluorescentes y, por otro lado, a agentes de extinción. La interacción de la parte no hibridada de la estructura en horquilla con un analito conduce a una variación de la actividad óptica del marcador de fluorescencia.

La US 2004/0219526 A1 describe un ELISA en sándwich donde el anticuerpo capturador está unido al soporte mediante un oligonucleótido que presenta secciones de cadena doble.

Laffers y col. (Cytometr y Part A 69A: 127-130 (2006) ) describen el análisis de células mediante citometría de flujo o con células inmovilizadas con conjugados anticuerpo-fluorocromo, que presentaban fluorocromos diferentes en cada caso. Para la evaluación, los datos de la citometría de flujo (CF) o microscopía de detección de fluorescencia se someten a superposición asistida por ordenador.

Tárnok (Cytometr y Part A 69A: 555-562 (2006) ) menciona, junto a la citometría utilizando conjugados de anticuerpos con diferentes fluorocromos, el uso sucesivo de conjugados anticuerpo-fluorocromo, la inactivación de fluorocromos por irradiación, la activación así como la destrucción de fluorocromos con radiación.

Perfetto y col. (Nature 648-654 (2004) ) describen citómetros de flujo para la detección de numerosos fluorocromos mediante excitación específica sucesiva muy seguida y detección específica a longitudes de onda de luz emitida, denominada medición simultánea. Dicho documento muestra que diferentes fluorocromos presentes simultáneamente en una muestra, en caso de excitación a una longitud de onda específica para el fluorocromo, presentan no obstante emisiones no específicas, lo que se atribuye a una transferencia de energía entre los fluorocromos. Para evitar señales no específicas se propone la adaptación de los conjugados anticuerpo-fluorocromo a utilizar simultáneamente según un procedimiento empírico. Para evitar aun más las señales de emisión no específicas se propone una compensación matemática con la que se eliminan emisiones que pueden ser debidas a transferencias de energía no específicas entre fluorocromos.

El documento US 6.150.173 describe una máquina automática de pipetear controlada por ordenador con la que sucesivamente se incuban conjugados anticuerpo-fluorocromo con una muestra; después de irradiarse a una longitud de onda de excitación, se mide la radiación emitida, a continuación el fluorocromo se destruye con radiación UV y se añade un nuevo conjugado anticuerpo-fluorocromo a la misma muestra.

La WO 2007/101706 A1 describe que, antes de la detección de un conjugado anticuerpo-fluorocromo específico, la muestra biológica se trata con radiación para reducir la fluorescencia no específica.

Los procedimientos arriba mencionados para la detección de varios conjugados anticuerpo-fluorocromo tienen la desventaja de que los fluorocromos pueden emitir luz de forma no específica, por ejemplo después de una transferencia de energía desde otro fluorocromo, cuando se utilizan varios fluorocromos diferentes simultáneamente en el análisis de la muestra. Los procedimientos donde varios conjugados anticuerpofluorocromo entren sucesivamente en contacto con una muestra, destruyéndose en cada caso un fluorocromo con radiación, tienen la desventaja de que, por un lado, la alta aportación de energía para destruir los fluorocromos puede modificar la muestra y de que, por otro lado, la destrucción del fluorocromo no se produce de forma completa o no irreversible, de modo que, con frecuencia, después de dicha radiación destructora, se pueden seguir detectando emisiones no específicas de fluorocromos, lo que también se denomina regeneración de los fluorocromos.

Además, en los procedimientos para desactivar fluorocromos por radiación, la duración relativamente larga de ésta resulta desventajosa.

Objeto de la invención... [Seguir leyendo]

1. Combinación de reactivos para detectar analitos en muestras, que incluye un primer reactivo que presenta un conjugado de detección con una parte de unión (1) específica para un analito, una parte fluorocromo (5) asociada a la parte de unión (1) y un enlazante de oligonucleótido (4) asociado por su primer extremo a la parte fluorocromo y que, al menos en una sección, consiste en un oligonucleótido que presenta en su secuencia de ácidos nucleicos una sección de agente de extinción (4b) y un segundo reactivo que presenta un agente de extinción (6) asociado al extremo de un oligonucleótido (7) que es hibridable con la sección de agente de extinción (4b) y que durante la hibridación con el enlazante de oligonucleótido (4) se sitúa junto al primer extremo de éste.

2. Combinación según la reivindicación 1, caracterizada porque el enlazante de oligonucleótido (4) está asociado a la parte de unión (1) a través de su segundo extremo, que está situado en posición opuesta al primer extremo.

3. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el enlazante de oligonucleótido (4) presenta una primera sección de enlazante de oligonucleótido (4a) asociada a la parte de unión (1) , presentando la primera sección de enlazante de oligonucleótido (4a) en su secuencia de ácidos nucleicos una sección de fluorocromo (4a) , y porque la parte fluorocromo (5) está asociada a la segunda sección de enlazante de oligonucleótido (8) hibridable con la sección de fluorocromo (4a) .

4. Combinación según la reivindicación 3, caracterizada porque la segunda sección de enlazante de oligonucleótido (8) que está asociada a la parte fluorocromo (5) incluye la sección de agente de extinción (4b) .

5. Combinación según la reivindicación 4, caracterizada porque incluye al menos dos conjugados de detección que presentan en cada caso secciones de fluorocromo (4a) con secuencias de nucleótidos idénticas o similares con las que se puede hibridar bajo condiciones fisiológicas la misma segunda sección de enlazante de oligonucleótido (8) .

6. Combinación según la reivindicación 4, caracterizada porque incluye al menos dos conjugados de detección que presentan en cada caso secciones de fluorocromo (4a) con secuencias de nucleótidos idénticas o similares con las que se puede hibridar bajo condiciones fisiológicas la misma segunda sección de enlazante de oligonucleótido (8) .

7. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque incluye al menos dos conjugados de detección que presentan en cada caso secciones de agente de extinción (4b) con secuencias de nucleótidos únicas.

8. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque incluye al menos dos conjugados de detección que presentan en cada caso secciones de agente de extinción (4b) con secuencias de nucleótidos idénticas o similares con las que se puede hibridar bajo condiciones fisiológicas el mismo oligonucleótido (7) asociado al agente de extinción (6) .

9. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el segundo reactivo no consiste en un agente de extinción (6) asociado al oligonucleótido (7) y opcionalmente el enlazante de oligonucleótido (4) no presenta ninguna sección de agente de extinción (4b) , y porque el segundo reactivo de la combinación es una nucleasa.

10. Combinación según la reivindicación 9, caracterizada porque el enlazante de oligonucleótido (4) presenta una secuencia de reconocimiento para una restrictasa, y la nucleasa es una restrictasa específica para la secuencia de reconocimiento.

11. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el enlazante de oligonucleótido (4) y/o el oligonucleótido (7) asociado al agente de extinción (6) consisten, independientemente entre sí, en un ácido oligo-ribonucleico (ARN) de cadena simple, un ácido oligodesoxirribonucleico (ADN) o un ácido oligo-peptidonucleico (APN) .

12. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11, caracterizada porque la primera sección de enlazante de oligonucleótido (4a) del enlazante de oligonucleótido (4) y/o la segunda sección de enlazante de oligonucleótido (8) que se puede hibridar con la primera y que está asociada a la parte fluorocromo (5) consisten, independientemente entre sí, en un ácido oligoribonucleico (ARN) de cadena simple, un ácido oligo-desoxirribonucleico (ADN) o un ácido oligopeptidonucleico (APN) .

13. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la parte de unión (1) está asociada con dos o más enlazantes de oligonucleótido (4) .

14. Combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la parte de unión (1) se selecciona de entre el grupo consistente en anticuerpos, fragmentos de anticuerpos formadores de paratopos, lectinas, aptámeros, péptidos específicos para MHCI o MHCII predeterminados, tetrámeros MHC, biotina y avidina.

15. Utilización de una combinación según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para el análisis de muestras biológicas, caracterizada por el contacto sucesivo de la muestra con un conjugado de detección que presenta una primera especificidad de analito, el contacto de la muestra con el segundo reactivo y el contacto de la muestra con un conjugado de detección que presenta una segunda especificidad de analito.

16. Procedimiento para el análisis de muestras biológicas, caracterizado por la producción de una combinación según una de las reivindicaciones 1 a 14 en contacto con la muestra.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, que incluye los pasos de poner en contacto una muestra biológica con un conjugado de detección que presenta una parte de unión (1) con una primera especificidad para un primer analito, una parte fluorocromo (5) asociada a la parte de unión (1) y un enlazante asociado a través de su primer extremo a la parte fluorocromo (5) ; detectar la radiación emitida por la parte fluorocromo (5) , desactivar la parte fluorocromo (5) , caracterizado porque el enlazante es un enlazante de oligonucleótido (4) que, al menos en una sección, es un oligonucleótido que presenta en su secuencia de ácidos nucleicos una sección de agente de extinción (4b) , y porque la desactivación de la parte fluorocromo (5) se lleva a cabo poniendo en contacto el conjugado de detección con un agente de extinción (6) asociado al extremo de un oligonucleótido (8) que es hibridable con la sección de agente de extinción (4b) y que durante la hibridación con el enlazante de oligonucleótido (4) se sitúa junto al primer extremo de éste.

18. Procedimiento según la reivindicación 16 o 17, caracterizado por el contacto sucesivo de la muestra con un conjugado de detección que presenta una primera especificidad de analito, el contacto de la muestra con un agente de extinción específico para el primer conjugado de detección y el contacto de la muestra con un conjugado de detección que presenta una segunda especificidad de analito.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, caracterizado porque la parte fluorocromo (5) y el enlazante de oligonucleótido (4) de los conjugados de detección utilizados en contactos sucesivos son idénticos entre sí en cada caso y el agente de extinción (6) es en cada caso el mismo y presenta el mismo oligonucleótido (7) .

20. Procedimiento según la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque, en lugar de emplear un contacto con un agente de extinción, la desactivación de la parte fluorocromo (5) se lleva a cabo mediante el contacto del conjugado de detección con una nucleasa y la eliminación subsiguiente de los componentes no unidos.

21. Procedimiento según una de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque el enlazante de oligonucleótido (4) presenta una primera sección de enlazante de oligonucleótido (4a) asociada a la parte de unión (1) y que presenta en su secuencia de nucleótidos una sección de fluorocromo (4a) , y porque el conjugado de unión se produce poniendo en contacto la sección de fluorocromo (4a) con una parte fluorocromo (5) que está asociada a una segunda sección de enlazante de oligonucleótido

(8) hibridable con la sección de fluorocromo.

22. Procedimiento según la reivindicación 21, caracterizado porque la muestra se pone en contacto simultáneamente con al menos dos conjugados de detección cuyas secciones de fluorocromo (4a) son únicas en cada caso.

23. Procedimiento según una de las reivindicaciones 16 a 22, caracterizado porque la muestra se pone en contacto simultáneamente con al menos dos conjugados de detección cuyas secciones de agente de extinción (4b) son únicas en cada caso.

24. Procedimiento según una de las reivindicaciones 16 a 23, caracterizado porque los analitos están fijados sobre un sustrato de soporte.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado porque el sustrato de soporte forma parte de un canal de paso en el que están dispuestos los analitos de modo que alrededor de los mismos pueden fluir composiciones acuosas.

Detección Hidrólisis, lavado

Detección