Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina.

Una composición inmunogénica que comprende un antígeno procedente de Plasmodium falciparum,

en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa procedente de corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que la dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición en una cantidad de entre 1 5 μg y 30 μg por dosis, para su uso como medicamento para seres humanos.

Composiciones de vacuna que comprenden un adyuvante de saponina

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones de vacunas mejoradas, a procedimientos para la fabricación de las mismas, y a su uso en medicina. En particular, la invención se refiere a composiciones de vacunas potenciadas con adyuvante en las que el adyuvante es una formulación liposómica, que comprende una saponina y un lipopolisacárido.

Antecedentes técnicos Son siempre necesarias composiciones o vacunas nuevas con una inmunogenicidad mejorada. Como estrategia, se han usado adyuvantes para probar y mejorar la respuesta inmunitaria provocada por cualquier antígeno dado.

Los lipopolisacáridos (LPS) son las moléculas superficiales principales y se encuentran exclusivamente en la lámina externa de la membrana exterior de bacterias gram-negativo. Los LPS impiden la destrucción de las bacterias por complementos del suero y células fagocíticas, y están implicados en la adherencia para la colonización. Los LPS son un grupo de moléculas complejas estructuralmente relacionadas de aproximadamente 10.000 Dalton de tamaño y consisten en tres regiones unidas de forma covalente:

(i) una cadena de polisacárido O-específica (antígeno O) en la región externa

(ii) una región central de oligosacárido del núcleo

(iii) lípido A - la región más interna que sirve como anclaje hidrófobo, comprende unidades de disacárido de glucosamina que transportan ácidos grasos de cadena larga.

Se ha mostrado que las actividades biológicas de LPS, tales como toxicidad letal, pirogenicidad y adyuvancia, están relacionadas con el resto de lípido A. Por el contrario, la inmunogenicidad está asociada con el componente de polisacárido O-específico (antígeno O) . Tanto los LPS como el lípido A se conocen desde hace tiempo por sus efectos adyuvantes fuertes, pero la alta toxicidad de estas moléculas ha impedido su uso en formulaciones de vacunas. Se ha hecho por lo tanto un esfuerzo significativo para reducir la toxicidad de los LPS o lípido A manteniendo al mismo tiempo su adyuvancia.

El mutante R595 de Salmonella minnesota se aisló en 1996 a partir de un cultivo de la cepa parental (lisa) (Luderitz y col. 1966 Ann. N. Y. Acad. Sci. 133:349-374) . En las colonias seleccionadas se exploró su susceptibilidad a lisis con un grupo de bacteriofagos, y sólo las colonias que presentaron un intervalo estrecho de sensibilidad (susceptibles a uno o dos bacteriófagos solamente) se seleccionaron para estudio adicional. Este esfuerzo condujo al aislamiento de una cepa mutante rugosa profunda que es defectuosa en la biosíntesis de LPS y se denomina S. minnesota R595.

En comparación con otros LPS, los producidos por el mutante S. minnesota R595 tienen una estructura relativamente sencilla.

(i) no contienen región O-específica - una característica que es responsable de la deriva del fenotipo liso de tipo salvaje al fenotipo rugoso mutante y produce como resultado una pérdida de virulencia

(ii) la región del núcleo es muy corta - esta característica aumenta la susceptibilidad de la cepa a una diversidad de productos químicos

(iii) el resto de lípido A está altamente acilado con hasta 7 ácidos grasos.

El 4’-monofosforil lípido A (MPL) , que puede obtenerse por la hidrólisis ácida de LPS extraído de una cepa mutante rugosa profunda de bacterias gram-negativo, mantiene las propiedades adyuvantes de los LPS demostrando una toxicidad que está reducida en un factor de más de 1000 (como se mide por medio de dosis letal en huevos embrionarios de pollo) (Johnson y col. 1987 Rev. Infect. Dis. 9 Supl.: S512-S516) . Los LPS se calientan a reflujo normalmente en soluciones ácidas minerales de concentración moderada (por ejemplo, HCl 0, 1 M) durante un periodo de aproximadamente 30 minutos. Este procedimiento produce desfosforilación en la posición 1, y

descarbohidratación en la posición 6’, produciendo MPL.

El monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) , que puede obtenerse por hidrólisis alcalina suave de MPL, tiene una toxicidad reducida adicional al tiempo que mantiene de nuevo la adyuvancia, véase el documento US 4.912.094 (Ribi Immunochemicals) . La hidrólisis alcalina se realiza normalmnte en disolvente orgánico, tal como una mezcla de cloroformo/metanol, por medio de saturación con una solución acuosa de una base débil, tal como carbonato sódico 0, 5 M a pH 10, 5.

Se dispone de información adicional sobre la preparación de 3D-MPL, por ejemplo, en los documentos US 4.912.094 y WO02/078637 (Corixa Corporation) .

Las saponinas de Quillaja son una mezcla de glicósidos de triterpeno extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria. Se han empleado ampliamente saponinas brutas como adyuvantes veterinarios. Quil-A es un extracto acuoso parcialmente purificado del material de saponina de Quillaja. QS21 es una fracción no tóxica purificada por HPLC de Quil A y su procedimiento de producción se describe (como QA21) en la Patente de Estados Unidos Nº

5.057.540.

A modo de ejemplo, se han desarrollado vacunas antigripales y vacunas contra el virus de papiloma humano (VPH) con adyuvantes.

El documento WO/33739 describe una composición de vacuna que comprende una saponina inmunológicamente activa y un estero.

Existe todavía necesidad de vacunas mejoradas.

Los adyuvantes que contienen combinaciones de un lipopolisacáridos y saponinas de Quillaja se han descrito anteriormente, por ejemplo en el documento EP0671948. Esta patente demostró una fuerte sinergia cuando se combinaba un lipopolisacárido (3D-MPL) con una saponina de Quillaja (QS21) . Ahora se ha descubierto que pueden conseguirse buenas propiedades adyuvantes con combinaciones de lipopolisacárido y saponina de quillaja como inmunoestimulantes en una composición adyuvante incluso cuando los inmunoestimulantes están presentes en bajas cantidades en una dosis humana.

Declaración de la invención La presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno procedente de Plasmodium faciparum, en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa procedente de corted de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están presentes ambos en la composición en un nivel entre 1 !g y 30 !g por dosis, para su uso como medicamento humano.

De manera apropiada, el adyuvante de saponina en forma de un liposoma de acuerdo con la invención comprende una fracción activa de la saponina obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina, tal como QS21, y un esterol, tal como colesterol, en una proporción saponina:esterol de 1:1 a 1:100 p/p.

En particular, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula T CD4. Como alternativa, dicha composición inmunogénica comprende un antígeno con un epítopo de célula B.

La invención también se refiere en la presente memoria al uso de un antígeno o antígenos de Plasmodium falciparum o a su preparación antigénica, y un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa obtenida de la corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido en la fabricación de una composición inmunogénica para la prevención de infección por Plasmodium falciparum y/o enfermedad de malaria.

Se describe el uso de (a) un antígeno o su preparación antigénica, y (b) un adyuvante como se ha definido anteriormente en el presente documento en la preparación de una composición inmunogénica para inducir, en un ser humano, al menos una, o al menos dos, o todas de las siguientes: (i) una respuesta inmunitaria de células T CD4 mejorada frente a dicho antígeno o su preparación antigénica, (ii) una respuesta inmunitaria humoral mejorada frente a dicho antígeno o su preparación antigénica, (iii) una respuesta de células B de memoria mejorada frente a dicho antígeno o su preparación antigénica.

En particular dicho antígeno es un antígeno de malaria o su preparación antigénica, y dicho ser humano es un individuo o población inmunocomprometida, tal como un adulto de alto riesgo, un adulto anciano o un niño. También se describe el uso de un antígeno o su preparación antgénica y un adyuvante como se define en la presente memoria en la preparación de una composición inmunogénica para vacunación de un ser humano, en particular un adulto anciando, contra un patógeno del cual procede el antígeno o su composición inmunogénica. Específicamente dicho antígeno es un antígeno o antígenos de... [Seguir leyendo]

1. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno procedente de Plasmodium falciparum, en combinación con un adyuvante que comprende una fracción de saponina inmunológicamente activa procedente de corteza de Quillaja Saponaria Molina presentada en forma de un liposoma y un lipopolisacárido, en la que la dicha fracción de saponina y dicho lipopolisacárido están ambos presentes en la composición en una cantidad de entre 1 !g y 30 !g por dosis, para su uso como medicamento para seres humanos.

2. La compopsición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, para la prevención de infección por Plasmodium falciparum y/o enfermedad de malaria.

3. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que dicha fracción de saponina inmunológicamente activa es QS21.

4. La compopsición inmunogéncia para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicha composición de adyuvante además comprende un esterol, en la que la proporción de saponina : esterol es de 1: 1 a 1:100 p/p.

5. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 4 en la que dicho esterol es colesterol.

6. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho lipopolisacárido es un derivado no tóxico de un lípido A.

7. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicho derivado de lípido A e.

3. MPL.

8. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dich.

3. MPL está presente en una cantidad d.

2. 30 !g por dosis.

9. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en la que la saponina es QS21 y QS21 está presente en una cantidad d.

2. 30 !g por dosis.

10. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que a) la saponina es QS21 y el lipopolisacárido e.

3. MPL, y b) la composición comprende 25 !g de cada uno de QS21 .

3. MPL por dosis.

11. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en la que el antígeno procedente de Plasmodium falciparum es la proteína de circumsporozoito (proteína CS) .

12. La composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en la que el antígeno procedente de Plasmodium falciparum es RTS, S.

Figura 1 – Preparación de MPL

MPL® en polvo ↓

Suspensión (10 mg/ml)

↓

Tratamiento térmico ↓

Enfriamiento ↓

Microfluidización ↓

Dilución a 2 mg/ml

↓ Pre-filtración sobre 0, 65 μm ↓ Filtración sobre 0, 2 μm ↓

Dilución a 1 mg/ml

↓

Almacenamiento a +2/+8ºC

Figura 2 – Naturaleza inmunitaria humoral frente a diferentes cepas de gripe tras la inmunización de hurones con formulaciones experimentales (Ensayo de Inhibición de Hematoaglutinación (GMT +/- IC95) ) Figura 3 – Estudio con hurones - Valoración vírica en lavados nasales tras prueba de provocación (Día 42)

Figura 4 – Estudio con ratones - respuesto humoral frente a tres cepas de vacunas antigripales tras inmunización de ratones con formulaciones experimentales: Ensayo de Inhibición de Hematoaglutinación (GMT +/- IC95) 21 después de la inmunización Figura 5 – Estudio con ratones - respuesta inmunitaria mediada por células: respuestas de células T CD4+ específicas de gripe en el Dia 7 después de la inmunización % de síntomas reseñados (con IC 95%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Figura 8- Incidencia de síntomas locales y generales (totales y relacionados con grado 3) reseñados durante el período de FU de 7 días Flu YNGRel. de grado 3Flu ELD

Rel. de grado 3AS01B

Rel. de grado 3AS01E

Rel. de grado 3

Flu YNGRel. de grado 3 Flu ELDRel. de grado 3AS01BRel. de grado 3AS01E

Rel. de grado 3

Grupo de vacuna Figura 9: Respuestas humorales a VPH 18 y 18 L1 Figura 10: Tinción de citoquinas intracelulares -células VLP 16 y CD4+

Figura 17: Naturaleza inmunitaria mediada por células -células CD8+ y CD4+ específicas de CMV tras reestimulación con una combinación de péptidos gB (7 días tras la segunda inmunización)

Figura 18: Naturaleza inmunitaria mediada por células - células CD4+ específicas de CMV tras reestimulación con dos dosificacioness diferentes de una combinación de péptidos gB (21 días tras la segunda inmunización)

Figura 19: Naturaleza inmunitaria mediada por células - células CD8+ específicas de CMV tras reestimulación con dos dosificacioness diferentes de una combinación de péptidos gB (21 días tras la segunda inmunización)

Figura 20: Valoraciones de anticuerpo en media geométrica (GMT) frente a proteína de circumsporozoito CSP tras inmunización con vacuna RTS, S adyuvada en ratones NOTA: Los resultados se presentan como media geométrica de las valoraciones Ab anti-CSP procedentes de grupos de ratones de dos experimentos y sus límites de confianza de 95 %.

Figura 23: Expresión ex vivo de IL-2 y/o gramma IFN por medio de células T CD4 y T CD8 específicas de HBs Figura 25: Respuesta inmuntaria mediada por células en ratones tras inmunización con vacuna anti-gripal trivalente adyuvada (inmunoestimulantes a dos concentraciones diferentes)