Proceso de concentración de moléculas de ácido nucleico.

Un proceso de concentración de moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), en una superficie

(201) de un campo sensor (103a) de un biochip, el proceso consta de los pasos siguientes:

(a) proporcionar perlas magnéticas (1), con moléculas de transferencia (3a, 3b, 3c) inmovilizadas sobre ellas, que son capaces de hibridarse con una porción de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), con lo cual forman complejos que contienen dichas perlas magnéticas (1), dichas moléculas de transferencia (3a, 3b, 3c) y dichas moléculas de ácido nucleico;

proporcionar una superficie (201) de un campo sensor (103a, 103b, 1 10 03c), que constituye una parte de una superficie (101) de un biochip, dichas moléculas de captura (203) se inmovilizan sobre dicha superficie (201), dichas moléculas de captura (203) se hibridan de modo específico con una porción de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), en el que las secuencias de ácido nucleico de las moléculas de captura (203) y las moléculas de transferencia (3a, 3b, 3c) se eligen de tal manera que la temperatura de fusión del híbrido entre una molécula de ácido nucleico (5a, 5b) y una molécula de transferencia (3a, 3b, 3c) sea inferior a la temperatura de fusión del híbrido entre una molécula de ácido nucleico (5a, 5b) y una molécula de captura (203); y

proporcionar un generador de campo magnético (105);

(b) incubar las perlas magnéticas (1) con las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), a una temperatura T1 que es inferior a la temperatura de fusión de los híbridos entre las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) y las moléculas de transferencia (3a, 3b), permitiendo de este modo que las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) se hibriden con las moléculas de transferencia (3a, 3b);

(c) aplicar un campo magnético con el generador de campo magnético (105), con lo cual se mueven las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) unidas a las perlas magnéticas (1) a través del campo magnético hacia la superficie (101) del biochip, con lo cual se ponen en contacto las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) unidas a las perlas magnéticas (1) con una superficie (201) del campo sensor (103a, 103b);

(d) aumentar la temperatura desde una temperatura T1 a una temperatura T2, que es superior a la temperatura de fusión de los híbridos de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) y las moléculas de transferencia (3a, 3b) y que es inferior a la temperatura de fusión de los híbridos de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) y las moléculas de captura (203), con lo cual se disuelven o separan las moléculas de ácido nucleico (5a) de las perlas magnéticas (1) y se permite la unión de por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico (5a, 5b) con la molécula de captura (203);

(e) mover las perlas magnéticas (1) para separarlas de la superficie (101) del biochip por interrupción de la aplicación del campo magnético;

(f) repetir los pasos de (b) a (e).

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2008/064876.

Solicitante: BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH.

Inventor/es: GUMBRECHT, WALTER, DR., STANZEL,MANFRED,DR, PAULICKA,Peter.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2545584_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Proceso de concentración de moléculas de ácido nucleico

La presente invención se refiere a un proceso de concentración de moléculas de ácido nucleico a detectar en una muestra en una superficie.

Cada vez con mayor frecuencia, el diagnóstico de ácidos nucleicos recurre a los "biochips". Se emplean, por ejemplo, para detectar varios tipos y especies de ácidos nucleicos, que pueden ser el DNA, RNA, cDNA u otros ácidos nucleicos. Los métodos analíticos basados en biochips se centran normalmente en la detección de ácidos nucleicos especiales de una muestra. Por lo tanto, por ejemplo, puede examinarse el DNA de un paciente para detectar la presencia de una secuencia particular que indique la predisposición a un trastorno. De igual manera es posible detectar patógenos tales como virus y bacterias (p. ej. VIH, VPH, VCH) en una muestra de sangre de un paciente demostrando la presencia de sus DNA o RNA en dicha muestra. Estos análisis tienen la ventaja de que son más precisos que los inmunoensayos clásicos, ya que el patógeno se detecta directamente y no a partir de los anticuerpos que se generan contra él.

En su forma más simple, los biochips empleados se basan en un sustrato de vidrio, sobre el que se inmovilizan las moléculas de captura (p. ej. oligonucleótidos), que pueden unirse de modo específico con el ácido nucleico a detectar. Estos fragmentos cortos de ácido nucleico, producidos a menudo por síntesis, son, en lo que respecta a su secuencia, por lo menos parcialmente complementarios de la secuencia del ácido nucleico a detectar, resultando de ello una unión muy específica. Tiene que evitarse a toda costa la unión de ácidos nucleicos distintos del que se pretende detectar con el fin de no obtener un resultado positivo falso. En muchos métodos, la detección actual del ácido nucleico tiene lugar mediante procesos de fluorescencia, en los que se fija un colorante fluorescente sobre el ácido nucleico a detectar, por ejemplo mediante una unión con biotina-estreptavidina. Después de la hibridación específica del ácido nucleico con las moléculas de captura (captación), se enjuaga el biochip para eliminar el material no fijado. Por consiguiente, la solución ya no contiene ningún colorante fluorescente. Por excitación de los colorantes puede observarse la fluorescencia mediante una cámara CCD, lo cual hace posible la detección.

Una ventaja de los biochips es la posibilidad de detección multiplex. De este modo es posible inmovilizar sobre varias posiciones del biochip varios tipos de moléculas de captura que tienen como diana varias ácidos nucleicos a detectar. Entonces la detección puede llevarse a cabo con una medición de fluorescencia resuelta en el espacio. Por lo tanto es también posible llevar a cabo un gran número de detecciones de ácidos nucleicos en un solo proceso.

Antes de la detección, los ácidos nucleicos se copian (amplifican), ya que el número de copias de ácido nucleico presentes normalmente no es suficiente para que sea posible la detección directa. Dicha amplificación puede llevarse a cabo, por ejemplo, por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se basa en la replicación de los ácidos nucleicos mediante polimerasas de DNA termoestables. Esto implica poner en contacto un par de cebadores oligonucleótidos (oligonucleótidos de hebra simple) con el ácido nucleico a amplificar. Los cebadores se eligen de tal manera que se unan a los dos extremos de un fragmento a amplificar de las hebras complementarias. Durante el alargamiento, los cebadores se alargan, pues, en la dirección a 3 a lo largo de la hebra del ácido nucleico diana particular (cebadores directos e inversos). Los cebadores directos e inversos pueden denominarse también de modo alternativo como cebadores sentido y antisentido. De esta manera es posible amplificar la pieza situada entre los sitios del ácido nucleico diana que son complementarios de los cebadores. Para las ulteriores reacciones de detección, los productos de la PCR se separan con ventaja de los cebadores, nucleótidos y otros componentes de la mezcla PCR que pudieran interferir.

El proceso PCR abarca una pluralidad de termociclos, cada uno de ellos consta de tres pasos: en primer lugar se calienta la muestra (p. ej. a 94°C) con el fin de separar las hebras del DNA diana de doble hebra de la muestra (desnaturalización). A continuación se baja la temperatura (p. ej. a 45-6°C) para que los cebadores sean capaces de unirse a las regiones complementarias del DNA que ahora posee una sola hebra (reasociación o "annealing"). En este último paso, los cebadores unidos a la hebra simple se extienden con la polimerasa de DNA en dirección al extremo 3 con arreglo a la información de la hebra del molde de DNA, empleándose los correspondientes trifosfatos de nucleósido de la solución como bloques de síntesis (alargamiento, p. ej. a 72°C). Este ciclo se realiza aprox. 15- 5 veces durante la PCR. Las temperaturas anteriores se mencionan meramente a título ilustrativo y pueden ajustarse en cada caso de modo específico a la PCR que se quiera realizar.

A partir de unas pocas muestras presentes en el DNA (o en general en un ácido nucleico) es, pues, posible preparar una multiplicidad de copias en un período de tiempo muy corto, cuya concentración es suficiente para la posterior detección cualitativa de dicha DNA o ácido nucleico de la muestra. Por ejemplo, con 2 ciclos de PCR (que por lo general durante de 2 a 4 minutos) se produce teóricamente una cantidad 22 veces mayor, es decir, unas 16 veces mayor que la cantidad de ácido nucleico originalmente presente. Al mismo tiempo, la PCR permite que al producto de la PCR resultante se le incorpore un marcador, que hace posible la detección. Es posible, pues, emplea por ejemplo cebadores de PCR marcados con biotina o trifosfatos nucleósidos, obteniéndose de este modo productos sintetizados de PCR que están biotinilados. Una vez el producto de la PCR se ha unido a las moléculas de captura inmovilizadas, la biotina está, como resultado, igualmente inmovilizada en el biochip en la posición

correspondiente. En otro paso pueden unirse a dicha biotina los colorantes fluorescentes marcados con estreptavidina, lo cual permite detectar el ácido nucleico o su producto de PCR. Como alternativa a los colorantes fluorescentes pueden emplearse otros sistemas de detección, basados por ejemplo en la detección electroquímica.

Un punto central de los métodos de detección basados en los biochips es la hibridación, es decir, la unión del ácido nucleico a detectar (este término se entiende como sinónimo de los productos de la PCR generados a partir de los ácidos nucleicos). La sensibilidad de la detección del ácido nucleico dependerá de la eficacia de la hibridación. Normalmente se incuba el ácido nucleico con el biochip, permitiendo de este modo que tenga lugar la hibridación. Esta última puede mejorarse eligiendo una temperatura y un medio tampón adecuados. Es también importante que los ácidos nucleicos se muevan hacia la superficie del biochip que está ocupada por las moléculas de captura para que sea posible que la hibridación pueda tener lugar. Por lo tanto, no es óptimo que el movimiento del ácido nucleico se base únicamente en la difusión térmica. La constante de velocidad es, por ejemplo solamente de 8 x 1"8 cm2/s para un oligonucleótido 25mero ("Observation of hybridization and dehybridization of Thiol-tethered DNA using two- color surface plasmon resonance spectroscopy", Peterlinz y col., J. Am. Chem. Soc. 119, 341-342, 1997), resultando de ello únicamente una migración promedio de ,96 cm para un tiempo de hibridación de dieciséis horas. Por lo tanto, suponiendo que la superficie tiene un tamaño de 4 cm2, la difusión pasiva por sí sola hace que únicamente un 1,5 % de la muestra de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un proceso de concentración de moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), en una superficie (21) de un campo sensor (13a) de un biochip, el proceso consta de los pasos siguientes:

(a) proporcionar perlas magnéticas (1), con moléculas de transferencia (3a, 3b, 3c) inmovilizadas sobre ellas, que son capaces de hibridarse con una porción de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), con lo cual forman complejos que contienen dichas perlas magnéticas (1), dichas moléculas de transferencia (3a, 3b, 3c) y dichas moléculas de ácido nucleico;

proporcionar una superficie (21) de un campo sensor (13a, 13b, 13c), que constituye una parte de una superficie (11) de un biochip, dichas moléculas de captura (23) se inmovilizan sobre dicha superficie (21), dichas moléculas de captura (23) se hibridan de modo específico con una porción de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), en el que las secuencias de ácido nucleico de las moléculas de captura (23) y las moléculas de transferencia (3a, 3b, 3c) se eligen de tal manera que la temperatura de fusión del híbrido entre una molécula de ácido nucleico (5a, 5b) y una molécula de transferencia (3a, 3b, 3c) sea inferior a la temperatura de fusión del híbrido entre una molécula de ácido nucleico (5a, 5b) y una molécula de captura (23); y proporcionar un generador de campo magnético (15);

(b) Incubar las perlas magnéticas (1) con las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b), a una temperatura T1 que es inferior a la temperatura de fusión de los híbridos entre las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) y las moléculas de transferencia (3a, 3b), permitiendo de este modo que las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) se hibriden con las moléculas de transferencia (3a, 3b);

(c) aplicar un campo magnético con el generador de campo magnético (15), con lo cual se mueven las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) unidas a las perlas magnéticas (1) a través del campo magnético hacia la superficie (11) del biochip, con lo cual se ponen en contacto las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) unidas a las perlas magnéticas (1) con una superficie (21) del campo sensor (13a, 13b);

(d) aumentar la temperatura desde una temperatura T1 a una temperatura T2, que es superior a la temperatura de fusión de los híbridos de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) y las moléculas de transferencia (3a, 3b) y que es inferior a la temperatura de fusión de los híbridos de las moléculas de ácido nucleico (5a, 5b) y las moléculas de captura (23), con lo cual se disuelven o separan las moléculas de ácido nucleico (5a) de las perlas magnéticas (1) y se permite la unión de por lo menos una porción de la molécula de ácido nucleico (5a, 5b) con la molécula de captura (23);

(e) mover las perlas magnéticas (1) para separarlas de la superficie (11) del biochip por interrupción de la aplicación del campo magnético;

(f) repetir los pasos de (b) a (e).

2. El proceso según la reivindicación 1, en el que se proporcionan diferentes especies de perlas magnéticas (1), cada perla magnética tiene una molécula de transferencia específica (3a, 3b, 3c) inmovilizada sobre ella, que es capaz de unirse a una molécula específica de ácido nucleico (5a, 5b) a detectar.