Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante,

en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nºs: 10, 13, 14 ó 15.

Composiciones y métodos para la preparación de mutantes de glucosilación de la hormona del crecimiento humana.

Antecedentes de la invención

La Hormona del crecimiento humana (hGH) y las variantes agonistas de la misma son miembros de una familia de proteínas recombinantes descritas en la pat. de EE.UU. nº 4.658.021 y la pat. de EE.UU. nº 5.633.352. Su producción recombinante y métodos de uso se detallan en las pat. de EE.UU. nº s 4.342.832, 4.601.980; pat. de EE.UU. nº 4.898.830; pat. de EE.UU. nº 5.424.199; y pat. de EE.UU. nº 5.795.745. La hormona del crecimiento humana participa en diversos aspectos de la regulación del crecimiento y desarrollo humano normal. Por medio de la interacción con sus receptores, esta hormona hipofisaria de 22 kDa modula una multitud de efectos biológicos, tales como el crecimiento lineal (somatogénesis) , lactación, activación de macrófagos, y efectos similares a la insulina y diabetógenos. Chawla, Annu. Rev. Med., 34: 519 (1983) ; Edwards et al., Science, 239: 769 (1988) ; Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol., 47: 483 (1985) ; Thomer y Vance, J. Clin. Invest., 82: 745 (1988) ; Hughes y Friesen, Annu. Rev. Physiol., 47: 469 (1985) .

La administración de péptidos glicosilados y no glicosilados para provocar una respuesta fisiológica particular se conoce bien en la técnica médica. La hGH tanto purificada como recombinante se ha usado para tratar afecciones y enfermedades debidas a una deficiencia de hGH, p.ej., enanismo en niños. Un factor importante que ha limitado el uso de los péptidos terapéuticos es la naturaleza inmunógena de la mayoría de los péptidos. En un paciente, una respuesta inmunógena hacia un péptido administrado puede neutralizar el péptido y/o conducir al desarrollo de una respuesta alérgica en el paciente. Otras deficiencias de los glicopéptidos terapéuticos incluyen una potencia subóptima y velocidades de eliminación elevadas. Los problemas inherentes en los compuestos terapéuticos peptídicos se han reconocido en la técnica, y se han investigado diversos métodos para resolver estos problemas. Por ejemplo, para proporcionar compuestos terapéuticos de péptidos solubles, se han unido polímeros sintéticos al esqueleto peptídico.

Poli (etilenglicol) ("PEG") es un polímero ejemplar que se ha conjugado a polipéptidos. Se ha demostrado que el uso de PEG para derivatizar compuestos terapéuticos peptídicos reduce la inmunogenicidad de los péptidos. Por ejemplo, la pat. de EE.UU. nº 4.179.337 (Davis et al.) Se refiere a polipéptidos no inmunógenos, tales como enzimas y hormonas peptídicas acopladas a polietilen glicol (PEG) o polipropilen glicol. Se usan entre 10 y 100 moles de polímero por mol de polipéptido, y se mantiene al menos un 15% de la actividad fisiológica. Además, el tiempo de eliminación de la circulación se prolonga debido al tamaño incrementado del conjugado con PEG de los polipéptidos en cuestión. Los métodos descritos por Davis et al. son métodos de PEG-ilación química.

La modificación química de péptidos da como resultado con frecuencia una pérdida indeseable de actividad del péptido, que es atribuible a la naturaleza no selectiva de los procedimientos químicos utilizados para modificar el péptido. Por ejemplo, cuando el grupo modificador es un péptido hidrosoluble, p.ej. PEG, el modo principal de unión de PEG y de sus derivados a los péptidos es una unión inespecífica a través de un residuo de aminoácido del péptido. Los estudios de conjugados de polímeros hidrosolubles e interleucina-2 (Fisher et al., Br. J. Haematol., 82: 654 (1992) ) , factor estimulante de colonias de granulocitos (Satake-Ishikawa et al., Cell Struct. Funct., 17: 157 (1992) ) , factor de necrosis tumoral (Tsutsumi et al., Br. J. Cancer, 71: 963 (1996) ) y hormona del crecimiento humana (Clark, et al., J. Biol. Chem., 271:21969 (1996) ) han revelado que la PEGilación química de estas proteínas disminuyen la actividad de unión al receptor in vivo de los péptidos.

En muchos métodos de PEGilación química, se añade poli (etilenglicol) de una manera básicamente aleatoria, inespecífica, a residuos reactivos de un esqueleto peptídico. Para la producción de péptidos terapéuticos, es claramente deseable utilizar una estrategia de derivatización que dé como resultado la formación de un producto marcado de manera específica, fácilmente caracterizable y esencialmente homogéneo. Una vía prometedora para preparar péptidos marcados de manera específica es por medio del uso de enzimas, tales como glicosiltransferasas, para unir un resto de carbohidrato modificado a un péptido.

Las síntesis basadas en enzimas tienen la ventaja de tener regioselectividad y estereoselectividad. Además, las síntesis enzimáticas se llevan a cabo mediante el uso de sustratos sin protección. Se usan tres clases principales de enzimas en la síntesis de carbohidratos, glicosiltransferasas (p.ej. sialiltransferasas, oligosacariltransferasas, N-acetilglucosaminiltransferasas) , y glicosidasas. Las glicosidasas se clasifican además como exoglicosidasas (p.ej., ºmanosidasa, º-glucosidasa) , y endoglicosidasas (p.ej., Endo-A, Endo-M) . Cada una de estas tres clases de enzimas se ha usado con éxito sintéticamente para preparar carbohidratos. Para una revisión general, véase, Crout et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111 (1998) .

Las glicosiltransferasas modifican las estructuras de los oligosacáridos en los glicopéptidos, por lo que producen productos específicos con un buen control estereoquímico y regioquímico. Las glicosiltransferasas se usan para preparar oligosacáridos y para modificar estructuras de carbohidratos con unión en N y O terminales, en particular en glicopéptidos producidos en las células mamíferas. Por ejemplo, los oligosacáridos terminales de los glicopéptidos se han sialilado y/o fucosilado completamente para proporcionar estructuras de carbohidratos más consistentes, lo que mejora la farmacodinámica del glicopéptido y una diversidad de otras propiedades biológicas. Por ejemplo, la º1, 4-galactosiltransferasa se usó para sintetizar lactosamina, un ejemplo de la utilidad de las glicosiltransferasas en la síntesis de carbohidratos (véase, p.ej., Wong et al., J. Org. Chem. 47: 5416-5418 (1982) ) . Además, numerosos procedimientos sintéticos han utilizado a-sialiltransferasas para transferir ácido siálico de ácido citidin-5'-monofosfo-Nacetilneuramínico al 3-OH o 6-OH de galactosa (véase, p.ej., Kevin et al., Chem. Eur. J. 2: 1359-1362 (1996) ) . Las fucosiltransferasas se usan en rutas sintéticas para transferir una unidad de fucosa de guanosin-5'-difosfofucosa a un hidroxilo específico de un sacárido aceptor. Por ejemplo, Ichikawa preparó sialil-Lewis-X mediante un método que implica la fucosilación de lactosamina sialilada con una fucosiltransferasa clonada (Ichikawa et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 9283-9298 (1992) ) . Para una discusión de los avances recientes en la síntesis de glicoconjugados para uso terapéutico véase, Koeller et al., Nature Biotechnology 18: 835-841 (2000) . Véanse además las patentes de EE.UU. nº 5.876.980; 6.030.815; 5.728.554; 5.922.577; y el documento WO/9831826.

Las glicosidasas también se han usado para preparar sacáridos. Las glicosidasas catalizan normalmente la hidrólisis de un enlace glicosídico. En condiciones adecuadas, sin embargo, se pueden usar para formar este enlace. La mayoría de glicosidasas usadas para la síntesis de carbohidratos son exoglicosidasas; la transferencia de glicosilo se da en el extremo no reductor del sustrato. La glicosidasa capta un donante de glicosilo en un intermedio glicosiloenzima que es interceptado por el agua para proporcionar el producto de hidrólisis, o por un aceptor, para proporcionar un nuevo glicósido u oligosacárido. Una ruta ejemplar que usa una exoglicosidasa es las síntesis del trisacárido central de todos los glicopéptidos con unión en N, que incluyen la unión difícil de º-manósido, que se formó mediante la acción de la º-manosidasa (Singh et al., Chem. Commun. 993-994 (1996) ) .

En otra aplicación ejemplar del uso de una glicosidasa para formar una unión glicosídica, se ha preparado una glicosidasa mutante en la que el aminoácido nucleófilo normal del sitio activo se cambia por un aminoácido no nucleófilo. Las enzimas mutantes no hidrolizan las uniones glicosídicas, pero todavía pueden formarlas. Las glicosidasas mutantes se usan para preparar oligosacáridos mediante el uso de un fluoruro de a-glicosilo donante y una molécula aceptora de glicósido (Withers et al., patente de EE.UU. nº 5.716.812) . Aunque las glicosidasas mutantes son útiles para formar... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica una hormona del crecimiento humana mutante, en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nº s: 10, 13, 14 ó 15.

2. Un casete de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una célula que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1.

4. Una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nº s: 10, 13, 14 ó 15.

5. La hormona del crecimiento humana mutante de la reivindicación 4, que comprende un polímero hidrosoluble unido a dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido por medio de un ligador de glicosilo, en el que dicho ligador de glicosilo es un ligador de glicosilo intacto.

6. La hormona del crecimiento humana mutante de la reivindicación 4 ó 5 para el uso como un medicamento.

7. Un método para producir una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nº s: 10, 13, 14 ó 15, que comprende las etapas de:

(a) producir de manera recombinante la hormona del crecimiento humana mutante; y

(b) glicosilar la hormona del crecimiento humana mutante en el sitio de glicosilación recién introducido.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende más de un sitio de glicosilación recién introducido.

9. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una hormona del crecimiento humana mutante según la reivindicación 4 ó 5.

10. El uso de una hormona del crecimiento humana mutante, en el que la hormona del crecimiento humana mutante comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una deficiencia de la hormona del crecimiento humana en un paciente, en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en el que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nº s: 10, 13, 14 ó 15.

11. Un método para producir un glicoconjugado de una hormona del crecimiento humana mutante, que comprende un sitio de glicosilación con unión en O recién introducido que no existe en la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente, en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está en un residuo de treonina, y en la que dicho sitio de glicosilación con unión en O recién introducido está localizado en una región de la hormona del crecimiento mutante que corresponde a SEQ ID Nº s: 10, 13, 14 ó 15, que comprende las etapas de:

(a) producir de manera recombinante la hormona del crecimiento humana mutante, y

(b) glicosilar enzimáticamente la hormona del crecimiento humana mutante con un carbohidrato modificado en el sitio de glicosilación recién introducido.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el carbohidrato modificado se modifica con un miembro seleccionado de poli (etilen glicol) y m-poli (etilen glicol) .

13. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el método de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10, o el método de la

reivindicación 11 ó 12, en los que la hormona del crecimiento humana de tipo natural correspondiente tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 1 o SEQ ID Nº : 2.

14. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el mé

todo de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10 o el método de la 5 reivindicación 11 ó 12, en los que el sitio de glicosilación recién introducido está cerca de un residuo de prolina.

15. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el método de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10 o el método de la reivindicación 11 ó 12, en los que el sitio de glicosilación recién introducido está cerca de un residuo de prolina que está localizado en la posición 2, 5, 133 ó 140 de SEQ ID Nº : 1 o SEQ ID NO:2.

16. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, el método de la reivindicación 7 ó 8, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10, o el método de la reivindicación 11 ó 12, en los que la hormona del crecimiento humana mutante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº : 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9.

17. El ácido nucleico de la reivindicación 1, la hormona del crecimiento mutante de la reivindicación 4 ó 5, la composición de la reivindicación 9, el uso de la reivindicación 10 o el método de la reivindicación 11 ó 12, en los que la hormona del crecimiento humana mutante comprende más de un sitio de glicosilación recién introducido.

18. Un péptido de hGH codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1.

19. La hormona del crecimiento humana mutante de la reivindicación 4 ó 5 para el uso en el tratamiento de una deficiencia de la hormona del crecimiento humana en un paciente.

hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsenso

hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsenso

hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsenso

hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 maduraConsenso hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 madura

hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 madura

hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 madura

hGH 134 con unión en OhHG 5' con unión en OhGH-N1 madura Fig 8