Composición de proteasa estabilizada que comprende una serina proteasa, derivados de morfolino e inhibidores inversos de dicha serina proteasa.

Composicion que comprende a) una serina proteasa; b) un inhibidor reversible de dicha serina proteasa;

y c) un compuesto M que tiene la formula I:

en la que n es 0, 1 o 2; X es O, N o CH2; R1-R4 son iguales o diferentes y se seleccionan entre H, -CH2-R6, -CH2-O-R6, -CH2-S-R6, -CH2-NH-R6, -CO-O-R6, -CO-NH-R6, -CH2-NH-CO-R6, -CH2-O-CO-R6, -CH2-NH-CO-NHR6, -CH2-NH-CO-OR6, -CH2-NH-CS-NHR6 y -CH2-O-CO-NHR6; R5 es como R1-R4 o P-Q; P se selecciona entre - (CH2) m-y - (CH2) m-Y- (CH2) m-, en las que m es 1-6 e Y es O, N H o S; Q se selecciona entre H, -SO3, -COOH, -NH2, -OH y -CONH2; seleccionandose cada R6 individualmente entre H, alquilo inferior sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o anillo o anillos heteroaromaticos mono-, bi- o triciclicos sin sustituir o sustituidos con uno o mas heteroatomos y heterociclos no aromaticos, seleccionandose los sustituyentes de los grupos sustituidos entre alquilo inferior, halogenos, arilo sustituido o sin sustituir, compuestos heteroaromaticos sustituidos o sin sustituir, heterociclos no aromaticos, alquiloxi, alquilamino; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

Composicion de proteasa estabilizada que comprende una serina proteasa, derivados de morfolino e inhibidores inversos de dicha serina proteasa Campo de la invención La presente invencion se refiere a una composicion enzimatica en la que la enzima se estabiliza mediante ciertos aditivos en una combinacion de la invencion. Mas particularmente, la invencion atane a una composicion de serina proteasa que comprende un inhibidor reversible de la serina proteasa y un compuesto estabilizante adicional M como se define mas adelante.

Antecedentes Las serina proteasas son un grupo de enzimas proteoliticas que se caracterizan por tener un residuo de serina y de histidina en su sitio activo. Muchas enzimas bien conocidas pertenecen a este grupo, por ejemplo tripsina, calicreina, trombina y plasmina. Varias de ellas tienen utilidad practica, La tripsina se usa en la industria del cuero. La trombina se usa como agente hemostatico para detener las hemorragias por heridas. La uroquinasa y el activador del plasminogeno tisular, otras dos serina proteasas, se usan clinicamente como agentes tromboliticos en el tratamiento del infarto de miocardio agudo. Algunas de estas enzimas se han usado ampliamente como herramientas de investigacion en, por ejemplo, la determinacion de la estructura proteica. Ademas, las enzimas se usan en varios kit diagnosticos.

Comun a la mayoria de las serina proteasas es su limitada estabilidad en solucion. Esto se debe principalmente a la autodegradacion cuando se queda en solucion, debido a su propiedad como proteasas. Esta limitada estabilidad es 20 un problema cuando el material se tiene que almacenar en solucion. Las preparaciones comerciales de serina proteasa disponibles actualmente estan esencialmente, siempre, en forma de soluciones congeladas o polvos liofilizados, con los inconvenientes obvios. El tiempo adicional necesario para la disolucion del polvo o la descongelacion de la solucion congelada a la temperatura correcta es el aspecto mas importante. No obstante, con estas preparaciones existen otros problemas. Para las soluciones congeladas, existe la necesidad de temperaturas 25 controladas (-20 DC) en todas las etapas desde la fabricacion, el transporte y el almacenamiento hasta el almacenamiento de nuevo en el "kit de emergencia". Para los polvos liofilizados, existe la necesidad de una solucion de reconstitucion con un grado aceptable de pureza y estabilidad. Asimismo, el material con frecuencia tiene que prepararse en condiciones de asepsia (mezclando las dos partes) en un ambiente que puede ser no controlado (tal como clima inclemente o ausencia de un suministro de agua limpia) y existe la necesidad de verificar que los polvos se han mezclado adecuadamente. Estos son inconvenientes importantes de los productos disponibles hoy en dia, anadiendo a su complejidad de uso sus costes.

Para la trombina, que, preferentemente, tiene que estar disponible inmediatamente para usar detener la hemorragia, los problemas de estabilidad han forzado a los fabricantes a usar trombina liofilizada o soluciones en congelacion profunda. Por tanto, requieren cierta cantidad de tiempo para preparar el uso. Los dos agentes tromboliticos uroquinasa y activador del plasminogeno tisular se venden en forma de preparaciones liofilizadas que se tienen que disolver antes de usar. Dado que el tratamiento trombolitico del infarto de miocardio agudo tiene que iniciarse lo antes posible tras el inicio del infarto, cualquier retraso de tiempo causado por dicha preparacion supone un problema.

Se han realizado muchos esfuerzos para encontrara modos de estabilizar las diversas serina proteasas. Para la tripsina, que se degrada bastante rapido, un agente simple y estabilizante eficiente es el ion calcio (Sipos T y Merkel J, Biochemistr y 9:2766 (1970) ) . La disminucion del pH a menos de 4 tambien es un procedimiento que funciona con algunas de las enzimas, como la tripsina y la plasmina, pero no es viable con la trombina, ya que esta se inactiva de forma irreversible a un pH inferior a 5. Se pueden usar inhibidores reversibles de la proteasa, pero son menos frecuentes, ya que interfieren de un modo perjudicial en la accion de la enzima con son usados (vease mas 45 adelante) .

Para la estabilizacion del activador del plasminogeno tisular (tPA) , normalmente se usa la adicion del aminoacido arginina. El material de tPA en uso clinico hoy en dia contiene arginina como estabilizante.

Asimismo, se han dedicado muchos esfuerzos a encontrar modos de estabilizar las soluciones de trombina. Como ejemplos de aditivos estabilizantes se pueden mencionar las propuestas siguientes: acidos carboxilicos a 50 concentraciones altas, EDTA, varios aminoacidos, albumina, polimeros como polietilenglicol, polivinilpirrolidona y alcohol polivinilico, glicerol, varias sales inorganicas, hidratos de carbono, gelatina, colageno.

La solicitud de patente de EE.UU. 2001/0033837 describe una preparacion de trombina que contiene un inhibidor del enlace no covalente como estabilizante. Ademas, el inhibidor se combina con otros aditivos estabilizantes, como azucares o acidos carboxilicos, que previamente se han descrito en patentes u otras publicaciones.

55 El documento JP 2000300250 describe la estabilizacion de las soluciones de trombina mediante la adicion de alcohol polivinilico, gelatina o polivinilpirrolidona en diferentes soluciones tampon.

En el documento GB 1354761, las proteasas y las amilasas se estabilizan en diversos grados mediante una serie de sustancias, tales como alcoholes alifaticos, acidos carboxilicos, compuestos heterociclicos que contienen grupos hidroxilo y aminas alifaticas o aliciclicas.

Por tanto, se ha descrito la estabilizacion de una serina proteasa usando inhibidores (documento US 2001/0033837, ant.) . El problema con este enfoque es que el inhibidor disminuye totalmente el efecto de la enzima, si no se ha eliminado antes de usar la preparacion. Si se usa un inhibidor potente, se pierde la mayoria de la actividad enzimatica. Un enfoque mejor es usar un inhibidor reversible de la fuerza intermedia. No obstante, incluso en este caso, se perdera una parte considerable de la actividad enzimatica inicial, dado que la concentracion del inhibidor aumenta con el fin de obtener un buen efecto de estabilizacion.

La solicitud de patente japonesa JP2004191367 describe un reactivo de ensayo que contiene trombina estabilizada para analizar la capacidad de coagulacion de la sangre. El reactivo de ensayo contiene trombina y un inhibidor de la trombina, y tambien puede comprender uno o mas compuestos estabilizantes de la trombina seleccionados de ion calcio, un acido organico, un tensioactivo y un proteina.

Los documentos WO 02/100830, WO 02/22575, WO 00/20394, WO 99/11658, WO 02/37937 y US 5, 409, 927 describen todos ellos diferentes compuestos inhibidores de la serina proteasa y su uso en composiciones farmaceuticas para el tratamiento de diversas enfermedades, tales como la trombosis, en las que esta indicada la inhibicion de las correspondientes serina proteasas.

Divulgación de la invención Por tanto, es un objeto de la presente invencion conseguir una composicion de serina proteasa que sea estable en solucion y conserve un grado de actividad enzimatica que sea suficiente para el uso practico de la composicion.

Es otro objeto de la presente invencion proporcionar una composicion de serina proteasa que pueda usarse directamente sin etapas de preparacion previas de material en congelacion profunda o liofilizado.

Es otro objeto de la presente invencion permitir un uso practico de inhibidores reversibles de serina proteasas con fines de estabilizacion, mediante la condicion de de un componente estabilizante adicional.

Estos y otros objetos evidentes a partir del presente texto se consiguen mediante los diferentes aspectos de la presente invencion, segun se reivindican.

Por lo tanto, un aspecto de la invencion proporciona una composicion que comprende a) una serina proteasa; b) un inhibidor reversible de dicha serina proteasa; y c) un compuesto M que tiene la formula I:

en la que n es 0, 1 o 2; X es O, N o CH2; R1-R4 son iguales o diferentes y se seleccionan entre H, -CH2-R6, -CH2-O-R6, -CH2-S-R6, -CH2-NH-R6, -CO-O-R6, -CO-NH-R6, -CH2-NH-CO-R6, -CH2-O-CO-R6, -CH2-NH-CO-NHR6, -CH2-NH-CO-OR6, -CH2-NH-CS-NHR6 y -CH2-O-CO-NHR6; R5 es como R1-R4 o P-Q; P se selecciona entre - (CH2) m-y - (CH2) m-Y- (CH2) m-, en las que m es 1-6 e Y es O, NH o S; Q se selecciona entre H, -SO3, -COOH, -NH2, -OH y -CONH2; seleccionandose cada R6 individualmente entre H, alquilo inferior sustituido o sin sustituir, cicloalquilo... [Seguir leyendo]

1. Composicion que comprende a) una serina proteasa; b) un inhibidor reversible de dicha serina proteasa; y c) un compuesto M que tiene la formula I:

en la que n es 0, 1 o 2; X es O, N o CH2; R1-R4 son iguales o diferentes y se seleccionan entre H, -CH2-R6, -CH2-O-R6, -CH2-S-R6, -CH2-NH-R6, -CO-O-R6, -CO-NH-R6, -CH2-NH-CO-R6, -CH2-O-CO-R6, -CH2-NH-CO-NHR6, -CH2-NH-CO-OR6, -CH2-NH-CS-NHR6 y -CH2-O-CO-NHR6; R5 es como R1-R4 o P-Q; P se selecciona entre - (CH2) m-y - (CH2) m-Y- (CH2) m-, en las que m es 1-6 e Y es O, N H o S; Q se selecciona entre H, -SO3, -COOH, -NH2, -OH y -CONH2; seleccionandose cada R6 individualmente entre H, alquilo inferior sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o anillo o anillos heteroaromaticos mono-, bi- o triciclicos sin sustituir o sustituidos con uno o mas heteroatomos y heterociclos no aromaticos, seleccionandose los sustituyentes de los grupos sustituidos entre alquilo inferior, halogenos, arilo sustituido o sin sustituir, compuestos heteroaromaticos sustituidos o sin sustituir, heterociclos no aromaticos, alquiloxi, alquilamino; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

2. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que la serina proteasa se selecciona entre el grupo que consiste en tripsina, kalicreina, trombina, plasmina, uroquinasa, activador de plasminogeno tisular, forma activa del factor IX, forma activa del factor X y forma activa del factorXI.

3. Composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el inhibidor reversible presenta un valor de Ki de entre 0, 01 y 2 mM, por ejemplo entre 0, 04 mM y 0, 5 mM.

4. Composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que en la que la serina proteasa es trombina.

5. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 4, en la que el inhibidor reversible se selecciona entre N- (2'-fenoxi) 4-aminopiridina y derivados de la misma, benzamidina, N, N-dietiletilendiamina, aminobenzamidina, amidinopiridina y terc-butilamidina.

6. Composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la serina proteasa es plasmina.

7. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 6, en la que el inhibidor reversible se selecciona entre N, Ndietiletilendiamina, aminobenzamidina y benzamidina.

8. Composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que la serina proteasa es tripsina.

9. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 8, en la que el inhibidor reversible se selecciona entre aminobenzamidina y benzamidina.

10. Composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el compuesto M es un compuesto de formula II:

en la que R1-R4 son iguales o diferentes y se seleccionan entre H, -CH2-R6; R5 es como R1-R4 o P-Q; P se selecciona entre - (CH2) m-y - (CH2) m-Y- (CH2) m-, en las que m es 1-6 e Y es O, NH o S; Q se selecciona entre H, -SO3, -COOH, -NH2, -OH y -CONH2; seleccionandose cada R6 individualmente entre H, alquilo inferior sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir o anillo o anillos heteroaromaticos mono-, bi- o triciclicos sin sustituir o sustituidos con uno o mas heteroatomos y heterociclos no aromaticos, seleccionandose los sustituyentes de los grupos sustituidos entre alquilo inferior, halogenos, arilo sustituido o sin sustituir, compuestos heteroaromaticos sustituidos o sin sustituir, heterociclos no aromaticos, alquiloxi, alquilamino; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

11. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 10, en la que el compuesto M es un compuesto de formula III:

en la que R5 es -CH2-R6 o P-Q; P se selecciona entre - (CH2) m-o - (CH2) m-Y- (CH2) m-, en las que m es 1-6 e Y es O, NH o S; Q se selecciona entre H, -SO3, -COOH, -NH2, -OH y -CONH2, seleccionandose cada R6 individualmente entre alquilo inferior sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, seleccionandose los sustituyentes de los grupos sustituidos entre alquilo inferior, halogenos, arilo sustituido o sin sustituir, compuestos heteroaromaticos sustituidos o sin sustituir, heterociclos no aromaticos, alquiloxi, alquilamino; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

12. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que el compuesto M se selecciona entre el grupo que consiste en morfolina, acido 3- (N-morfolino) propanosulfonico (MOPS) , acido morfolino butil sulfonico, acido morfolino propil carboxilico, morfolino etil alcohol y acido morfolino etil sulfonico.

13. Composicion de acuerdo con la reivindicacion 12, en la que el compuesto M se selecciona entre morfolina y acido 3- (N-morfolino) propanosulfonico.

14. Composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la serina proteasa es trombina, el inhibidor reversible es N- (2'-fenoxi) -4-aminopiridina y el compuesto M es morfolina.

15. Composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas un polimero viscoso y adhesivo seleccionado de polisacaridos y gelatina.

16. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 15, en la que el polimero viscoso y adhesivo es un polisacarido.

17. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 16, en la que el polisacarido se selecciona de almidon, sus derivados, celulosa, sus derivados, y mezclas de los mismos.

18. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 17, en la que el polisacarido se selecciona de carboximetilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa y mezclas de los mismos.

19. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 15, en la que el polimero viscoso y adhesivo es gelatina.

20. La composicion de acuerdo con la reivindicacion 19, en la que la gelatina es gelatina de peces de agua fria.

21. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que esta en una forma seleccionada a partir de una solucion y un gel, por ejemplo una solucion acuosa o un gel acuoso.

22. El uso de una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes como un medicamento.

23. El uso de una composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que la serina proteasa es trombina, para la preparacion de un medicamento para establecer hemostasia en un sujeto que sufre una hemorragia.

24. El uso de composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en el que la serina proteasa se selecciona de plasmina, uroquinasa o activador del plasminogeno tisular, para la preparacion de un medicamento para tratamiento trombolitico.

25. Procedimiento para la estabilizacion de una serina proteasa, que comprende mezclar la serina proteasa con a) un inhibidor reversible de dicha serina proteasa; y b) un compuesto M de formula I:

en la que n es 0, 1 o 2; X es O, N o CH2; R1-R4 son iguales o diferentes y se seleccionan entre H, -CH2-R6, -CH2-O-R6, -CH2-S-R6, -CH2-NH-R3, -CO-O-R6, -CO-NH-R6, -CH2-NH-CO-R6, -CH2-O-CO-R6, - CH2-NH-CO-NHR6, -CH2-NH-CO-OR6, -CH2-NH-CS-NHR6 y -CH2-O-CO-NHR6; R5 es como R1-R4 o P-Q; P se selecciona entre - (CH2) m-y - (CH2) m-Y- (CH2) m-, en las que m es 1-6 e Y es O, NH o S; Q se selecciona entre H, -SO3, -COOH, -NH2, -OH y -CONH2; seleccionandose cada R6 individualmente entre H, alquilo inferior sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, bencilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, o anillo o anillos heteroaromaticos mono-, bi-o triciclicos, sin sustituir o sustituidos con uno o mas heteroatomos, y heterociclos no aromaticos; seleccionandose los sustituyentes de los grupos sustituidos entre alquilo inferior, halogenos, arilo sustituido o sin sustituir, compuestos heteroaromaticos sustituidos o sin sustituir, heterociclos no aromaticos, alquiloxi, alquilamino; o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.

26. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 25, en el que la serina proteasa es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 6 y 8.

27. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 26, en el que el inhibidor reversible es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 3, 5, 7 y 9.

28. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 27, en el que el compuesto M es como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 10-14.

29. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 28, que comprende ademas mezclar la serina proteasa con un polimero viscoso y adhesivo seleccionado de polisacaridos y gelatina.

30. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 29, en la que el polimero viscoso y adhesivo es como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 16-20.

31. Dispositivo de hemostasia vascular que tiene una composicion adsorbida sobre el de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, composicion en la que la serina proteasa es trombina.

32. Dispositivo de hemostasia vascular de acuerdo con la reivindicacion 31, que comprende un material biodegradable, seleccionado, por ejemplo, entre chitosano y colageno.