COMPOSICIÓN PARA LA CREACIÓN, REGENERACIÓN Y REPARACIÓN TISULAR MEDIANTE UN IMPLANTE BIOLÓGICO QUE PORTA CÉLULAS ENRIQUECIDO CON CONCENTRADO DE PLAQUETAS Y COMPLEMENTOS.

Composición para la creación, regeneración y reparación tisular mediante un implante biológico que porta células enriquecido con concentrado de plaquetas y complementos. Objeto de la invención La presente invención se refiere a una composición y procedimiento para la creación, regeneración y reparación tisular mediante un implante biológico que porta células enriquecido con concentrado de plaquetas y complementos, de entre las composiciones usadas para regeneración tisular que se derivan de diferentes cultivos celulares convencionales originados a partir de células tanto heterólogas como autólogas. El medio de cultivo que nutre las diferentes líneas celulares incluye altas dosis de diversos complementos con el fin de aumentar el número de células obtenidas en el periodo más corto posible. Estos complementos son principalmente nucleósidos, hormonas, citosinas, aminoácidos y vitaminas, aunque también se incluyen sales minerales, lípidos y otros. Las plaquetas añadidas al medio de cultivo en el que se añaden estas altas dosis de complementos proporcionan los factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF) requeridos para optimizar el establecimiento, mantenimiento y extensión de la proliferación, de modo que el sobrenadante que resulta de su activación puede usarse tras añadir glucobionato de calcio al mismo. Adicionalmente, estas plaquetas junto con el fibrinógeno contenido en las mismas puede usarse como soporte para células derivadas de cultivos celulares anteriormente establecidos, o como constituyentes para el implante biológico, pegamento biológico y/o material de relleno. En el presente documento de solicitud, la expresión implante biológico se refiere al concentrado de plaquetas coagulado mediante la presencia de: fibrinógeno, fibronectina, calcio del cultivo celular y calcio ionizado de las plaquetas, ATP y ADP como activadores de su actividad, enriquecido con otros diversos complementos biológicos y que sustentarán los cultivos celulares. La expresión pegamento biológico se refiere a los primeros minutos del implante biológico y puede portar o no las líneas celulares establecidas. Una propiedad de este pegamento biológico es que favorece el proceso de cicatrización debido a los factores de crecimiento incluidos en el mismo y que pueden actuar sobre las células de la herida, induciendo la multiplicación, diferenciación o quimiotaxis celular. Las plaquetas son la única fuente de factor de crecimiento presente en este pegamento biológico. Material de relleno se refiere al trombo recién formado en el medio de cultivo que posteriormente se congela y/o liofiliza y/o pulveriza con el fin de rellenar defectos osteoarticulares. Antecedentes de la invención La composición según la invención obtiene su cultivo celular del cultivo celular empleado convencionalmente en procedimientos convencionales para estos tipos de cultivos, complementados mediante altas dosis de complementos con el fin de mejorar el rendimiento de los cultivos celulares y mejorar las propiedades biológicas de este medio de cultivo. Los cultivos celulares proceden de células autólogas o heterólogas. Incluyen condrocitos, fibroblastos, osteoblastos, epitelio pigmentario de la retina, hepatocitos y células de la unidad pilosebácea entre otras, así como células embrionarias. Se usan factores de crecimiento de degranulación plaquetaria, entre los que están: en gránulos densos serotonina, catecolaminas, ATP y ADP, iones calcio y en gránulos alfa albúmina, beta-tromboglobulina, osteonectina, osteocalcina, factor de activación de plaquetas 4, factor de crecimiento endotelial derivado de las plaquetas, factor de crecimiento epidérmico (Hudson-Goodmafl et al, 1990); factor inhibidor de alfa plasmina, fibrinógeno, proacelerina, fibronectina, péptido III de activación del tejido conjuntivo, factor beta de crecimiento transformante, factor de crecimiento de tipo insulina (Martin et al 1992); cininógeno de alta masa molecular, factor de von Willebrand, trombospondina, fosfolípido, inhibidor de C1-esterasa, factor de crecimiento de hepatocitos, factores de crecimiento derivados de las plaquetas (Miyazono y Takaku, 1989, Miyazono y Takaku 1989), (H.L. Wong y S.M. Wahl en Peptide Growth Factors and their Receptors Sporn Roberts Eds., Springer-Verlag. Berlín, p. 5 10, Terkeltraub y M. H. Grinsberg en The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, Clark & Henson Eds., Plenum Press, Nueva York, p. 38.) Los extractos de plaquetas muestran una alta actividad mitógena y tienen un efecto de cicatrización conocido. (D. M. Carter et al., Growth Factors and Other Aspects in Wound Healing, Barbul. Pine, Cadwell Hunt Eds. Alan R. Liss Inc., Nueva York 1998, páginas 303 - 317, patente estadounidense 4.760.131 y solicitudes de patente PCI WO 86/03 122, WO 88/03409 y WO 89/05656. No se añaden proteínas exógenas tales como trombina, ni inhibidores de plasmina tales como alfa 2-antiplasmina o aprotinina; la presencia de protrombina y otros factores de coagulación en el pegamento biológico de la invención 2   puede usarse activando la ruta de coagulación o bien extrínseca o bien intrínseca. La temperatura de funcionamiento preferida es 37ºC. Además de estas proteínas coagulables, tampoco se añade fibrinógeno que como el anterior actúa como material hemostático (véase la patente FR 2 448 900 de Immuno AF fûr Chemisch- Medizinische Produkte). Un antecedente remoto del estado de la técnica sería la patente WO90/07931 de Curatech, Inc., que se refiere a factores de recuperación para folículos pilosos usando factores de crecimiento de plaquetas que inducen angiogénesis de origen sanguíneo y de o bien seres humanos o bien otros mamíferos, incorporando complementos como trombina, adenosina difosfato y colágeno. Descripción de la invención La presente invención se refiere al medio de cultivo obtenido para el establecimiento, mantenimiento, propagación y congelación (con DSMO al 10%) usado en líneas celulares tanto humanas como animales de los ejemplos descritos en esta memoria, caracterizándose este medio de cultivo por tener altas concentraciones de complementos y factores de crecimiento del concentrado de plaquetas de un origen o bien heterólogo o bien autólogo. A. Composición principal y procedimiento de la misma: A.1. De la composición: a) Medio de cultivo celular usado de manera rutinaria en procedimientos convencionales de este tipo de cultivo, complementado con un concentrado de plaquetas al 10% (la variación preferida se estima a entre el 1 y el 30%) estabilizado durante 24 horas en un horno de cultivo. A este medio se le añaden factores de crecimiento tales como: IGF-I, IGF-II, TGF-b, aunque puede añadirse cualquier otro factor de crecimiento que se demuestre que ayuda a la proliferación celular. b) Al cultivo celular se le añaden los siguientes complementos, destinados a mantener las diversas líneas celulares: adenosina trifosfato (entre 1 y 10 mg/l), bicarbonato de sodio (entre 1,2 y 5 g/l), citicolina (histidina-5-colina difosfato (entre 10 y 100 mg/l), etanolamina (entre 10 y 50 mg/l), fosfoetanolamina (entre 5 y 25 µg/l), glucagón (entre 1 y 5 mg/l), 1-glutamina (entre 2 y 10 mM), heparina sódica (entre 10.000 y 50.000 UI/l), hidrocortisona (entre 10 y 100 mg/l), insulina humana recombinante (entre 100 y 1.000 UI/l), levotiroxina (entre 50 y 200 µg/l), ácido linoleico (entre 10 y 50 µg/l), ácido oleico (entre 10 y 50 µg/l), piruvato de sodio (entre 50 y 150 mg/l), seleniato de sodio (entre 10 y 50 mg/l), toxina colérica (entre 0,1 y 1 mg/l), antibióticos (penicilina 100.000 UI/l, estreptomicina 100 µg/l y anfotericina B 2,5 µg/l), colina (entre 1 y 30 mg/l), ácido fólico (entre 1 y 10 mg/l), mio-inositol (entre 1 y 40 mg/l), niacinamida (entre 1 y 10 mg/l), ácido p-aminobenzoico (entre 1 y 10 mg/l), ácido D-pantoténico (entre 1 y 15 mg/l), piridoxina (entre 1 y 10 mg/l), riboflavina (entre 2 y 20 mg/l), tiamina (entre 1 y 5 mg/l), vitamina B12 (entre 1 y 10 µg/l) y aminoácidos {1-histidina (entre 1 y 20 mg/l)}, {1-isoleucina (entre 4 y 50 mg/l)}, {1-metionina (entre 1 y 25 mg/l)}, {1-fenilalanina (entre 2 y 20 mg/l)}, {1-triptófano (entre 1 y 5 mg/l)}, {1-tirosina (entre 2 y 10 mg/l)} y opcionalmente albúmina humana (entre 100 y 1.000 mg/l) y transferrina humana (entre 10 y 50 mg/l). c) Concentrado de plaquetas. A.2. Procedimiento Se evaluó el medio de cultivo según la norma Evaluación biológica de dispositivos médicos, Parte 5: Prueba de citotoxicidad: métodos in vitro (ISO 10993-5: 1992). La prueba se realiza en células 3T3 A31, que es una línea celular del ratón Swiss albino (ATCC CRL 1658). El cultivo celular se realiza en frascos de cultivo en un entorno adecuado para la proliferación celular. Las plaquetas usadas en este procedimiento se obtuvieron de la siguiente manera: A.2.1 Con extracción mediante punción venosa... [Seguir leyendo]

1. Composición para el establecimiento, mantenimiento, propagación y congelación de líneas celulares que comprende: · concentrado de plaquetas entre el 1 y el 30%, · factores de crecimiento tales como IGF-1, IGF-11, TGF-b y, · los siguientes complementos: - adenosina trifosfato entre 1 y 10 mg/l, - bicarbonato de sodio entre 1,2 y 5 g/l, - citicolina entre 10 y 100 mg/l, - etanolamina entre 10 y 50 mg/l, - fosfoetanolamina entre 5 y 25 µg/l, - glucagón entre 1 y 5 mg/l, - 1-glutamina entre 2 y 10 mM, - heparina sódica entre 10.000 y 50.000 UI/l, - hidrocortisona entre 10 y 100 mg/l, - insulina humana recombinante entre 100 y 1.000 UI/l, - levotiroxina entre 50 y 200 µg/l, - ácido linoleico entre 10 y 50 µg/l, - ácido oleico entre 10 y 50 µg/l, - piruvato de sodio entre 50 y 150 mg/l, - seleniato de sodio entre 10 y 50 mg/l, - toxina colérica entre 0,1 y 1 mg/l, - antibióticos, - colina entre 1 y 30 mg/l, - ácido fólico entre 1 y 10 mg/l, - mio-inositol entre 1 y 40 mg/l, - niacinamida entre 1 y 10 mg/l, - ácido p-aminobenzoico entre 1 y 10 mg/l, - ácido D-pantoténico entre 1 y 15 mg/l, - piridoxina entre 1 y 10 mg/l, - riboflavina entre 2 y 20 mg/l, - tiamina entre 1 y 5 mg/l, - vitamina B12 entre 1 y 10 µg/l, y - aminoácidos. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que los antibióticos se seleccionan del grupo que consiste en: - penicilina en una concentración de 100.000 UI/l,   - estreptomicina en una concentración de 100 µg/l, y - anfotericina B en una concentración de 2,5 µg/l. 3. Composición según la reivindicación 1, en la que los aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en: - 1-histidina entre 1 y 20 mg/l, - 1-isoleucina entre 4 y 50 mg/l, - 1-metionina entre 1 y 25 mg/l, - 1-fenilalanina entre 2 y 20 mg/l, - 1-triptófano entre 1 y 5 mg/l y - 1-tirosina entre 2 y 10 mg/l. 4. Composición según la reivindicación 1, que comprende además albúmina humana presente en una concentración de desde 100 hasta 1.000 mg/l y transferrina humana presente en una concentración de desde 10 hasta 50 mg/l. 5. Composición según la reivindicación 1, en la que las líneas celulares son líneas celulares tanto humanas como animales. 6. Composición según la reivindicación 1, en la que las células se seleccionan del grupo que consiste en fibroblastos, hepatocitos, células epiteliales pigmentarias de la retina y células de líneas tumorales. 7. Composición según la reivindicación 1, siendo la composición un medio de cultivo celular especializado adaptado para el cultivo de adipocitos y que comprende además: - biotina en una concentración de desde 1 hasta 10 mg/l, y - dexametasona en una concentración de desde 1 hasta 10 mg/l. 8. Composición según la reivindicación 1, siendo la composición un medio de cultivo celular especializado adaptado para el cultivo de melanocitos y que comprende además: - factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) en una concentración de desde 10 hasta 1.000 µg/l, y - teofilina en una concentración de desde 1 hasta 100 mg/l. 9. Composición según la reivindicación 1, siendo la composición un medio de cultivo celular especializado adaptado para el cultivo de condrocitos y osteoblastos y que comprende además: - ácido 1-ascórbico en una concentración de desde 20 hasta 100 mg/l, - calcitonina recombinante humana en una concentración de desde 100 hasta 10.000 UI/l, - calcitriol en una concentración de desde 0,1 hasta 10 µg/l, - dexametasona en una concentración de desde 1 hasta 10 mg/l y - sales inorgánicas. 10. Composición según la reivindicación 9, en la que las sales inorgánicas se seleccionan del grupo que consiste en fosfato de potasio anhidro monobásico en una concentración de desde 100 hasta 500 mg/l y fosfato de potasio anhidro dibásico en una concentración de desde 1.000 hasta 2.500 mg/l. 11. Composición según la reivindicación 1, siendo la composición un medio de cultivo celular especializado adaptado para el cultivo de células madre y que comprende además: -factor inhibidor de leucemia recombinante humano en una concentración de desde 100 hasta 10.000 UI/l, - nucleósidos, - adenosina trifosfato en una concentración de desde 1 hasta 10 mg/l, 11   - timidina en una concentración de desde 5 hasta 10 mg/l, - guanosina en una concentración de desde 10 hasta 50 mg/l, - uridina en una concentración de desde 10 hasta 50 mg/l, - 2-b-mercaptoetanol en una concentración de desde 10 hasta 100 µg/l, y - forscolina en una concentración de desde 0,1 hasta 10 mg/l. 12. Composición según la reivindicación 1 que comprende además DMSO (dimetilsulfóxido) al 10% con el fin de conservar la viabilidad celular durante el almacenamiento en baja temperatura. 12