Composiciones para potenciar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células.

Un conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico, que comprende un péptido covalentemente unido a un análogo de ácido nucleico, análogo de ácido nucleico que comprende una cadena principal sustancialmente no cargada y una secuencia de bases de direccionamiento, y péptido que consiste en de ocho a dieciséis subunidades y que comprende al menos seis subunidades X, al menos dos subunidades Y y hasta tres subunidades Z opcionales, donde >50% de las subunidades son subunidades X, en donde

(a) cada subunidad X es independientemente arginina o un análogo de arginina, siendo el análogo de arginina un α-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de estructura R1N≥C(NH2)R2, donde R1 es H o R; R2 es R, NH2, NHR o NR2, donde R es alquilo inferior o alquenilo inferior y comprende opcionalmente oxígeno o nitrógeno, o R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo; y en donde la cadena lateral está unida al aminoácido a través de R1 o R2;

(b) las al menos dos subunidades Y comprenden dos subunidades de α-aminoácido hidrófobo neutro que comprenden una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada seis átomos de carbono, y en donde las subunidades Y son contiguas o están flanqueando un componente conector; y

(c) cada subunidad Z representa independientemente una subunidad de aminoácido seleccionada de entre alanina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, serina y treonina;

en donde el péptido está opcionalmente unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector seleccionado de entre:

(i) una subunidad de cisteína;

(ii) un componente conector no aminoácido sin carga;

(iii) un α-aminoácido hidrófobo neutro que comprende una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada dos átomos de carbono; y

(iv) un aminoácido hidrófobo neutro que tiene la estructura siguiente:

-C(O)-(CH2)n-1(CHR)-NHen

donde n es de 2 a 7 y R es H o metilo.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10174646.

Solicitante: Sarepta Therapeutics, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 3450 Monte Villa Parkway, Suite 101 Bothell, Washington 98021 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: IVERSEN, PATRICK, L., STEIN,DAVID,A, MOULTON,HONG,M, NELSON,MICHELLE,H, KROEKER,ANDREW,D.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por los... > A61K47/48 (estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K7/00 (Péptidos con 5 a 20 aminoácidos en una secuencia totalmente determinada; Sus derivados)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K49/00 (Preparaciones para examen in vivo )
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > A61K38/00 (Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/113 (Acidos nucleicos no codificantes que modulan la expresión de genes, p.ej. oligonucleótidos antisentido)

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Fragmento de la descripción:

Composiciones para potenciar el transporte y la eficacia antisentido de análogos de ácidos nucleicos en células Campo de la invención

La Invención se refiere a composiciones y métodos para potenciar el suministro de moléculas, por ejemplo, agentes biológicos, a células, y en particular al suministro intracelular y la unión potenciada de análogos de ácido nucleico sustancialmente sin carga, particularmente oligómeros de morfollno con enlaces fosforodlamldato.

Referencias

Arora, V. y P. L. Iversen (2000). "Antisense oligonucleotldes targeted to the p53 gene modulate llver regeneraron in vivo". Drug Metab. Dispos. 28 (2): 131-8.

Astriab Fisher, A., D. Sergueev et al. (2002). "Conjugates of antisense oligonucleotldes wlth the Tat and antennapedia cell-penetrating peptides: effects on cellular uptake, binding to target sequences, and blologlc actions". Pharm. Res. 19 (6): 744-54.

Astriab-Fisher, A., D. S. Sergueev ef al. (2000). "Antisense ¡nhlbltion of P-glycoproteln expresslon uslng peptlde- oligonucleotide conjugates". Biochem. Pharmacol. 60 (1): 83-90.

Devi, G. R. (2002). "Prostate cáncer: status of current treatments and emerglng antlsense-based theraples". Curr. Opin. Mol. Ther. 4 (2): 138-48.

Devi, G. R., J. R. Oldenkamp et al. (2002). "Inhibition of human chorionlc gonadotropln beta-subunlt modulates the mitogenic effect of c-myc in human prostate cáncer cells". Prostate 53 (3): 200-10.

Fleasman, J., M. Kofron et al. (2000). "Beta-catenin signallng actlvity dissected ¡n the early Xenopus embryo: a novel antisense approach". Dev. Biol. 222 (1): 124-34.

Fludziak, R. M., E. Barofsky et al. (1996). "Resistance of morphollno phosphorodlamldate ollgomers to enzymatic degradation". Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6 (4): 267-72.

Iversen, P. L. (2001). Phosphoramidite Morpholino Oligomers. Antisense Drug Technology. S. T. Crooke, New York, Marcel Dekker, Inc.

Kang, S. H., M. J. Cho et al. (1998). "Up-regulation of luciferase gene expression with antisense oligonucleotides: implications and applications in functional assay development". Biochemistry 37 (18): 6235-9.

Khromykh, A. A., N. Kondratieva ef al. (2003). "Significance in replication of the terminal nucleoides of the flavivirus genome". J. Virol. 77 (19): 10.623-9.

Kipshidze, N., E. Keane et al. (2001). "Local delivery of c-myc neutrally charged antisense oligonucleotldes wlth transport catheter inhibits myointimal hyperplasia and positively affects vascular remodeling in the rabblt balloon injury model". Catheter Cardiovasc. Interv. 54 (2): 247-56.

Kipshidze, N. N., H. S. Kim et al. (2002). "Intramural coronary delivery of advanced antisense oligonucleotldes reduces neointimal formation in the porcine stent restenosis model". J. Am. Coll. Cardiol. 39 (10): 1686-91.

McCaffrey, A. P., L. Meuse ef al. (2003). "A potent and specific morpholino antisense inhibitor of hepatitis C translation in mice". Hepatology 38 (2): 503-8.

Moulton, H. M., M. C. Hase ef al. (2003). "HIV Tat peptide enhances cellular delivery of antisense morpholino oligomers". Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13 (1): 31-43.

Moulton, H. M., M. H. Nelson ef al. (2004). "Cellular uptake of antisense morpholino oligomers conjugated to arginine-rich peptides". Bioconjug. Chem. 15 (2): 290-9.

Nasevicius, A. y S. C. Ekker (2000), "Effective targeted gene "knockdown" in zebrafish". Nat. Genet. 26 (2): 216- 20.

Qin, G., M. Taylor ef al. (2000). "In vivo evaluation of a morpholino antisense oligomer directed against tumor necrosis factor-alpha". Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10 (1): 11-6.

Richard, J. P., K. Melikov ef al. (2003). "Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake". J. Biol. Chem. 278 (1): 585-90.

Ricker, J. L., J. E. Mata ef al. (2002). "c-myc Antisense oligonucleotide treatment ameliorates murine ARPKD".

Kidney Int. 61 Suppl. 1: 125-131.

Rothbard, J. B., E. Kreider et al. (2002). "Arginine-rich molecular transporters for drug delivery: role of backbone spacing in cellular uptake". J. Med. Chem. 45 (17): 3612-8.

Stein, D., E. Foster et al. (1997). "A specificlty comparlson of four antlsense types: morpholino, 2'-0-methyl RNA, DNA, and phosphorothloate DNA". Antlsense Nuclelc Acld Drug Dev. 7 (3): 151-7.

Stein, D. A, D. E. Skilllng et al. (2001). "Inhibition of veslvlrus ¡nfectlons ¡n mammalian tissue culture wlth antisense morpholino ollgomers". Antlsense Nuclelc Acld Drug Dev. 11 (5): 317-25.

Summerton, J. y D. Weller (1997). "Morpholino antlsense ollgomers: deslgn, preparation, and propertles". Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7 (3): 187-95.

Tisne, C., B. P. Roques et al. (2004). "The anneallng mechamsm of HIV-1 reverse transcription primer onto the viral genome". J. Biol. Chem. 279 (5): 3588-3595.

Wender, P. A., D. J. Mltchell et al. (2000). "The deslgn, synthesls, and evaluatlon of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptold molecular transporters". Proc. Nati. Acad. Sel. USA 97 (24): 13.003-8.

Yoo, H., P. Sazani etal. (1999). "PAMAM dendrlmers as delivery agents for antlsense oligonucleotldes". Pharm. Res. 16 (12): 1799-804.

Zuker, M. (2003). "Mfold web server for nuclelc acld folding and hybrldlzatlon predlctlon". Nuclelc Aclds Res. 31

(13): 3406-15.

Antecedentes de la Invención

La utilidad práctica de muchos fármacos con actividad biológica potenclalmente útil se ve a menudo bloqueada por la dificultad de suministro de tales fármacos a sus dianas. Los compuestos que se han de suministrar a las células deben generalmente suministrarse desde un entorno extracelular en su mayor parte acuoso y penetrar seguidamente en una membrana celular lipofílica para poder entrar en la célula. A menos que la sustancia sea transportada activamente mediante un mecanismo de transporte especifico, muchas moléculas, particularmente moléculas grandes, son muy lipofílicas para solubilizarse en la práctica o son demasiado hidrófilas para penetraren la membrana.

Un segmento de la proteína Tat del HIV que consiste en los restos de aminoácido 49-57 (Tat 49-57, que tiene la secuencia RKKRRQRRR) se ha utilizado para suministrar péptidos y proteínas biológicamente activos a células (por ejemplo, Barsoum et al., 1994, Publicación PCT n° WO 94/04686). Se ha utilizado Tat (49-60) para potenciar el suministro de oligonucleótidos de fosforotioato (Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2000; Astriab-Fisher, Sergueev et al. 2002). Se ha publicado que la Tat inversa, o rTat (57-49) (RRRQRRKKR), suministra fluoresceína a las células con una eficacia potenciada en comparación con Tat (49-57) (Wender, Mitchell et al. 2000; Rothbard, Kreider et al. 2002). Rothbard y Wender han descrito también otros polímeros de transporte ricos en arginina (Publicación PCT n° WO 01/62297; Patente de EE.UU. n° 6,306,993; Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2003/0032593).

Los oligonucleótidos son una clase de compuestos farmacológicos potencialmente útiles cuyo suministro ha sido con frecuencia un Impedimento para su uso terapéutico. Se ha descubierto que los ollgómeros de morfollno con enlaces fosforodlamldato (PMOs, del inglés "phosphorodiamidate-llnked morpholino ollgomers"; véase, por ejemplo, Summerton y Weller, 1997) son más prometedores a este respecto que los análogos de oligonucleótidos con carga tales como los fosforotioatos. Los PMOs son moléculas antlsentldo solubles en agua, sin carga o sustanclalmente sin carga, que Inhiben la expresión génica impidiendo la unión o progresión de los componentes de la maquinarla de corte y empalme o traslacional. También se ha demostrado que los PMOs Inhiben o bloquean la repllcaclón viral (Stein, Skilllng et al. 2001; McCaffrey, Meuse... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico, que comprende un péptido covalentemente unido a un análogo de ácido nucleico, análogo de ácido nucleico que comprende una cadena principal sustancialmente no cargada y una secuencia de bases de direccionamiento, y péptido que consiste en de ocho a dieciséis subunidades y que comprende al menos seis subunidades X, al menos dos subunidades Y y hasta tres subunidades Z opcionales, donde > 50% de las subunidades son subunidades X, en donde

(a) cada subunidad X es independientemente arginina o un análogo de arginina, siendo el análogo de arginina un a-aminoácido catiónico que comprende una cadena lateral de estructura R1N=C(NH2)R2, donde R1 es H o R; R2 es R, NH2, NHR o NR2, donde R es alquilo inferior o alquenilo inferior y comprende opcionalmente oxígeno o nitrógeno, o R1 y R2 pueden formar conjuntamente un anillo; y en donde la cadena lateral está unida al aminoácido a través de R1 o R2;

(b) las al menos dos subunidades Y comprenden dos subunidades de a-aminoácido hidrófobo neutro que comprenden una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada seis átomos de carbono, y en donde las subunidades Y son contiguas o están flanqueando un componente

conectar; y

(c) cada subunidad Z representa independientemente una subunidad de aminoácido seleccionada de entre alanina, asparagina, cisterna, glutamina, glicina, histidina, lisina, metionina, serina ytreonina;

en donde el péptido está opcionalmente unido al análogo de ácido nucleico a través de un conectar

seleccionado de entre:

(i) una subunidad de cisterna;

(¡i) un componente conector no aminoácido sin carga;

(iii) un a-aminoácido hidrófobo neutro que comprende una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada dos átomos de carbono; y

(¡v) un aminoácido hidrófobo neutro que tiene la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-i(CHR)-NH-

en donde n es de 2 a 7 y R es H o metilo.

2. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde el péptido está unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector que comprende uno o más aminoácidos artificiales que tienen la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-NH-

en donde n es de 2 a 7.

3. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 2, en donde el conector comprende una subunidad de (3-alanlna, una subunidad de ácido 6-aminohexanoico o combinaciones de las mismas.

4. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde cada subunidad Y es fenllalanlna.

5. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde cada subunidad X es arginina.

6. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde el péptido tiene la secuencia Identificada como ID. SEC. n° 13 o ID. SEC. n° 20.

7. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 1, en donde el análogo de ácido nucleico es un oligómero de morfolino que comprende subunidades de morfolino unidas por enlaces que contienen fósforo entre el nitrógeno morfolínico de una subunidad y un carbono exociclico de la posición morfolínlca 3 de una subunidad adyacente.

8. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 7, en donde la subunidades de morfolino están unidas por enlaces que contienen fósforo según la estructura:

Z=PX

I

I

*/WV

I

en donde:

Yi es O;

Z es O;

X es alquilo, alcoxilo, tioalcoxilo o alquilamino; y

Pj es un componente de purina o pirimidina que forma pares de bases, eficaz para unirse a una base de un polinucleótido mediante enlace de hidrógeno específico de bases.

9. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 8, en donde X es dimetilamino.

10. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 7, en donde el péptido está unido al extremo 5' o el extremo 3' del análogo de ácido nucleico.

11. Un conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico, que comprende un péptido covalentemente unido a un análogo de ácido nucleico, análogo de ácido nucleico que comprende una cadena principal sustancialmente no cargada y una secuencia de bases de direccionamiento, y péptido que comprende la secuencia identificada como ID. SEC. n° 12, 13 o 20, en donde el péptido está opcionalmente unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector seleccionado de entre:

(i) una subunidad de cisteína;

(¡i) un componente conector no aminoácido sin carga;

(¡¡i) un a-aminoácido hidrófobo neutro que comprende una cadena lateral de alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo o aralquilo sustituida o no sustituida, en donde la cadena lateral de alquilo, alquenilo o alquinilo incluye a lo sumo un heteroátomo por cada dos átomos de carbono; y

(iv) un aminoácido hidrófobo neutro que tiene la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-i(CHR)-NH-

en donde n es de 2 a 7 y R es H o metilo.

12. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 11, en donde el péptido está unido al análogo de ácido nucleico a través de un conector que comprende uno o más aminoácidos artificiales que tienen la estructura siguiente:

-C(0)-(CH2)n-NH-

en donde n es de 2 a 7.

13. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 12, en donde el conector comprende una subunidad de p-alanina, una subunidad de ácido 6-aminohexanoico o combinaciones de las mismas.

14. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 11, en donde el análogo de ácido nucleico comprende un análogo de ácido nucleico morfolínico, análogo de ácido nucleico morfolínico que comprende subunidades de morfolino unidas por enlaces que contienen fósforo, enlaces que contienen fósforo que unen el nitrógeno morfolínico de una subunidad de morfolino con un carbono exocíclico de la posición morfolínica 3 de una subunidad de morfolino adyacente.

15. El conjugado de péptido-análogo de ácido nucleico de la Reivindicación 14, en donde la subunidades de morfolino están unidas por enlaces que contienen fósforo según la estructura:

s/WV

Z=PX

I

en donde Yi es O;

Z es O;

X es alquilo, alcoxilo, tioalcoxilo o alquilamino; y

Pj es un componente de purina o pirimidina que forma pares de bases, eficaz para unirse a una base de un polinucleótido mediante enlace de hidrógeno específico de bases.