Conjugado de (i) una cadena simple Fv (scFv) específica de elemento de unión específico para la fibronectina ED-B,

y (ii) Factor de Necrosis Tumoral α (TNFα)

La presente invención se refiere al tratamiento de las lesiones de la angiogénesis patológica, especialmente los tumores, artritis reumatoide, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad, y angiomas. Aspectos de la presente invención emplean un conjugado o fusión de una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana en las lesiones y un anticuerpo dirigido contra un componente de la matriz extracelular que está presente en este tipo de lesiones. El anticuerpo está dirigido contra la fibronectina ED-B. La molécula biocida o citotóxica es factor de necrosis tumoral a (INFa) . Al dirigirse a las moléculas bioactivas a un componente de la matriz extracelular, se puede lograr causar la muerte de las células diana.

Los tumores no pueden crecer más allá de una cierta masa sin la formación de nuevos vasos sanguíneos (angiogénesis) , y se ha informado una correlación entre la densidad de los microvasos y la capacidad invasiva del tumor de una serie de tumores (1) . Moléculas capaces de dirigirse de forma selectiva a los marcadores de la angiogénesis crean oportunidades clínicas para el diagnóstico y el tratamiento de tumores y otras enfermedades caracterizadas por la proliferación vascular, como la artritis reumatoide, la retinopatía diabética y la degeneración macular relacionada con la edad (2-8) .

El dominio ED-B de la fibronectina, una secuencia de 91 aminoácidos idénticos en ratones, ratas y humanos, que se inserta por empalmado alternativo en la molécula de fibronectina, en concreto se acumula alrededor de las estructuras neovasculares y representa un objetivo de la intervención molecular (9-11) . Con el uso de un anticuerpo recombinante humano (L19) para el dominio ED-B, se ha demostrado la posibilidad del marcado de neovasculatura in vivo en diferentes modelos tumorales (12, 13) .

La presente invención se basa en el trabajo experimental de los inventores empleando un anticuerpo dirigido contra el dominio ED-B de la fibronectina, que se encuentra en la angiogénesis en las lesiones patológicas tales como tumores, conjugado con las moléculas que ejercen efectos biocidas o citotóxicos en las células diana. Algunas de dichas moléculas pueden interactuar con un receptor unido a la membrana de la célula diana o perturbar el potencial electroquímico de la membrana celular. Moléculas ejemplares demostradas experimentalmente en este documento incluyen la interleucina-2 (IL-2) , factor tisular, doxorrubicina, interleucina-12 (IL-12) , interferón-y (IFN-y) y factor de necrosis tumoral a (TNF a) . La presente invención se refiere a conjugados con TNFa.

El Factor de Necrosis Tumoral a (TNFa) es una citoquina producida por muchos tipos celulares, principalmente monocitos y macrófagos activados. Se expresa como un proteína precursora integral transmembrana 26 kDa de la cual se libera una proteína madura de aproximadamente 17 kDa por escisión proteolítica. El TNFa bioactivo soluble es un homotrímero que interactúa con dos receptores diferentes de la superficie celular (Tartaglia L.A., et al J. Biol. Chem., 268: 18542-18548, 1993) p55TNFR (50-60 kDa) y p75TNFR (75-80 kDa) . p75TNFR es específico de especie, de hecho, el TNFa humano no se une a este receptor de ratón.

El TNFa puede inducir necrosis hemorrágica de tumores sólidos trasplantados, in vivo (Carswell EA, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3666-3670, 1975) , y puede ejercer la actividad citotóxica in vitro contra algunas líneas de células tumorales (Helson L., et al, Nature, 258: 731-732. 1975) .

La eficacia anti-tumoral de TNFa en algunos modelos animales abrigaban la esperanza de su posible uso como agente terapéutico en el cáncer humano. Los ensayos clínicos realizados para demostrar la eficacia antitumoral de TNFa, sin embargo, demostró que dosis terapéuticamente efectivas sistemáticamente administrado fueron acompañadas por niveles inaceptablemente altos de toxicidad sistémica, siendo la hipotensión el efecto tóxico más común que limita la dosis. Por otra parte, TNFa tiene una evacuación muy rápida de la sangre (vida media plasmática en general menor de 30 minutos) (Blick M.m et al. Cancer Res., 47: 2989, 1987) , lo que disminuye la concentración hemática en los niveles terapéuticos, muy rápidamente. Se han logrado buenos resultados clínicos en los seres humanos sólo en los tratamientos loco-regional de tumores no diseminados (por ejemplo, extremidades aisladas de la perfusión para el sarcoma y el melanoma) (Franker D.L., et al, Important Adv. Oncol. 179-192, 1994) .

La actividad anti-tumoral de TNFa en muchos modelos animales parece ser debida a una combinación de un efecto tóxico directo (en combinación con factores derivados de los tumores que actúan sinérgicamente con TNFa) en las células endoteliales de los vasos sanguíneos del tumor en crecimiento (Clauss M., et al. J. Biol Chem., 265:70787083, 1990a) , así como a las alteraciones de las propiedades hemostáticas de la proliferación de células endoteliales en la angiogénesis tumoral (Clauss., et al J. Exp. Med. 172: 1535-1545, 1990b) . También hay evidencia de un efecto citotóxico directo sobre las células tumorales. Los efectos indirectos (mediados por el huésped) de TNFa, tales como la inmunidad dependiente de la inducción de células T, puede contribuir a la regresión de tumores en modelos animales (Palladino Jr. M.A., et al. J Immunol., 138:4023-4032, 1987) .

En los experimentos descritos a continuación, los inventores construyeron y expresaron en células de mamífero una proteína de fusión anticuerpo murino-TNFa (mTNFa) , siendo el anticuerpo L19 dirigido contra un componente de la ECM presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas (en particular, B-FN) . Experimentos de biodistribución in vivo en ratones portadores de tumores demostraron la acumulación de la proteína de fusión en torno a la formación de nuevos vasos sanguíneos del tumor. La proteína de fusión se ha probado en experimentos terapéuticos en animales con tumores y, sorprendentemente, se encontró que induce un efecto anti-tumoral y que es activo en la reducción del crecimiento del tumor.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra una representación esquemática de la construcción ADNc TNFa L19-m scFv. ADNc TNFa L19m scFv fueron fusionados genéticamente con una codificación de ADN de unión de 15 aminoácidos (SSSSG) 3 y clonado en el vector de expresión de mamíferos ADNpc utilizando los sitios de restricción HindIII y NotI. La caja rayada representa la secuencia del promotor CMV, la caja llena de la secuencia genómica del péptido líder de señal de secreción (--intrón dentro de la secuencia genómica) y las cajas en blanco el VH o VL de scFv-L19 y la secuencia mTNFa. T7, BC679, BC742 y BC749 y cebadores utilizados en las amplificaciones de PCR se describen en Materiales y Procedimientos.

La figura 2 muestra la actividad biológica de la porción mTNFa de la proteína de fusión (_) y de mTNPa recombinante (.) , medido mediante el ensayo de citotoxicidad en fibroblastos de ratón L-M (ver Materiales y Procedimientos en el ejemplo 1) .

La figura 3 es un gráfico (en función del tiempo) del volumen de carcinoma de colon murino C51 implantado por vía subcutánea en ratones Balb/C, que se inyecta por vía intravenosa, ya sea con scFv (L19) -mTNFa o PBS (como control negativo) . La inyección es indicada por la flecha y se realizó cuando los tumores eran de aproximadamente 100 a 200 mm3. Los errores estándar se indican.

La invención proporciona el uso de un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana mediante interacción celular, es decir Factor-a de Necrosis Tumoral (TNFa) , y (ii) una sola cadena Fv específica uniéndose a elementos específicos para un componente de la matriz extracelular que está presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas, es decir, fibrorectina ED-B, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la angiogénesis patológica.

En otro aspecto, la invención proporciona un conjugado de (i) una molécula que ejerce un efecto biocida o citotóxico sobre las células diana por interacción celular, es decir, TFNa y (ii) una sola cadena FV específica que se une a un elemento específico de un componente de la matriz extracelular que está presente en la angiogénesis en las lesiones patológicas, es decir, fibrorectina ED-B, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. Dicho tratamiento puede ser de lesiones patológicas... [Seguir leyendo]

1. Conjugado de

(i) una cadena simple Fv (scFv) específica de elemento de unión específico para la fibronectina ED-B, y

(ii) Factor de Necrosis Tumoral a (TNFa) .

2. Conjugado según la reivindicación 1, en el que el elemento de unión específica se conjuga con el TNFa por medio de un enlace peptídico.

3. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento de unión específica compite con el anticuerpo L19 para la unión a la fibronectina ED-B, siendo la secuencia de aminoácidos de L19 revelada en Pini et al (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776.

4. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento de unión específica comprende uno o más dominios de anticuerpo L19 VH y/o VL, siendo las secuencias de aminoácidos de los dominios de anticuerpos L19 VH y VL revelada en Pini et al (1998) J. Biol. Chem. 273: 21769-21776.

5. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el elemento de unión específica comprende los dominios del anticuerpo L19 VH y VL.

6. Conjugado según la reivindicación 1, que comprende una proteína de fusión de (a) dicho elemento de unión específica y (b) TNFa o una cadena de polipéptidos de TNFa que se asocia con una segunda cadena de polipéptidos de TNFa.

7. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo de una persona humana o un animal mediante terapia.

8. Conjugado según la reivindicación 7 para su uso en un procedimiento de tratamiento de la angiogénesis en lesiones patológicas.

9. Conjugado según la reivindicación 8 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un tumor.

10. Uso de un conjugado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la angiogénesis en las lesiones patológicas.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicho medicamento es para el tratamiento de un tumor.