COMPOSICION DE REVELADO EN ENSAYOS DE INMUNODETECCION.
Composición de revelado en ensayos de inmunodetección.
La presente invención se refiere a una composición de revelado en ensayos de inmunodetección que comprende un compuesto de fórmula I,
luminol, peróxido de hidrógeno y una solución tampón. Además la presente invención se refiere al uso de dicha composición en ensayos de inmunodetección
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800323.
Solicitante: LLEONART PAJARIN,MATILDE ESTHER
LEAL PARRA,JOSE ANTONIO.
Nacionalidad solicitante: España.
Provincia: BARCELONA.
Inventor/es: LLEONART PAJARIN,MATILDE ESTHER, LEAL PARRA,JOSE ANTONIO.
Fecha de Solicitud: 6 de Febrero de 2008.
Fecha de Publicación: .
Fecha de Concesión: 1 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/28 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › una peroxidasa.
- G01N21/76 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 21/00 Investigación o análisis de los materiales por la utilización de medios ópticos, es decir, utilizando rayos infrarrojos, visibles o ultravioletas (G01N 3/00 - G01N 19/00 tienen prioridad). › Quimicoluminiscencia; Bioluminiscencia.
- G01N33/535 G01N […] › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › con un marcador enzimático.
Clasificación PCT:
- C12Q1/28 C12Q 1/00 […] › una peroxidasa.
- G01N21/76 G01N 21/00 […] › Quimicoluminiscencia; Bioluminiscencia.
- G01N33/535 G01N 33/00 […] › con un marcador enzimático.
Fragmento de la descripción:
Composición de revelado en ensayos de inmunodetección.
Campo de la técnica
La presente invención se refiere a una nueva composición para el revelado de muestras en membranas en ensayos de inmunodetección como el Western Blot.
Además se encuadra dentro del sector de técnica del desarrollo de nuevas metodologías de detección de muestras biológicas.
Estado de la técnica
El Western blot es una técnica de inmunodetección mediante la cual una proteína específica puede ser detectada y visualizada. Esta técnica se basa principalmente en la facultad de reconocimiento de los anticuerpos por los antígenos. En este mismo sentido dicha técnica se basa en que las proteínas a estudiar son separadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y posteriormente se transfieren mediante electrotransferencia a una membrana de nitrocelulosa en papel. Desde este punto, las proteínas son estudiadas utilizando anticuerpos específicos para dicha proteínas. En este mismo sentido se emplea un anticuerpo primario para localizar la proteína de interés. A continuación un segundo anticuerpo, marcado con una enzima, y contra la especie en la que se ha producido el primero, se emplea para localizar donde se formaron los complejos antígeno-anticuerpo. Este anticuerpo secundario se puede marcar de formas muy diversas con el fin de producir una señal detectable. Esta señal habitualmente es debida a un marcado con quimioluminiscencia. El revelado es mediante quimioluminiscencia mediante una reacción química de tal manera que se produce una señal luminosa. Para esta reacción se utiliza la peroxidasa de rábano (HRP) para catlizar la oxidación de luminol en presencia de peróxido de hidrógeno. Inmediantamente después de la oxidación, el luminol se encuentra en un estado excitado del que pasa a la situación basal, reducida, más estable, emitiendo luz. La luz emitida tiene una longitud de onda de 428 nm, con un máximo de emisión entre 15 y 20 minutos después de iniciada la reacción y una emisión que se puede prolongar de 2 a 3 horas.
Para el revelado de estas muestras, se utilizan composiciones de revelado bien conocidas en el estado de la técnica, como es el caso de la composición ECL de Amershan, que principalmente se compone de la mezcla de dos reactivos A y B, en donde A es el sustrato o luminol y el reactivo B que se trata de peróxido de hidrógeno en cantidades y proporciones bien definidas. En este mismo sentido existen otras muchas soluciones de revelado producidas por casas comerciales como Pierce (Supersignal) Perkin Elmer, Millipore... que básicamente se basan en la misma metodología.
Sin embargo todas estas composiciones son bastante caras, no son muy sensibles y ofrecen una resolución moderada. Otro inconveniente de dichas soluciones es que el tiempo de exposición es muy variable dependiendo del anticuerpo en uso y de la cantidad de proteína cargada en el gel de poliacrilamida para efectuar el Western-Blot. Este inconveniente hace que muchos usuarios tengan que exponer su película al azar en tiempos escogidos aleatoriamente que no tienen porque ser los más adecuados para la visualización de la proteína en estudio. Con la composición aquí detallada, nosotros hemos comprobado para un panel de más de 20 anticuerpos testados, los tiempos de exposición son los mismos independientemente del anticuerpo utilizado o del extracto proteico a validar. Por lo tanto se hace necesario el desarrollo de nuevas composiciones de revelado que abaraten costes y sobre todo que tengan una mayor sensibilidad y resolución a la hora de identificar las bandas que puedan aparecer en un estudio llevado a cabo mediante la técnica de Western blot.
Descripción de la invención
La presente invención hace referencia a una nueva composición de revelado en ensayos de inmunodetección como es el caso del Western blot. Dicha nueva composición de revelado tiene la ventaja principal de obtener una mayor sensibilidad y resolución de los resultados mostrados en el momento de identificar las bandas que puedan aparecer en un estudio llevado a cabo mediante la técnica de Western blot, además de ser aproximadamente 100 veces más barato que el coste de las composiciones ya conocidas en el Estado de la Técnica.
Por lo tanto un primer aspecto esencial de la presente invención hace referencia a una composición de revelado en ensayos de inmunodetección que comprende los siguientes componentes:
- Un compuesto de fórmula I:
en donde R7 se sustituye por H, OH, -OCH3 o -OCH2-CH3, y R1 representa un compuesto de fórmula II:
y en donde R2, R3 y R6 independientemente son H, OH, SH, -CH3 o -CH2-CH3 y en donde R4 y R5 independientemente son H, OH, -CH3, -CH2-CH3, OCH3 o OCH2-CH3.
- Luminol.
- Peróxido de hidrógeno.
- Una solución tampón o buffer.
Una realización preferida de la presente invención, es en la que el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: OH o H.
- R5: H, OH o OCH3.
- R6: H o OH.
Otra realización preferida de la presente invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: OH.
- R5: H.
- R6: H.
Otra realización preferida de la presente invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: OH.
- R5: OCH3.
- R6: H.
Otra realización preferida de la presente invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: H.
- R5: H.
- R6: OH.
Otra realización preferida de la presente invención, es aquella en la que el compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II se definen siendo:
- R7: -OH.
- R2 y R3: H.
- R4: H.
- R5: H.
- R6: H.
Según otra realización preferida la composición de revelado en ensayos de inmunodetección comprende los componentes anteriormente descritos en las siguientes proporciones:
- Compuesto de fórmula I está presente en una concentración desde 0,1 a 0,45 mM preferentemente desde 0,2 a 0,255 mM.
- Luminol en una concentración desde 1,25 a 8,75 mM preferentemente desde 1,25 a 4,05 mM.
- Peróxido de hidrógeno al 30% en un rango desde el 0,01 al 1%. preferentemente desde 0,01 a 0,1%.
- Una solución tampón o buffer de Tris (1,5M) en un rango desde 0,05 a 0,8 M. preferiblemente desde 0,05 a 0,2 M.
Según otra realización preferida la composición de revelado en ensayos de inmunodetección comprende los componentes anteriormente descritos en las siguientes proporciones:
- Compuesto de fórmula I está presente en una concentración desde 0,1 a 0,45 mM preferentemente desde 0,2 a 0,255 mM.
- Luminol en una concentración desde 1,25 a 8,75 mM. preferentemente desde 1,25 a 4,05 mM.
- Peróxido de hidrógeno al 30% en un rango desde el 0,01 al 1% preferentemente desde 0,01 a 0,1%.
- Una solución tampón o buffer de EDTA en un rango desde 0,03 a 0,30 M preferentemente 0,03 a 0,09 M.
Un segundo aspecto esencial de la presente invención hace referencia al uso de la composición de revelado en ensayos de inmunodetección, preferentemente en Western blot.
Breve descripción de las figuras
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la presente invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, películas reales de radiografías...
Reivindicaciones:
1. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección caracterizada porque comprende los siguientes elementos:
2. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizada porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es OH o H, R5 es H, OH o OCH3 y R6 es H o OH.
3. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es OH, R5 es H y R6 es H.
4. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es OH, R5 es -OCH3 y R6 es H.
5. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es H, R5 es H y R6 es OH.
6. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 2, caracterizada porque R7 es OH, R2 y R3 son H, R4 es H, R5 es H y R6 es H.
7. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizada porque la solución tampón es Tris.
8. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizada porque la solución tampón es EDTA.
9. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto de fórmula I tiene una concentración de 0,1 a 0,45 mM, preferentemente desde 0,2 a 0,255 mM.
10. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizado porque el luminol tiene una concentración de 1,25 a 8,75 mM, preferiblemente de 1,25 a 4,05 mM.
11. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según la reivindicación 1, caracterizado porque el peróxido de hidrógeno tiene una concentración del 0,01 al 1%, preferiblemente de 0,01 a 0,1%.
12. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 y 7, caracterizada porque la solución tampón tiene una concentración de 0,05 a 0,8 M, preferiblemente de 0,05 a 0,2 M.
13. Composición de revelado en ensayos de inmunodetección según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 y 8, caracterizada porque la solución tampón tiene una concentración de 0,03 a 0,30 M preferiblemente de 0,03 a 0,09 M.
14. Uso de la composición de la reivindicación 1, para ensayos de inmunodetección.
15. Uso de la composición de la reivindicación 1, para ensayos de Western Blot.
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