Composiciones para potenciar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células.

Un conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico, que comprende un péptido covalentemente unido a un análogo de ácido nucleico,

análogo de ácido nucleico que comprende una cadena principal sustancialmente no cargada y una secuencia de bases de direccionamiento, y péptido que consiste en de ocho a dieciséis subunidades y que comprende al menos seis subunidades X, al menos dos subunidades Y y hasta tres subunidades Z opcionales, donde >50% de las subunidades son subunidades X, en donde

(a) cada subunidad X es independientemente arginina o un análogo de arginina, siendo el análogo de arginina un α-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de estructura R1N≥C(NH2)R2, donde R1 es H o R; R2 es R, NH2, NHR o NR2, donde R es alquilo inferior o alquenilo inferior y comprende opcionalmente oxígeno o nitrógeno, o R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo; y en donde la cadena lateral está unida al aminoácido a través de R1 o R2;

(b) las al menos dos subunidades Y comprenden dos subunidades de α-aminoácido hidrófobo neutro que comprenden una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada seis átomos de carbono, y en donde las subunidades Y son contiguas o están flanqueando un componente conector; y

(c) cada subunidad Z representa independientemente una subunidad de aminoácido seleccionada de entre alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, serina y treonina;

en donde el péptido está opcionalmente unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector seleccionado de entre:

(i) una subunidad de cisteína;

(ii) un componente conector no aminoácido sin carga;

(iii) un α-aminoácido hidrófobo neutro que comprende una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada dos átomos de carbono; y

(iv) un aminoácido hidrófobo neutro que tiene la estructura siguiente:

-C(O)-(CH2)n-1(CHR)-NHen

donde n es de 2 a 7 y R es H o metilo.

Composiciones para potenciar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células Campo de la invención

La Invención se refiere a composiciones y métodos para potenciar el suministro de moléculas, por ejemplo, agentes biológicos, a células, y en particular al suministro intracelular y la unión potenciada de análogos de ácido nucleico sustancialmente sin carga, particularmente oligómeros de morfollno con enlaces fosforodlamldato.

Referencias

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Antecedentes de la Invención

La utilidad práctica de muchos fármacos con actividad biológica potenclalmente útil se ve a menudo bloqueada por la dificultad de suministro de tales fármacos a sus dianas. Los compuestos que se han de suministrar a las células deben generalmente suministrarse desde un entorno extracelular en su mayor parte acuoso y penetrar seguidamente en una membrana celular lipofílica para poder entrar en la célula. A menos que la sustancia sea transportada activamente mediante un mecanismo de transporte especifico, muchas moléculas, particularmente moléculas grandes, son muy lipofílicas para solubilizarse en la práctica o son demasiado hidrófilas para penetraren la membrana.

Un segmento de la proteína Tat del HIV que consiste en los restos de aminoácido 49-57 (Tat 49-57, que tiene la secuencia RKKRRQRRR) se ha utilizado para suministrar péptidos y proteínas biológicamente activos a células (por ejemplo, Barsoum et al., 1994, Publicación PCT n° WO 94/04686). Se ha utilizado Tat (49-60) para potenciar el suministro de oligonucleótidos de fosforotioato (Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2000; Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2002). Se ha publicado que la Tat inversa, o rTat (57-49) (RRRQRRKKR), suministra fluoresceína a las células con una eficacia potenciada en comparación con Tat (49-57) (Wender, Mitchell et al. 2000; Rothbard, Kreider et al. 2002). Rothbard y Wender han descrito también otros polímeros de transporte ricos en arginina (Publicación PCT n° WO 01/62297; Patente de EE.UU. n° 6,306,993; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2003/0032593).

Los oligonucleótidos son una clase de compuestos farmacológicos potencialmente útiles cuyo suministro ha sido con frecuencia un Impedimento para su uso terapéutico. Se ha descubierto que los ollgómeros de morfollno con enlaces fosforodlamldato (PMOs, del inglés "phosphorodiamidate-llnked morpholino ollgomers"; véase, por ejemplo, Summerton y Weller, 1997) son más prometedores a este respecto que los análogos de oligonucleótidos con carga tales como los fosforotioatos. Los PMOs son moléculas antlsentldo solubles en agua, sin carga o sustanclalmente sin carga, que Inhiben la expresión génica impidiendo la unión o progresión de los componentes de la maquinarla de corte y empalme o traslacional. También se ha demostrado que los PMOs Inhiben o bloquean la repllcaclón viral (Stein, Skilllng et al. 2001; McCaffrey, Meuse et al. 2003). Son muy resistentes a la digestión enzlmátlca (Fludziak, Barofsky et al. 1996). Los PMOs han demostrado tener una especificidad y una eficacia antlsentldo elevadas in vitro en modelos libres de células y de cultivo celular (Stein, Foster et al. 1997; Summerton y Weller, 1997), e in vivo en embriones de pez cebra, rana y erizo de mar (Fleasman, Kofron et al. 2000; Nasevicius y Ekker, 2000), así como en modelos de animales adultos, tales como ratas, ratones, conejos, perros y cerdos (véanse, por ejemplo, Arora e Iversen 2000; Qin, Taylor et al. 2000; Iversen 2001; Kipshidze, Keane et al. 2001; Devl 2002; Devi, Oldenkamp etal. 2002; Kipshidze, Kim et al. 2002; Rlcker, Mata et al. 2002).

Se ha demostrado que los oligómeros PMO antlsentido se Incorporan a las células y son más consistentemente eficaces in vivo, con menos efectos inespecíficos, que otros oligonucleótidos antlsentldo generalmente utilizados (véase, por ejemplo, P. Iversen, "Phosphoramldlte Morpholino... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico, que comprende un péptido covalentemente unido a un análogo de ácido nucleico, análogo de ácido nucleico que comprende una cadena principal sustancialmente no cargada y una secuencia de bases de direccionamiento, y péptido que consiste en de ocho a dieciséis subunidades y que comprende al menos seis subunidades X, al menos dos subunidades Y y hasta tres subunidades Z opcionales, donde > 50% de las subunidades son subunidades X, en donde

(a) cada subunidad X es independientemente arginina o un análogo de arginina, siendo el análogo de arginina un a-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de estructura R1N=C(NH2)R2, donde R1 es H o R; R2 es R, NH2, NHR o NR2, donde R es alquilo inferior o alquenilo inferior y comprende opcionalmente oxígeno o nitrógeno, o R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo; y en donde la cadena lateral está unida al aminoácido a través de R1 o R2;

(b) las al menos dos subunidades Y comprenden dos subunidades de a-aminoácido hidrófobo neutro que comprenden una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada seis átomos de carbono, y en donde las subunidades Y son contiguas o están flanqueando un componente

conectar; y

(c) cada subunidad Z representa independientemente una subunidad de aminoácido seleccionada de entre alanina, asparagina, cisterna, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, serina ytreonina;

en donde el péptido está opcionalmente unido al análogo de ácido nucleico a través de un conectar

seleccionado de entre:

(i) una subunidad de cisterna;

(¡i) un componente conector no aminoácido sin carga;

(iii) un a-aminoácido hidrófobo neutro que comprende una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada dos átomos de carbono; y

(¡v) un aminoácido hidrófobo neutro que tiene la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-i(CHR)-NH-

en donde n es de 2 a 7 y R es H o metilo.

2. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde el péptido está unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector que comprende uno o más aminoácidos artificiales que tienen la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-NH-

en donde n es de 2 a 7.

3. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 2, en donde el conector comprende una subunidad de (3-alanlna, una subunidad de ácido 6-aminohexanoico o combinaciones de las mismas.

4. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde cada subunidad Y es fenllalanlna.

5. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde cada subunidad X es arginina.

6. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde el péptido tiene la secuencia Identificada como ID. SEC. n° 13 o ID. SEC. n° 20.

7. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde el análogo de ácido nucleico es un oligómero de morfolino que comprende subunidades de morfolino unidas por enlaces que contienen fósforo entre el nitrógeno morfolínico de una subunidad y un carbono exociclico de la posición morfolínlca 3 de una subunidad adyacente.

8. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 7, en donde la subunidades de morfolino están unidas por enlaces que contienen fósforo según la estructura:

Z=PX

I

I

*/WV

I

en donde:

Yi es O;

Z es O;

X es alquilo, alcoxilo, tioalcoxilo o alquilamino; y

Pj es un componente de purina o pirimidina que forma pares de bases, eficaz para unirse a una base de un polinucleótido mediante enlace de hidrógeno específico de bases.

9. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 8, en donde X es dimetilamino.

10. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 7, en donde el péptido está unido al extremo 5' o el extremo 3' del análogo de ácido nucleico.

11. Un conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico, que comprende un péptido covalentemente unido a un análogo de ácido nucleico, análogo de ácido nucleico que comprende una cadena principal sustancialmente no cargada y una secuencia de bases de direccionamiento, y péptido que comprende la secuencia identificada como ID. SEC. n° 12, 13 o 20, en donde el péptido está opcionalmente unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector seleccionado de entre:

(i) una subunidad de cisteína;

(¡i) un componente conector no aminoácido sin carga;

(¡¡i) un a-aminoácido hidrófobo neutro que comprende una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada dos átomos de carbono; y

(iv) un aminoácido hidrófobo neutro que tiene la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-i(CHR)-NH-

en donde n es de 2 a 7 y R es H o metilo.

12. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 11, en donde el péptido está unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector que comprende uno o más aminoácidos artificiales que tienen la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-NH-

en donde n es de 2 a 7.

13. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 12, en donde el conector comprende una subunidad de p-alanina, una subunidad de ácido 6-aminohexanoico o combinaciones de las mismas.

14. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 11, en donde el análogo de ácido nucleico comprende un análogo de ácido nucleico morfolínico, análogo de ácido nucleico morfolínico que comprende subunidades de morfolino unidas por enlaces que contienen fósforo, enlaces que contienen fósforo que unen el nitrógeno morfolínico de una subunidad de morfolino con un carbono exocíclico de la posición morfolínica 3 de una subunidad de morfolino adyacente.

15. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 14, en donde la subunidades de morfolino están unidas por enlaces que contienen fósforo según la estructura:

s/WV

Z=PX

I

en donde Yi es O;

Z es O;

X es alquilo, alcoxilo, tioalcoxilo o alquilamino; y

Pj es un componente de purina o pirimidina que forma pares de bases, eficaz para unirse a una base de un polinucleótido mediante enlace de hidrógeno específico de bases.