Composiciones de vacuna que comprenden un coadyuvante de saponina.

Una composición inmunogénica que comprende un antígeno del virus de varicela zóster (VZV) en combinacióncon un coadyuvante,

cuyo coadyuvante comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada dela corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dichafracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 μg y 30μg por dosis, para usar como un medicamento humano.

Composiciones de vacuna que comprenden un coadyuvante de saponina

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para su fabricación y asu uso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas coadyuvadas en las que el coadyuvante es una formulación liposómica, que comprende una saponina y un lipopolisacárido.

Antecedente de la técnica Se necesitan siempre composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado coadyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.

Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales y se encuentran exclusivamente en la láminaexterna de la membrana exterior de bacterias gram-negativas. Los LPS impiden la destrucción de bacterias por complementos del suero y células fagocíticas, y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño yconsisten en tres regiones unidas de forma covalente:

(i) una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa

(ii) una región central de oligosacárido del núcleo

(iii) lípido A -la región más interna que sirve como anclaje hidrófobo, comprende unidades de disacárido deglucosamina que llevan ácidos grasos de cadena larga.

Las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y coadyuvancia, han mostrado que están relacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente de polisacárido O-específico (antígeno O) . Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por sus efectos coadyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones de vacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS o lípido A manteniendo al mismo tiempo su coadyuvancia.

El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitzy col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374) . En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisis con un grupo de fagos, y solo las colonias que presentaron un intervalo de sensibilidad estrecho (susceptibles a uno o dos fagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.

En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.

(i) no contienen región O-específica, una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce una pérdida de virulencia

(ii) la región del núcleo es muy corta -esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos

(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.

El 4’-monofosforil lípido A (MPL) , que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativas, mantiene las propiedades coadyuvantes de los LPS demostrando una toxicidad que está reducida en un factor de más de 100 (como se mide por dosis letal en huevos embrionarios de pollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516) . Los LPS se someten a relujo típicamente en soluciones de ácido mineral para moderar su fuerza (por ejemplo, HCl 0, 1 M) durante un periodo deaproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1, y descarbohidratación en la posición 6’, produciendo MPL.

El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) , que puede obtenerse por hidrólisis alcalina leve de MPL, tiene una toxicidad reducida adicionalmente manteniendo de nuevo la coadyuvancia, véase el documento US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals) . La hidrólisis alcalina se realiza típicamente en disolvente orgánico, tal como una mezcla decloroformo/metanol, por saturación con una solución acuosa de una base débil, tal como carbonato sódico 0, 5 M apH 10, 5.

Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL en, por ejemplo, los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation) .

Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glicósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillajasaponaria. Se han usado de forma amplia saponinas brutas como coadyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxica purificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de Estados Unidos Nº

5.057.540.

A modo de ejemplo, se han desarrollado vacunas contra la gripe y vacunas contra el virus de papiloma humano (VPH) con coadyuvantes.

El documento WO96/33739 divulga una composición de vacuna que comprende una saponina inmunológicamente activa y un esterol. Todavía existe la necesidad de vacunas mejoradas.

Los coadyuvantes que contienen combinaciones de lipopolisacáridos y saponinas de Quillaja se han divulgadoanteriormente, por ejemplo en la patente EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando secombinaba un lipopolisacárido (3D-MPL) con una saponina de Quillaja (QS21) . Ahora se ha descubierto que pueden conseguirse buenas propiedades coadyuvantes con combinaciones de lipopolisacárido y saponina de quillaja como inmunoestimulantes en una composición coadyuvante incluso cuando los inmunoestimulantes están presentes enbajas cantidades en una dosis humana.

Declaración de la invención En la presente invención se proporciona la reivindicación 1.

De forma adecuada, el coadyuvante de saponina en forma de un liposoma según la invención comprende una fracción activa de la saponina obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21, y un esterol, tal como colesterol, en una proporción saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p.

En particular, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula T CD4. Como alternativa, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula B.

La invención también se refiere al uso de un antígeno o antígenos del virus de varicela zoster o preparación antigénica del mismo, y un coadyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la preparación de una composición inmunogénica para la prevención de infección y/o enfermedad por virus de varicela Zoster.

La divulgación también describe el uso de (a) un antígeno o preparación antigénica del mismo, y (b) un coadyuvantecomo se ha definido anteriormente en el presente documento en la fabricación de una composición inmunogénica para inducir, en un ser humano, al menos una, o al menos dos, o todas de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de células T CD4 mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (ii) una respuesta inmunitaria humoral mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo, (iii) una respuesta de células B de memoria mejorada contra dicho antígeno o preparación antigénica del mismo.

En particular dicho antígeno es un antígeno del virus de varicela zoster (VZV) o preparación antigénica del mismo, y dicho ser humano es un individuo o población inmunodeprimida, tal como un adulto de alto riesgo, un adulto anciano o un niño. También se describe en el presente documento el uso de un antígeno o preparación antigénica del mismo y un coadyuvante como se define en el presente documento en la preparación de una composición inmunogénica para la vacunación de un ser humano, en particular un ser humano adulto anciano, contra el patógeno del que se obtiene el antígeno en la composición inmunogénica. Específicamente dicho antígeno es un antígeno o antígenos devirus de varicela Zoster o preparación antigénica del mismo.

La divulgación también describe un procedimiento de vacunación que comprende el suministro de un antígeno o composición antigénica, en particular un virus de varicela Zoster o preparación antigénica del mismo y un coadyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento a un individuo o población con necesidad de ello.

Tal como se divulga en el presente documento,... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno del virus de varicela zóster (VZV) en combinación con un coadyuvante, cuyo coadyuvante comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa derivada de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición a un nivel de entre 1 μg y 30 μg por dosis, para usar como un medicamento humano.

2. Una composición inmunogénica según la reivindicación 1, en la que dicha composición coadyuvante comprende adicionalmente un esterol, en la que la relación de saponina:esterol es de 1:1 a 1:100 p/p.

3. Una composición antigénica según la reivindicación 1 o 2, en la que dicha fracción de saponina10 inmunológicamente activa es QS21.

4. Una composición inmunogénica según la reivindicación 2 o 3, en la que dicho esterol es colesterol.

5. Una composición inmunogénica según cualquier reivindicación precedente, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado de lípido A.

6. Una composición inmunogénica según la reivindicación 5, en la que dicho derivado de lípido A e.

3. MPL.

7. Una composición inmunogénica según la reivindicación 6, en la que la relación QS21.

3. MPL es 1 : 1.

8. Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que además comprende unvehículo.

9. Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la que dicho lipopolisacárido está presente en una cantidad de 25 μg.

10. Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en la que dicha saponina está presente en una cantidad de 25 μg.

11. Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en la que dichos seres humanos son seres humanos inmunodeprimidos.

12. Una composición inmunogénica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la que dicho antígeno VZV es 25 una gE truncada de VZV producida en células CHO.

Figura 1 – Preparación de MPL

MPL® en polvo ↓ Suspensión (10 mg/ml) ↓ Tratamiento térmico ↓ Enfriamiento ↓ Microfluidización ↓ Dilución a 2 mg/ml ↓ Prefiltración en 0, 65 μm ↓ Filtración en 0, 2 μm ↓ Dilución a 1 mg/ml ↓ Almacenamiento a +2/+8 ºC

Figura 2 – Inmunidad humoral contra diversas cepas de gripe después de la inmunización de hurones con formulaciones experimentales (Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (GMT +/-IC95) )

Figura 3 – Estudio con hurones: titulación vírica en lavados nasales después de la estimulación (Día 42)

Figura 4 – Estudio con ratones: Respuesta humoral contra las tres cepas de vacuna de gripe después de lainmunización de ratones con formulaciones experimentales Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (GMT +/-IC95) 21 días después de la inmunización Figura 5 – Estudio con ratones: Respuesta inmunitaria mediada por células: Respuestas de células T CD4+ específicas de gripe el Día 7 después de la inmunización Figur.

6. CMI para CD4 -Cepa combinada (todo doble) -Día 0 y Día 21

Figur.

7. GMT en los días 0 y 21 para anticuerpos HI

Figura 8-Frecuencia de síntomas locales y generales en seres humanos (total y relacionada con el grado 3) comunicada durante el periodo de seguimiento de 7 días % de síntomas reseñados (con IC 95%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Síntomas generales Síntomas locales

Flu YNG Rel. de grado 3Flu ELD

Rel. de grado 3 AS01B

Rel. de grado 3 AS01E

Rel. de grado 3

Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3 AS01BRel. de grado 3 AS01E Rel. de grado 3

Grupo de vacuna Figura 9: Respuestas humorales a VPH 16 y 18 L1

Figura 11: Producción de células B de memoria específicas después de la inmunización con formulaciones de VPH con coadyuvante

0, 0 0, 5 1, 0% 1, 5% 2, 0 2, 5 3, 0 3, 5 4, 0 4, 5Frecuencia de células B de memoria específicasde VLP 16 en la memoria IgG total 2μg 0, 5μg AS04 1/10 2μg 0, 5μg 1/50 2μg 0, 5μg 2μg 0, 5μg GMT +/-AS01B 1/10 1/50

Figura 14: Titulaciones neutralizantes anti-CMV en cobaya después de la inmunización con vacuna Gb con coadyuvante Figura 15: Titulaciones neutralizantes anti-gB en ratones después de la inmunización con vacuna gB con coadyuvante Figura 17: Inmunidad mediada por células -Células CD4+ y CD8+ específicas para CMV después de la reestimulación con un grupo de péptidos gB (7 días después de la segunda inmunización)

% específico de CMV en la población de CD4+

2, 0

1, 5

1, 0

0, 5

0, 0

1, 5μg gB simple 0, 00CD4+IL2+INFg+ CD4+IL2+

Restimulación con péptidos de gB 2 μg/ml

1, 5μg gB

1, 5μg gB

Nacl

AS01b

AS01e 0, 02

0, 00

0, 00

0, 00

0, 02

0, 02

0, 00

0, 00

0, 07

0, 02

0, 02

CD4+INFg+

% específico de CMV en la población de CD8+

Reestimulación con péptidos de gB 2 μg/ml

2, 0

1, 5

1, 0

0, 5

0, 0 1, 5μg gB simple 1, 5μg gB AS01b 1, 5μg gB AS01e Nacl

CD8+IL2+INFg+ 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00

CD8+IL2+ 0, 00 0, 00 0, 00 0, 00

CD8+INFg+ 0, 02 0, 04 0, 02 0, 00

67

Figura 18: Inmunidad mediada por células -Células CD4+ específicas para CMV después de la reestimulación con dos dosificaciones diferentes de un grupo de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización)

Figura 19: Inmunidad mediada por células -Células CD8+ específicas para CMV después de la reestimulación con dos dosificaciones diferentes de un grupo de péptidos gB (21 días después de la segunda inmunización)

Figura 20: Media geométrica de titulaciones de anticuerpo en (GMT) contra proteína de Circumsporozoito CSP después de la inmunización con vacuna RTS, S con coadyuvante en ratones Nota: Los resultados se presentan como la media geométrica de titulaciones de anticuerpo anti-CSP a partir de grupos de ratones de dos experimentos y sus líntes de confianza del 95 %

Figura 24: Respuestas humorales en ratones después de la inmunización con vacuna contra la gripe dividida trivalente con coadyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes)

Figura 25: Respuesta inmunitaria mediada por células en ratones después de inmunización con vacuna contra la gripe con coadyuvante (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes)

Figura 27: Titulaciones víricas de lavados nasales tras cebado y exposición a antígenos del virus de la gripe (sin coadyuvante o con coadyuvante) en hurones Figura 29: Titulaciones anti HI para las cepas A en la formulación de vacuna trivalente tras inmunización y exposición a preparaciones del antígeno de la gripe