Composiciones y procedimientos de producción de una composición.

Un procedimiento de obtención de una composición que comprende una población de moléculas de CTLA4-Igaislada de un medio de cultivo líquido,

comprendiendo el medio una población inicial de moléculas de CTLA4-Ig, enel que (1) las moléculas de CTLA4-Ig de la población inicial tienen uno o más restos de ácido siálico, (2) el númerode restos de ácido siálico por molécula de CTLA4-Ig varia en la población inicial, (3) la población inicial comprendedímeros y agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig y (4) el medio de cultivo líquido contiene MCP-1,comprendiendo el procedimiento:

(i) recoger el medio de cultivo líquido de un cultivo de células de mamífero que expresen moléculas de CTLA4-Ig;

(ii) separar las moléculas de CTLA4-Ig de los componentes celulares;

(iii) utilizar la cromatografía en columna para reducir el contenido de MCP-1 en la composición;

(iv) utilizar la cromatografía en columna para separar los dímeros de CTLA4-Ig de los agregados de alto pesomolecular de CTLA4-Ig; y

(v) utilizar la cromatografía en columna para separar las moléculas de CTLA4-Ig en dos o más fracciones, en elque al menos una fracción tiene una proporción molar más grande de ácido siálico con respecto a las moléculasde CTLA4-Ig en comparación con al menos la otra fracción;

(vi) en las que las etapas (ii), (iii), (iv) y (v) se realizan simultáneamente, o en cualquier orden, para obtener dichacomposición.

Composiciones y procedimientos de producción de una composición

Antecedentes de la invención El antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4) , un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una molécula expresada por linfocitos T activados. CTLA4 es similar a la molécula co-estimuladora de linfocitos T CD28, y ambas moléculas se unen a B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) en células presentadoras de antígenos (APC) . Sin embargo, el CTLA4 transmite una señal inhibidora a linfocitos T, mientras que CD28 transmite una señal estimuladora.

Las moléculas de CTLA4-Ig son proteínas de fusión del dominio de unión a ligando del antígeno de linfocito T citotóxico 4 (CTLA4) y una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) . Esta molécula soluble ejerce sus efectos fisiológicos uniéndose a antígenos B7 (CD80 y CD86) en la superficie de diversas células presentadoras de antígenos (APC) , bloqueando de este modo la interacción funcional de B7-1 y B7-2 con CD28 en la superficie de linfocitos T. Este bloqueo da como resultado la supresión de activación de linfocitos T, y de este modo, la supresión de la respuesta inmunitaria. Las moléculas de CTLA4-Ig pueden por lo tanto proporcionar un procedimiento de inhibición de rechazo de trasplantes de tejidos y/u órganos sólidos, así como un uso terapéutico para enfermedades o trastornos relacionados con respuestas inmunitarias desreguladas en general, incluyendo autoinmunidad. Por ejemplo, las moléculas de CTLA4-Ig pueden suprimir la producción de anticuerpos anti-ADNbc y reducir la nefritis en ratones propensos a lupus; pueden reducir la proteinuria y prolongar la supervivencia en ratones con nefritis avanzada; y pueden mejorar los resultados clínicos para psoriasis y artritis reumatoide.

Para mejorar la utilidad terapéutica de moléculas de CTLA4-Ig, es importante determinar alteraciones moleculares que pueden hacerse para potenciar la eficacia de la molécula como un inhibidor de la estimulación de linfocitos T, por ejemplo, aumentando la avidez y potencia de la molécula por antígenos B7. Un aumento en la avidez y potencia de moléculas de CTLA4-Ig puede posibilitar la administración de una cantidad reducida de moléculas de CTLA4-Ig a un paciente para conseguir un efecto terapéutico deseado (es decir, administración de una dosis menor) . Un aumento en la avidez y potencia de moléculas de CTLA4-Ig también puede reducir el número de dosis o la frecuencia de dosis que se administran a un paciente para conseguir un efecto terapéutico deseado.

Sumario de la invención La presente invención se refiere a procedimientos mejorados para producir composiciones de CTLA4-Ig. La invención se refiere a un procedimiento para obtener una composición que comprenda una población aislada de moléculas de CTLA4-Ig de un medio líquido de cultivo, comprendiendo el medio una población inicial de moléculas de CTL4-Ig, en el que (1) las moléculas de CTL4-Ig de la población inicial tienen uno o más restos de ácido sialíco,

(2) el número de restos de ácido sialico por molécula de CTL4-Ig varía en la población inicial, (3) la población inicial comprende dímeros y agregados de CTL4-Ig de alto peso molecular, y (4) el medio de cultivo líquido contiene MCP1, comprendiendo el procedimiento:

(i) recoger el medio de cultivo líquido de un cultivo de células de mamífero que expresen moléculas de CTL4-Ig;

(ii) separar las moléculas de CTL4-Ig de componentes celulares;

(iii) usar cromatografía en columna para reducir el contenido de MCP-1 en la composición ;

(iv) usar cromatografía en columna para separar los dímeros de CTL4-Ig de los agregados de CTL4-Ig de alto peso molecular; y

(v) usar cromatografía en columna para separar las moléculas de CTL4-Ig en dos o más fracciones, en el que al menos una fracción tiene una proporción molar de ácido siálico con respecto a moléculas de CTL4-Ig mayor en comparación con al menos la otra fracción;

en el que las etapas (ii) , (iii) , (iv) y (v) se realizan simultáneamente, o en cualquier orden, para obtener dicha composición.

Las siguientes células, composiciones, formulaciones, kits, procedimientos de tratamiento y procedimientos de producción de CTLA4-Ig, se describen para ilustrar el procedimiento de la invención y sus usos.

Células: Se describen en el presente documento una población clonal de células de ovario de hámster chino capaces de producir CTLA4-Ig; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, comprendiendo cada célula 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, comprendiendo cada célula 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que un casete de expresión de CTLA4-Ig es estable durante aproximadamente 105 pases. El CTLA4-Ig puede codificarse por un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita por Koduri R., y col.

(Gene, 2001, 280: 87-95) y en las Patentes de Estados Unidos Nº. 6.800.457 y 6.521.419. El CTLA4-Ig también puede codificarse por un casete de expresión integrado en un genoma celular de la población celular en un locus específico descrito por Koduri R., y col. (Gene, 2001, 280: 87-95) y en las Patentes de Estados Unidos Nº. 6.800.457 y 6.521.419. La población puede comprender una subpoblación de células que comprenden 33 o más copias del casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 33 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula de la subpoblación.

Se describe en el presente documento una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que al menos el 75% de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula del 75% de la población; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que al menos el 85% de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula del 85% de la población; una población clonal de células de ovario de hámster chino capaz de producir CTLA4-Ig, en la que al menos el 95% de la población de células tiene 30 o más copias de un casete de expresión de CTLA4-Ig, en la que las 30 o más copias están integradas en un único sitio en el genoma de cada célula en el 95% de la población. La población celular puede ser una población capaz de producir más de 0, 5 o más gramos de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultivo líquido, y en la que el CTLA4-Ig muestra características de carbohidratos aceptables, cuando la proporción molar de ácido siálico y CTLA4-Ig es de aproximadamente 6 a aproximadamente 14 a una escala de cultivo de 1000 l o más. La población celular puede ser una población adaptada a medio químicamente definido, sin suero. El CTLA4-Ig producido a partir del cultivo de la población celular puede tener un coeficiente de extinción de 1, 00 ± 0, 05 UA ml cm-1 mg-1. La población celular puede ser una población que, cuando se deja crecer en cultivo, es capaz de producir polipéptidos de CTLA4-Ig, en la que: (a) aproximadamente el 90% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden una secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la metionina en el resto 27; (b) aproximadamente el 10% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la alanina en el número de resto 26; (c) aproximadamente el 4% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que termina con la lisina en el número de resto 383,

(d) aproximadamente el 96% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que termina con la glicina en el número de resto 382; y opcionalmente, (e) aproximadamente menos del 1% de los polipéptidos de CTLA4-Ig comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 2 que comienza con la metionina en el número de resto 25.

Se describe en el presente documento una célula descendiente de la célula clonal, en la que la célula descendiente produce CTLA4-Ig. La célula descendiente puede obtenerse de cultivo de la célula parental clonal durante al menos 5 generaciones. La célula descendiente puede obtenerse de cultivo de una célula... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de obtención de una composición que comprende una población de moléculas de CTLA4-Ig aislada de un medio de cultivo líquido, comprendiendo el medio una población inicial de moléculas de CTLA4-Ig, en el que (1) las moléculas de CTLA4-Ig de la población inicial tienen uno o más restos de ácido siálico, (2) el número de restos de ácido siálico por molécula de CTLA4-Ig varia en la población inicial, (3) la población inicial comprende dímeros y agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig y (4) el medio de cultivo líquido contiene MCP-1, comprendiendo el procedimiento:

(i) recoger el medio de cultivo líquido de un cultivo de células de mamífero que expresen moléculas de CTLA4-Ig;

(ii) separar las moléculas de CTLA4-Ig de los componentes celulares;

(iii) utilizar la cromatografía en columna para reducir el contenido de MCP-1 en la composición;

(iv) utilizar la cromatografía en columna para separar los dímeros de CTLA4-Ig de los agregados de alto peso molecular de CTLA4-Ig; y

(v) utilizar la cromatografía en columna para separar las moléculas de CTLA4-Ig en dos o más fracciones, en el que al menos una fracción tiene una proporción molar más grande de ácido siálico con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig en comparación con al menos la otra fracción;

(vi) en las que las etapas (ii) , (iii) , (iv) y (v) se realizan simultáneamente, o en cualquier orden, para obtener dicha composición.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por una proporción molar media de NANA con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig mayor que, o igual a, 8, 0.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por un porcentaje de área menor que, o igual a, 2, 5 de especies de CTLA4-Ig de alto peso molecular, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición comprende una cantidad de MCP-1 menor que,

o igual a, 3 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por una proporción molar media de NANA con respecto a las moléculas de CTLA4-Ig mayor que, o igual a, 5, 0.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas de CTLA4-Ig de la composición se caracterizan por un porcentaje de área menor que, o igual a, 4, 0 de especies de CTLA4-Ig de alto peso molecular, determinado por cromatografía de exclusión por tamaño y detección espectrofotométrica.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la composición no comprende más de 5 ppm de MCP-1.