Una cepa de Neisseria meningitidis modificada caracterizada porque dicha cepa puede obtenerse empleando los procedimientos siguientes:

d) un procedimiento de destoxificación de la porción de lípido A del LPS dentro de la cepa, que comprende las etapas de identificar un gen msbB implicado en hacer que la porción de lípido A del LPS sea tóxica y modificar por ingeniería genética la cepa para reducir o desactivar la expresión de dicho gen; y h) un procedimiento de modificación de ingeniería genética de la cepa de modo que carezca de polisacárido capsular

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de composiciones de vacuna de bacterias Gram-negativas, a su fabricación y al uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere al campo de nuevas vacunas de vesículas de membrana externa (o 5 ampollas), y a procedimientos ventajosos para hacer que estas vacunas sean más eficaces y más seguras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las bacterias Gram-negativas están separadas del medio externo por dos capas sucesivas de estructuras de membrana. Estas estructuras, denominadas membrana 10 citoplásmica y membrana externa (ME), difieren tanto estructural como funcionalmente. La membrana externa juega un papel importante en la interacción de bacterias patógenas con sus huéspedes respectivos. Por consiguiente, las moléculas bacterianas expuestas en la superficie representan dianas importantes para la respuesta inmune del huésped, haciendo que los componentes de la membrana externa sean candidatos atractivos para proporcionar vacunas, 15 reactivos de diagnóstico y terapéuticos.

Las vacunas bacterianas de células completas (inactivadas o atenuadas) tienen la ventaja de suministrar múltiples antígenos en su microentorno natural. Son inconvenientes asociados con este enfoque los efectos secundarios inducidos por componentes bacterianos tales como fragmentos de endotoxinas y péptidoglicanos. Por otra parte, las vacunas de 20 subunidad acelulares que contienen componentes purificados de la membrana externa pueden suministrar solo una protección limitada y pueden no presentar los antígenos de forma apropiada al sistema inmune del huésped.

Las proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos son los tres constituyentes principales encontrados en la membrana externa de todas las bacterias Gram-negativas. Estas moléculas 25 se distribuyen asimétricamente: fosfolípidos de membrana (principalmente en la capa interna), lipooligosacáridos (exclusivamente en la capa externa) y proteínas (lipoproteínas de la capa interna y externa, proteínas de membrana integrales o politópicas). Para muchos patógenos bacterianos que afectan a la salud humana, se ha demostrado que los lipopolisacáridos y las proteínas de la membrana externa son inmunogénicos y pueden conferir protección contra la 30 enfermedad correspondiente por medio de inmunización.

La ME de las bacterias Gram-negativas es dinámica y, dependiendo de las condiciones ambientales, puede experimentar transformaciones morfológicas drásticas. Entre estas manifestaciones se ha estudiado la formación de vesículas de membrana externa o “ampollas” y se ha documentado en muchas bacterias Gram-negativas (Zhou, L y col. 1998. FEMS 35 Microbiol. Lett. 163: 223-228). Entre estas, una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos que, según se ha notificado, producen ampollas incluyen: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica. Aunque no se 5 entiende completamente el mecanismo bioquímico responsable de la producción de ampollas de ME, estas vesículas de membrana externa se han estudiado exhaustivamente ya que representan una metodología poderosa para aislar preparaciones de proteínas de membrana externa en su conformación nativa. En este contexto, el uso de preparaciones de membrana externa tiene un interés particular para desarrollar vacunas contra Neisseria, Moraxella 10 catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa y Chlamydia. Además, las ampollas de membrana externa combinan múltiples antígenos proteicos y no proteicos que probablemente conferirán una protección prolongada contra variantes intraespecie.

En comparación con los otros tipos de vacunas bacterianas usados más ampliamente (vacunas bacterianas de células completas y vacunas de subunidad purificadas), los inventores 15 mostrarán que las vacunas de ampollas de membrana externa (si están modificadas de ciertas formas) pueden representar el compromiso ideal.

El uso generalizado de vacunas de subunidad bacterianas se ha debido al intenso estudio de proteínas de la superficie bacteriana que se ha descubierto que son útiles en aplicaciones de vacuna [por ejemplo, pertactina de B. pertussis]. Estas proteínas están 20 asociadas ligeramente con la membrana externa de la bacteria y pueden purificarse a partir del sobrenadante de cultivo o extraerse fácilmente de las células bacterianas. Sin embargo, también se ha mostrado que ciertas proteínas de membrana externa estructurales, integrales, también son antígenos protectores. Son ejemplos PorA en el caso de N. meningitidis serogrupo B; D15 en el caso de H. influenzae; PME CD en el caso de M. catarrhalis; y PME F en el caso 25 de P. aeruginosa. Sin embargo, estas proteínas tienen características estructurales bastante específicas, particularmente múltiples láminas β anfipáticas, lo cual complica su uso directo como vacunas de subunidad purificadas (recombinantes).

Además, se ha hecho evidente que se necesitan vacunas de múltiples componentes (en términos de proteínas de la superficie bacteriana y proteínas integrales de membrana) para 30 suministrar un nivel razonable de protección. Por ejemplo, en el caso de vacunas de subunidad de B. pertussis, las vacunas multicomponente son superiores a los productos mono- o bicomponente.

Para incorporar proteínas integrales de la membrana externa en dicho producto de subunidad, en el producto tiene que estar presente el plegamiento conformacional nativo (o 35 casi nativo) de las proteínas para tener un efecto inmunológico útil. El uso de vesículas de membrana externa o ampollas excretadas puede ser una solución elegante al problema de incluir proteínas integrales de la membrana protectoras en una vacuna de subunidad mientras que al mismo tiempo se asegura que se pliegan de manera apropiada.

N. meningitidis serogrupo B (menB) excreta ampollas de membrana externa en 5 suficientes cantidades para permitir su fabricación a escala industrial. Se ha descubierto que dichas vacunas de proteína de membrana externa multicomponente de cepas de menB naturales son eficaces para proteger a los adolescentes de la enfermedad producida por menB y se han registrado en Latinoamérica. Un procedimiento alternativo para preparar vesículas de la membrana externa es a través del procedimiento de extracción con detergente de las células 10 bacterianas (documento EP 11243). Claasen y col describen la producción, caracterización y control de una vacuna de vesículas que contienen proteína de membrana externa de Neisseria meningitidis hexavalente de clase I (Vaccine (1996) 14: 1001-1008).

Son ejemplos de especies bacterianas a partir de las cuales pueden prepararse vacunas de ampollas. 15

Neisseria meningitidis:

Neisseria meningitidis (meningococo) es una bacteria Gram-negativa aislada con frecuencia del tracto respiratorio superior humano. Ocasionalmente produce enfermedades bacterianas invasivas tales como bacteremia y meningitis. La incidencia de la enfermedad meningocócica muestra diferencias geográficas estacionales y anuales (Schwartz, B., Moore, 20 P.S., Broome, C.V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S 18-S24, 1989). La enfermedad en los países templados principalmente se debe a cepas del serogrupo B y varía en incidencia de 1-10/100.000/año en la población total alcanzando algunas veces valores superiores (Kaczmarski, E.B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R.J.P.M., Bijlmer, H.A., Poolman, J.T. y col. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E., y 25 col. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990). Las incidencias específicas de edad en los dos grupos de alto riesgo, niños y adolescentes, alcanzan niveles superiores.

Las epidemias dominadas por los meningococos del serogrupo A se producen principalmente en África central, alcanzando algunas veces niveles de hasta 1000/100.000/año (Schwartz, B., Moore, P.S., Broome, C.V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). 30 Casi todos los casos de enfermedad meningocócica en conjunto se producen por meningococos del serogrupo A, B, C, W-135 e Y. Se dispone de una vacuna tetravalente de polisacáridos capsulares A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M.C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982).

Las vacunas de polisacáridos actualmente se están mejorando por medio de la...

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1. Una cepa de Neisseria meningitidis modificada caracterizada porque dicha cepa puede obtenerse empleando los procedimientos siguientes:

d) un procedimiento de destoxificación de la porción de lípido A del LPS dentro de la 5 cepa, que comprende las etapas de identificar un gen msbB implicado en hacer que la porción de lípido A del LPS sea tóxica y modificar por ingeniería genética la cepa para reducir o desactivar la expresión de dicho gen; y

h) un procedimiento de modificación de ingeniería genética de la cepa de modo que carezca de polisacárido capsular. 10

2. La cepa de Neisseria meningitidis modificada de la reivindicación 1, en la que el gen msbB tiene una secuencia de nucleótidos de SEC ID Nº: 81.

3. La cepa de Neisseria meningitidis modificada de la reivindicación 1 ó 2, en la que el gen 15 msbB está regulado negativamente a través de una mutación puntual o deleción.

4. La cepa de Neisseria meningitidis modificada de la reivindicación 1 ó 2, en la que parte o toda la fase de lectura abierta o el promotor de msbB está delecionada.

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5. La cepa de Neisseria meningitidis modificada de la reivindicaciones 1-4, en la que un gen que codifica la exportación o biosíntesis de polisacárido capsular se inactiva por mutación de la región de control o de la región codificante de dicho gen.

6. La cepa de Neisseria meningitidis modificada de la reivindicaciones 1-4, en la que un 25 gen que codifica la exportación o biosíntesis de polisacárido capsular está regulado negativamente por mutación puntual o deleción.

7. La cepa de Neisseria meningitidis modificada de las reivindicaciones 1-6, en la que en el procedimiento h) uno o más genes están regulados negativamente de la lista que consiste en: 30 galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC y ctrD.

8. La cepa de Neisseria meningitidis modificada de las reivindicaciones 1-7, que es una cepa del serogrupo B.

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9. Una preparación de ampolla no tóxica obtenida por ingeniería genética preparada a partir de la cepa de Neisseria meningitidis modificada de la reivindicaciones 1-8.

10. Una vacuna que comprende la preparación de ampolla obtenida por ingeniería genética de la reivindicación 9 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 5

11. La vacuna de la reivindicación 10, que comprende además uno o más polisacáricos capsulares meningocócicos simples o conjugados seleccionados de los serotipos A, C, Y o W.

12. La vacuna de la reivindicación 10, que comprende además un polisacárido capsular de 10 H. influenzae b y uno o más polisacáridos capsulares pneumocócicos simples o conjugados.

13. La vacuna de las reivindicaciones 10-12, que comprende además un adyuvante.

14. La vacuna de la reivindicación 13, en la que el adyuvante es: una sal de aluminio, gel de 15 hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, una sal de calcio, carbonato cálcico, una sal de hierro, una sal de zinc, una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente, o polifosfacenos, un sistema adyuvante de Th1, monofosforil lípido A (MPL), monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL), una combinación de MPL junto con una sal de aluminio, una combinación de 3D-MPL 20 junto con una sal de aluminio, una combinación de un MPL y un derivado de saponina, una combinación de QS21 y 3D-MPL, una combinación de QS21 y 3D-MPL en la que el QS21 está inactivado con colesterol, QS21 y 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua, una saponina, QS21, una emulsión de aceite en agua y tocoferol, u oligonucleótidos que contienen CpG no metilados. 25

15. Uso de la preparación de ampolla obtenida por ingeniería genética de la reivindicación 9 en la fabricación de un medicamento para inmunizar a un huésped humano contra una enfermedad causada por una infección de Neisseria meningitidis.

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16. Uso de la preparación de ampolla obtenida por ingeniería genética de la reivindicación 9 como adyuvante en una vacuna de combinación que comprende otro antígeno.