Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

Composición que comprende un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y una saponina.

Patente Europea. Resumen:

Una composición que comprende

al menos un agente farmacológicamente activo que tiene un efecto farmacológico detectable sobre una célula o unorganismo, acoplado a un componente específico de célula diana que se une de forma específica a una célula diana,yal menos una saponina, seleccionándose dicha saponina entre el grupo que comprende las saponinas triterpenoidescon estructuras básicas que pertenecen al tipo del 12,13-dehidrooleanano con una función aldehído en posición 23,en la que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana es unatoxina quimérica o un conjugado de toxina, siendo dicha toxina quimérica o conjugado de toxina una proteínarecombinante sencilla,

en la que dicho agente farmacológicamente activo no es una saponina, y no es una proteína de unión a antígenoque comprende una región de unión al antígeno y una región o regiones de un anticuerpo que media o medianprocedimientos inmunológicos dependientes de anticuerpos, tales como citotoxicidad celular dependiente deanticuerpos, activación del complemento, opsonización y fagocitosis, en la que dicho componente específico decélula diana se selecciona entre el grupo que comprende

(a) proteínas, tales como proteínas naturales, proteínasrecombinantes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos proteicos y lipoproteicos, tales como factores decrecimiento como por ejemplo EGF, GM-CSF, VEGF, TGF y quimeras de los mismos, citoquinas como por ejemplointerleucinas, interferones, transferrina, moléculas de adhesión como por ejemplo CD4 y activador de plasminógenode tipo uroquinasa, (b) péptidos, tales como péptidos naturales y péptidos sintéticos, (c) hormonas y lascombinaciones de (a) - (c), y en la que dicha célula diana se selecciona entre el grupo que comprende célulascancerosas, y en la que dicho agente farmacológicamente activo es una citotoxina que se selecciona entre el grupoque comprende (a) proteínas vegetales tóxicas, tales como proteínas inactivadora de ribosomas (RIP), en particularproteínas de tipo I como por ejemplo saporina, diantina, gelonina, PAP y fragmentos enzimáticamente activos de lasmismas y la cadena A de proteínas de tipo II como por ejemplo de ricina, abrina, lecitina de muérdago (viscumina), ymodecina, pero sin excluir otros fragmentos o proteínas de tipo II de longitud completa, (b) proteínas y péptidosfúngicos tóxicos, tales como α-sarcina o mitogilina, (c) toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria o laexotoxina de Pseudomonas, y (d) proteínas animales tóxicas, tales como angiogenina o granzima B, en particular deorigen humano.

Solicitante: CHARITE - UNIVERSITATSMEDIZIN BERLIN.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: SCHUMANNSTRASSE 20/21 10117 BERLIN ALEMANIA.

Inventor/es: FUCHS,HENDRIK, SUTHERLAND,MARK, BACHRAN,CHRISTOPHER, MELZIG,MATTHIAS, HEISLER,IRING, HEBESTREIT,PHILIP.

Fecha de Publicación de la Concesión: 19 de Septiembre de 2012.

Clasificación Internacional de Patentes: A61P35/00 (Agentes antineoplásicos [7]), A61K47/48 (.estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento [5]), A61K36/36.

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Composición que comprende un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y una saponina.
Descripción:

Composición que comprende un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y una saponina La presente invención se refiere a una composición que comprende un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y una saponina de acuerdo con la reivindicación 1, a los usos de dicha composición y a un kit que comprende dicha composición.

El uso de un tratamiento médico que usa un agente farmacológicamente activo, en numerosos ejemplos, depende de la capacidad de suministrar tal agente farmacológicamente activo en su sitio de acción previsto. Sin embargo, con bastante frecuencia, no se pueden conseguir concentraciones suficientemente elevadas del agente farmacológicamente activo en el sitio de acción previsto, en primer lugar debido a que el agente farmacológicamente activo nunca alcanza el sitio o bien a que es metabolizado con demasiada rapidez para que sea capaz de ejercer su acción. En el pasado, una forma de aproximarse a este problema ha sido combinar el agente farmacológicamente activo con un componente diana específico de modo que aumentara la probabilidad de que el agente alcanzarla diana. Esta aproximación se ha adoptado, por ejemplo, en el caso de las inmunotoxinas. En el sentido más amplio, las inmunotoxinas (ITs) son proteínas quiméricas o conjugados acoplados químicamente en los que un resto dirigido a una célula se combina con un agente citotóxico. Este último es una molécula radiactiva pequeña, un compuesto orgánico de bajo peso molecular o el dominio catalítico de una toxina natural. El resto dirigido a la célula es normalmente un fragmento de anticuerpo o un ligando natural para antígenos de superficie endocíticos asociados al cáncer. Los antígenos diana típicos son el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el receptor del protooncogen ErbB2 (también conocido como HER-2 en los seres humanos) , el receptor de interleucina-2 o hidratos de carbono asociados al cáncer (1) .

La primera inmunotoxina (IT) recombinante aprobada por la Agencia de Alimentos y Medicamentos Americana fue Ontak. Esta consiste en interleucina-2 y partes de la toxina de la difteria. Se desarrolló para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T (2, 3) . Además del Ontak se han aprobado otras dos ITs acopladas químicamente, Zevalin (4, 5) y Mylotarg (6) , y se encuentran en investigación varias ITs en fase de ensayos clínicos.

A pesar del éxito clínico de varias ITs desarrolladas recientemente, la captación citosólica eficaz del fármaco continúa siendo el problema principal que requiere la aplicación de grandes dosis totales para conseguir las elevadas concentraciones locales necesarias. Esto a menudo conduce a toxicidad no específica, que a menudo da como resultado en daño endotelial difuso y el síndrome de fuga vascular concomitante (revisado en (7) ) . Una mejora para las ITs recombinantes fue el desarrollo de un adaptador molecular que une el tóxico y el resto dirigido. Debido a la escisión endosómica y citosólica de péptidos, el adaptador media en la captura citosólica de la toxina (8) que conduce a una reducción de los efectos secundarios sobre células no diana in vitro (9) .

En algunas inmunotoxinas la secuencia natural de translocación de membrana de la toxina se usa para mediar la transferencia de membrana endosómica. Mientras esto es posible, por ejemplo, para la toxina de la difteria y la exotoxina de Pseudomonas, otras toxinas como las proteínas inactivadoras de los ribosomas (RIP) de tipo I de plantas, que carecen de una secuencia de translocación, deben entrar en las células usando otros mecanismos que son desconocidos hasta la fecha. En la última década, el uso de dominios de transducción de proteínas (PTD, a los que también se hace referencia como péptidos troyanos o proteínas permeables a células) capaces de transportar moléculas efectoras a las células se ha convertido en un mecanismo con cada vez mayor atractivo para solventar este problema (revisado en (10, 11) ) . Se han identificado diversos péptidos vectores derivados de proteínas virales, bacterianas, de insectos y de mamíferos que poseen propiedades de transducción de membrana y se han realizado ensayos para determinar su capacidad para suministrar compuestos, proteínas y ADN. En todos estos experimentos, sin embargo, la captación mediada por PTD fue inespecífica y por lo tanto independiente del tipo celular y de los receptores celulares de superficie. Para solventar este problema se unió un PTD en las denominadas toxinas inmunoadaptadoras a través de un péptido de escisión endosómica a un resto específico de célula diana. El PTD no se expone hasta la unión de la toxina inmunoadaptadora con el receptor de una diana celular específica, internalización y escisión endosómica (9) . No obstante, la captación citosólica de estas ITs mejoradas es claramente inferior que la de las potentes toxinas naturales.

La absorción insuficiente del fármaco debido a una inadecuada transferencia de membrana desde el lumen de los compartimentos intracelulares hasta el citosol es un problema general de las ITs. Después de unirse a un receptor endocítico y la posterior internalización, la mayoría de las ITs se dirigen a los lisosomas para su degradación o se reciclan de nuevo a la superficie celular (12) . La captación citosólica de compuestos orgánicos pequeños como 5fluorouridina se puede potenciar por acoplamiento del fármaco a través de un enlace de hidrazona escindible por ácidos a un anticuerpo o ligando específico de la célula diana (13) . Después de la internalización, el fármaco se libera en el interior de los endosomas por hidrólisis ácida y se difunde pasivamente al citosol. Esta técnica, sin embargo, permite que el fármaco, una vez liberado, se introduzca en otras células de forma no específica y no es apropiada para grandes fármacos como las toxinas proteicas. Las ITs tales como BL22 u Ontak dependen del dominio de translocación de la toxina natural para una captación eficaz (14) . Esto limita el número de toxinas naturales disponibles para la construcción de ITs. Para mejorar la captación de toxinas que no poseen un dominio de translocación como la cadena A de la toxina de la difteria, la cadena A de la toxina del ricino, la saporina-3 RIP de

tipo 1 o proteínas humanas tóxicas, se sugirió la introducción de péptidos permeables a membranas, denominados dominios de transducción de proteínas (PTD) o péptidos troyanos (8) . Aunque los dominios de transducción de proteínas (PTDs) mostraron ser activos en numerosos estudios que tratan de la importación de proteínas inespecíficas, el intento de potenciar la citotoxicidad de las inmunotoxinas no tuvo éxito (9, 15) . Sin embargo, la inserción de péptidos escindibles flanqueando el PTD ha mostrado que reduce los efectos secundarios en las células no diana (9) . Los esfuerzos para aumentar la especificidad hacia las células diana están acompañados normalmente por una pérdida concomitante en el potencial citotóxico en comparación con la toxina nativa. La eficacia de la toxina natural de la difteria, que dependiendo de la línea celular diana tiene valores de CI50 de 10 a 100 pM (8) , no se ha alcanzado hasta la fecha.

Hebestreit y Melzig (29) mostraron que la saponina agrostenumasaponina 1 potencia la citotoxicidad de la proteína inactivadora de los ribosomas agrostina a pesar de la inhibición concomitante de la unión del resto de agrostina a los hidratos de carbono de la superficie celular usando diversos monosacáridos. Por lo tanto, la agrostenumasaponina 1 es capaz de potenciar el transporte de agrostina a través de la membrana celular (posiblemente mediante la formación de estructuras similares a poros dentro de la bicapa de fosfolípidos) independientemente del reconocimiento y unión de células a través del resto de agrostina dirigido a la célula. Por lo tanto, la dirección hacia células específicas, por ejemplo células cancerosas, no es posible.

Por lo tanto fue un objetivo de la presente invención proporcionar una composición en la que se aumente la función específica de un agente farmacológicamente activo, en particular la citotoxicidad de una toxina quimérica o un conjugado de toxina, sobre células diana. Además fue un objetivo de la presente invención reducir los efectos secundarios asociados al uso de agentes farmacológicamente activos, por ejemplo durante terapia tumoral. Además fue un objetivo de la presente invención proporcionar formas para que la cantidad de los agentes farmacológicamente activos que se usan y administran en una terapia se pueda reducir considerablemente.

Todos estos objetivos se alcanzaron mediante una composición que comprende al menos un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana, y al menos una saponina de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicho agente farmacológicamente activo no es una saponina, y no es una proteína de unión a antígeno que comprende una región de unión a antígeno y una región o regiones de un anticuerpo que media procedimientos inmunológicos dependientes de anticuerpos. En una realización, dicho agente farmacológicamente activo no es un agente que estimula una respuesta inmune. En una realización preferente, dicho agente farmacológicamente activo es capaz de eliminar una disfunción de una célula o eliminar una célula al causar la muerte de la célula diana, prevenir la proliferación de la célula diana o suprimir o reducir la disfunción de la célula diana por interacción con las dianas intracelulares.

Dicho agente farmacológicamente activo es citotóxico o citostático.

Dicho componente específico de célula diana se une de forma específica a la célula diana y se selecciona entre el grupo que comprende

(a) proteínas, tales como proteínas naturales, proteínas recombinantes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos lipoproteicos y proteicos, tales como factores de crecimiento (por ejemplo, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento transformante (TGF) ) y quimeras de los mismos, citoquinas (por ejemplo, interleucinas, interferones) , transferrina, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD4) y activador del plasminógeno de tipo uroquinasa,

(b) péptidos, tales como péptidos naturales y péptidos sintéticos, (c) hormonas y las combinaciones de (a) - (c) .

Dicha célula diana se selecciona entre el grupo que comprende células cancerosas.

En una realización dicho agente farmacológicamente activo se acopla a dicho componente específico de célula diana a través de una unión covalente.

Es preferente que dicho componente específico de célula diana sea un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o un factor de crecimiento, citoquina o transferrina, o una combinación o una derivación de cualquiera de estos.

Es preferente que en dicho componente específico de célula diana se una a un receptor seleccionado entre el grupo que comprende receptores de factores de crecimiento (por ejemplo, HER-1 (receptor del factor de crecimiento epidérmico EGFR) , HER-2 HER-3, HER-4 o receptores del factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos GM-CSFR) , receptores de citoquinas (por ejemplo, IL-2R, y IL-25R) , receptores de transferrina, antígenos de diferenciación (CD) (por ejemplo, CD5, CD6, CD7, CD19, CD22, CD25, CD30, CD33, y CD56) , antígenos de Lewis (por ejemplo, Ley) o producto génico de tumor de Wilms.

Dicho agente farmacológicamente activo es una citotoxina que se selecciona entre el grupo que comprende (a) proteínas de plantas tóxicas, tales como proteínas inactivadoras de los ribosomas (RIP) , en particular proteínas de tipo I (por ejemplo, saporina, diantina, gelonina, y PAP) y fragmentos enzimáticamente activos de los mismos y la cadena A de proteínas de tipo II (por ejemplo, de ricina, abrina, lecitina de muérdago (viscumina) , y modecina, pero sin excluir otros fragmentos o proteínas de tipo II de longitud completa, (b) proteínas y péptidos fúngicos tóxicos, tales como a-sarcina o mitogilina, (c) toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria o exotoxina de Pseudomonas, (d) proteínas animales tóxicas, tales como angiogenina o granzima B, en particular de origen humano.

Dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana es una toxina quimérica o un conjugado de toxina, en el que, preferentemente, dicho agente farmacológicamente activo es una citotoxina peptídica o proteica y dicho componente específico de célula diana es un anticuerpo, factor de crecimiento, citoquina o transferrina o un fragmento, combinación o derivado de los mismos.

Dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana es una proteína recombinante sencilla.

Dicha saponina se selecciona entre el grupo que comprende saponinas triterpenoides con estructuras básicas que pertenecen al tipo del 12, 13-dehidrooleanano con una función aldehído en posición 23, por ejemplo Saponinum album de Gypsophila paniculata.

Preferentemente dicha toxina quimérica o conjugado de toxina se selecciona entre el grupo que comprende Ontak™ (DAB389IL2) , Zevalin (ibritumomab tituxetán) , Mylotarg (gemtuzumab ozogamicina) , Saporina-EGF, Herceptina-DM1 (trastuzumab-DM1) , RFB4-PE38 (BL22) , DAB389EGF, H65-RTA, Anti-CD6-bR, Anti-CD7-dgA, TXU-PAP, Anti-Tac-PE38, RFT5-SMPT-dgA, IgG-RFB4-dgA, Di-dgA-RFB4, IgG-HD37-dgA, Anti-B4-bR, Anti-My9-bR, DT388-GM-CSF, B3-LysPE38, B3-PE38, TP40, 454A12-rRA, Tf-CRM107, N901-bR, SGN-15, SGN-25 y SGN-35, Bexxar (tositumomab) , y Theragyn (pemtumomab) . Las toxinas quiméricas mencionadas anteriormente se describen en las referencias (9, 16-19) o están comercialmente disponibles o patrocinadas por Seragen (Ontak) , IDEC Pharmaceuticals (Zevalin) , Wyeth Laboratories (Mylotarg) , Genentech (Herceptina-DM1) , Instituto Nacional del Cáncer de los Estados Unidos de América (BL22) , Corixa, GlaxoSmith-Kline (Bexxar) , y Antisoma (Theragyn) .

En una realización dicha composición comprende de forma adicional al menos una de las siguientes unidades funcionales: una proteína de transporte capaz de transportar dicho agente farmacológicamente activo al interior de una célula, un enlace de escisión citosólica, preferentemente un péptido de escisión citosólica, y un enlace de escisión endosómica, preferentemente un péptido de escisión endosómica, en la que, preferentemente, dicho agente farmacológicamente activo se acopla a dicho componente específico de célula diana a través de dicha proteína de transporte, y en la que, más preferentemente, dicha proteína de transporte es un dominio transducción de proteínas (PTD) . Tal dominio de transducción de proteínas se ha descrito anteriormente y en las referencias (9-11) . A tal construcción completa, es decir que comprende una proteína farmacológicamente actidebecoplada a un componente específico de célula diana a través de al menos una de las siguientes unidades funcionales: un dominio de transducción de proteínas o un péptido de escisión citosólica o un péptido de escisión endosómica, también se hace referencia en el presente documento como "agente inmunoadaptador", o más específicamente "proteína inmunoadaptadora".

Los objetivos de la presente invención también se alcanzaron mediante la composición de acuerdo con la presente invención para su uso como un medicamento.

Además, los objetivos de la presente invención también se alcanzan mediante el uso de una composición de acuerdo con la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad cancerosa.

Preferentemente dicha saponina se debe administrar separadamente de dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

En una realización dicha saponina se debe administrar a través de una vía diferente a la vía de administración de dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana, en la que, preferentemente, dicha saponina se debe administrar a través de inyección y dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana se debe administrar a través de ingestión o viceversa.

En otra realización, dicha saponina se debe administrar a través de la misma vía que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana, en la que, preferentemente, dicha administración ocurre a través de inyección.

En una realización dicha saponina se debe administrar antes que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana, en la que, preferentemente, dicha saponina se debe administrar de un minuto a una hora, preferentemente de un minuto a 45 minutos, más preferentemente de un minuto a 30 minutos, y lo más preferentemente de 5 minutos a 20 minutos antes de la administración de dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico diana.

En una realización dicha saponina se debe administrar en una cantidad de 100 Ig - 100 mg por kg de peso corporal de dicho animal.

Preferentemente dicho animal es un ser humano.

Además, los objetivos de la presente invención también se alcanzan mediante un kit que comprende, en uno o más envases, dicha composición de acuerdo con la presente invención.

En una realización de dicho kit, dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana, y dicha saponina están en envases separados.

En una realización de dicho kit, dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana está formulado para inyección y dicha saponina también está formulada para inyección.

Preferentemente, dicho agente farmacológicamente activo es capaz de eliminar una disfunción de una célula o de eliminar una célula, en un animal que tiene una enfermedad causada por dicha disfunción, al causar la muerte de la célula diana, prevenir la proliferación de la célula diana o suprimir o reducir la disfunción de la célula diana por interacción de dicho agente farmacológicamente activo con las dianas intracelulares involucradas directa o indirectamente en dicha disfunción, en la que dicha disfunción comprende las que conducen o están asociadas al cáncer.

Preferentemente, dicho agente farmacológicamente activo no es un agente que estimula una respuesta inmune.

En una realización preferente dicha función es una función citotóxica o citostática. Preferentemente, dicha enfermedad se selecciona entre el grupo que comprende enfermedades cancerosas.

En una realización dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana y dicha saponina se envasan juntos, aunque, opcionalmente, en contenedores separados.

También se desvela la composición de acuerdo con la reivindicación 1 para su uso en un procedimiento de tratamiento de un animal, preferentemente un ser humano, que tiene una enfermedad seleccionada entre el grupo que comprende enfermedades cancerosas. La administración puede hacerse por cualquiera vía y orden que se han descrito anteriormente. Preferentemente dicha saponina se debe administrar antes que dicho agente farmacológicamente activo.

Como se usa en el presente documento, el término "agente farmacológicamente activo" se pretende que designe una citotoxina. El agente farmacológicamente activo, como se usa en el presente documento, no es una saponina, ni es una proteína de unión a antígeno que comprende una región de unión a antígeno y una región o regiones de un anticuerpo que median procedimientos inmunológicos dependientes de anticuerpos. En una realización, no es un agente que estimula una respuesta inmune.

El acoplamiento de dicho agente farmacológicamente activo a dicho componente específico de célula diana puede ser a través de una unión covalente entre las dos partes o, en el caso que las dos partes sean proteínas, de una proteína de fusión producida de forma recombinante. En una realización dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana es una toxina quimérica o un conjugado de toxina.

El término "toxina quimérica o conjugado de toxina", como se usa en el presente documento, se pretende que signifique una citotoxina acoplada a un anticuerpo, a un fragmento de anticuerpo o a otro componente, preferentemente a un ligando, más preferentemente a un ligando proteico, tal como factores de crecimiento, citoquinas o transferrina, que reconoce estructuras específicas en una célula diana tales como receptores de factores de crecimiento, receptores de citoquinas, receptores de transferrina, antígenos de diferenciación (CD) , antígenos de Lewis o producto génico de tumor de Wilms. Se debería observar, sin embargo, que el término "toxina quimérica", como se usa en el presente documento, no se limita a la aparición de un anticuerpo o de un fragmento de anticuerpo en el mismo.

El término "proteína de transporte", como se usa en el presente documento, se pretende que designe cualquier proteína o péptido que sea capaz de transportar un agente farmacológicamente activo al interior de una célula. Los ejemplos de los mismos, tales como PTD, se han descrito anteriormente.

El término "toxina inmunoadaptadora", como se usa en el presente documento, se pretende que signifique una toxina quimérica recombinante que contiene, además de dicho agente farmacológicamente activo y dicho componente específico de célula diana, una proteína o péptido que contiene al menos una de las siguientes unidades funcionales: un péptido de escisión citosólica, un péptido de escisión endosómica o una proteína de transporte, tal como PTD.

El término "procedimientos inmunológicos dependientes de anticuerpos", como se usa en el presente documento, se pretende que designe procedimientos dependientes de anticuerpos como la citotoxicidad celular, activación del complemento, opsonización y fagocitosis.

El término "disfunción de una célula", como se usa en el presente documento, se pretende que designe cualquier desviación de la célula de su estado saludable normal. Tal disfunción de una célula puede manifestarse, por ejemplo, mediante pérdida de función, pérdida de diferenciación, aumento o disminución de la renovación metabólica, pérdida de la capacidad de sufrir apoptosis, apoptosis prematura y otros.

Los inventores han mostrado que mediante la combinación de un agente farmacológicamente activo con una saponina es posible potenciar drásticamente la función del agente farmacológicamente activo. De forma más específica, los resultados de los presentes inventores demuestran claramente que son posibles concentraciones no tóxicas de saponinas, por ejemplo saponina gipsófila, para potenciar la citotoxicidad específica de inmunotoxinas, por ejemplo Sap-3 que contiene ITs (Sap-3 = saporina-3 = RIP de tipo I (proteína inactivadora de los ribosomas) ) dependiendo de la línea celular, de 3560 a 385000 veces (véase la Tabla 1) . A la espera de esta conclusión, los presentes inventores cuantificaron la citotoxicidad específica de SE, una proteína de fusión directa de Sap-3 y EGF, y de SA2E, una proteína en la que EGF se une a Sap-3 a través de un adaptador molecular escindible que reduce los efectos secundarios sobre las células no diana in vitro (9) . Se usó Saponinum album de Gypsophila paniculata como ejemplo, que es bisdesmosídica y tiene Gipsogenina como aglicona. En general, las saponinas son compuestos glucosídicos que tienen un componente que no es un azúcar, también denominado "aglicona", y uno o varios restos de azúcar unidos a dicha aglicona. Las saponinas que tienen un resto de azúcar se denominan monodesmosídicas, las saponinas que tienen dos restos de azúcar unidos se denominan bisdesmosídicas, tres restos de azúcar tridesmosídicas, etc. Las saponinas se pueden clasificar de acuerdo con el tipo de aglicona que tienen. Los dos tipos principales de saponinas son las saponinas esteroides y las saponinas triterpenoides. Muchas de las saponinas triterpenoides son del tipo oleanano que es una estructura anular triterpenoide que tiene 30 átomos de carbono.

En los experimentos de los presentes inventores, tanto la Sap-3 sin ligando sobre las células diana como las ITs completas sobre células sin receptores mostraron una disminución drástica de la citotoxicidad revelando que el efecto es específico para receptor y para ligando. La potenciación de la toxicidad inespecífica mediada por Spn es únicamente de 490 a 1450 veces e independiente de la línea celular. La elevada especificidad para una diana de las ITs potenciadas con saponina permite una aplicación de la IT en un amplio intervalo y por lo tanto un ajuste al número de receptores sobre la célula diana. Esto permite una dosis extremadamente pequeña en un intervalo inferior al picomolar para células tumorales que expresan cantidades muy elevadas del receptor diana (en el presente estudio representadas por células HER14) así como una dosis elevada, pero todavía específica para receptor, en células tumorales que presentan únicamente un número escasamente elevado de receptores sobre su superficie celular (representadas por células MCF-7) . El tratamiento de estas últimas solamente tiene éxito con la nueva terapia de combinación mientras que la administración de la IT sola no es suficiente, revelando el elevado potencial de la potenciación mediada por saponina. Incluso a las elevadas concentraciones necesarias para el tratamiento de células MCF-7, las células NIH-3T3 no transfectadas (que representan células no diana "sanas") no se ven afectadas.

A diferencia del intervalo de variación de la IT, que es mayor de tres potencias decimales, la saponina se debería aplicar en un intervalo bastante más reducido de 1 a 3 Ig/ml. Los resultados de los presentes inventores (Figura 5) revelaron que existe una concentración umbral determinada en la que el efecto de la saponina en las ITs cae bruscamente. En cambio, el impacto tóxico inespecífico de la saponina comienza a reducir lentamente de esta manera el riesgo de sobredosificación. Aunque la saponina ejerce un efecto tóxico a dosis elevadas, las saponinas de Quillaja saponaria Molina (árbol americano de la corteza del jabón o Quillay) se administran oralmente en forma de complejos de estimulación inmune (ISCOMs) como coadyuvantes para la vacunación (revisado en (20) ) . Además, las saponinas de Quillaja son un aditivo alimentario permitido y la alimentación a largo plazo de ratas (0, 75 % de la dieta total) no mostró ningún efecto sobre el consumo de alimento o el peso corporal (21) . La saponina de Ryokucha, uno de los ingredientes del té verde (Camellia sinensis) , no tuvo ningún efecto sobre ratas alimentadas durante 30 días con 50 mg por kg por día (22) . Estas saponinas muestran incluso un efecto antialérgico sobre ratas y cobayas (23) . Además, las saponinas no solo se han ensayado por vía oral sino también por vía intravenosa. Las administraciones intravenosas consecutivas de saponinas del ginseng, de hasta 500 Ig por ratón por día, revelaron un efecto inhibitorio sobre la angiogénesis y metástasis tumoral pero no provocaron efectos secundarios graves (24, 25) . Para la potenciación de la IT es suficiente una dosis de aproximadamente 30 Ig en un ratón de 20 g (peso por peso) que corresponde a una concentración óptima de saponina (1, 5 Ig/ml) y está muy por debajo de la dosis de 500 Ig administrada por Sato et al. (25) .

La presente invención demuestra que, sorprendentemente, la administración combinada de concentraciones individualmente no tóxicas de una IT y una saponina conduce a un efecto altamente citotóxico específico para las células tumorales diana y por primera vez mayor que la citotoxicidad de la toxina natural de la difteria para sus células diana. El efecto es más aditivo de lo que se esperaba. Cuando las saponinas se combinan con toxinas inmunoadaptadoras, en lugar de las ITs convencionales, es probable una reducción adicional de los efectos secundarios in vivo debido a la retirada intracelular del ligando y del PTD de la toxina. Después de la muerte celular se reduciría drásticamente el potencial de que la toxina liberada penetre en células no diana debido a que la toxina no porta ningún ligando y a que el efecto potenciador de las saponinas está limitado en el tiempo (Figura 3) . Además, la dosis eficaz extremadamente reducida puede prevenir el síndrome de fuga vascular, un efecto secundario dependiente de la dosis de la terapia de inmunotoxinas caracterizado por un aumento en la permeabilidad vascular que resulta en edema intersticial y fallo orgánico (7) . También se pueden evitar otros efectos secundarios graves que resultan de las altas concentraciones sistémicas y del uso a largo plazo como la respuesta inmune grave.

La baja dosis necesaria, la amplia ventana terapéutica de concentración, la elevada citotoxicidad y la elevada especificidad que propone la terapia de combinación presentada en el presente documento ofrece una nueva y prometedora herramienta para la terapia tumoral.

La presente invención se describirá adicionalmente a continuación por referencia a los siguientes ejemplos. Además, se hace referencia a las figuras en la que las figuras muestran:

Figura 1. Estructura de la saponina triterpenoide bisdesmosídica gipsosida (Spn) , componente principal de Saponinum album. En general, las saponinas son compuestos glucosídicos que tienen un componente que no es un azúcar, también denominado "aglicona", y uno o varios restos de azúcar unidos a dicha aglicona. Las saponinas que tienen un resto de azúcar se denominan monodesmosídicas, las saponinas que tienen dos restos de azúcar unidos se denominan bisdesmosídicas, tres restos de azúcar tridesmosídicas, etc. Las saponinas se pueden clasificar de acuerdo con el tipo de aglicona que tienen. Los dos tipos principales de saponinas son las saponinas esteroides y las saponinas triterpenoides. Muchas de las saponinas triterpenoides son del tipo oleanano que es una estructura anular triterpenoide que tiene 30 átomos de carbono.

Figura 2. Citotoxicidad de la Spn sola y su efecto sobre la toxicidad de la toxina inmunoadaptadora SA2E. A:

se incubaron células HER14 durante 48 h en presencia de concentraciones variables de Spn. A continuación, se cuantificaron las células vivas por su capacidad de escindir diacetato de fluoresceína. Se calculó la supervivencia relativa como el número de células vivas después del tratamiento con respecto a las células no tratadas. Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM) de 4 experimentos. B: se incubaron células HER14 a concentraciones variables de la toxina inmunoadaptadora SA2E que consiste en Sap-3, un adaptador molecular que contiene un PTD y EGF como ligando. La incubación se realizó en ausencia de Spn (círculos blancos) y en presencia de 1, 5 Ig/ml (círculos negros) y 5 Ig/ml (triángulos negros) . La supervivencia relativa se calculó como se ha descrito en A. Barras de error: SEM de 7 experimentos.

Figura 3. Efecto del orden, de la eliminación por lavado y de los períodos de preincubación sobre la citotoxicidad. Se preincubaron células HER14 con concentraciones variables de la toxina inmunoadaptadora SA2E (los dos pares de columnas a la izquierda) o con 1, 5 Ig/ml de Spn (los dos pares de columnas a la derecha) durante 5 o 60 min. Después de la preincubación se añadieron 1, 5 Ig/ml de Spn (los dos pares de columnas a la izquierda) o concentraciones diferentes de SA2E (los dos pares de columnas a la derecha) después de la eliminación por lavado del compuesto preincubado (columnas claras) o añadido directamente (columnas oscuras) , se incubaron durante 48 h y se determinó el CI50 para cada tiempo de preincubación. Las columnas centrales (0 min) muestran la administración concomitante de Spn y SA2E (columna oscura) y la incubación de SA2E sola (columna clara) . La altura de la columna representa el valor de CI50 con respecto a la muestra con 5 min de pretratamiento de Spn y las barras de error el SEM de 4 experimentos (8 experimentos para el pretratamiento de 5 min de Spn) . Obsérvese que la escala es logarítmica. Figura 4. Citotoxicidad independiente de ligando en presencia y en ausencia de Spn. A: se trataron células HER14 con concentraciones variables de Sap-3 sin ligando en ausencia (cuadrados blancos) y en presencia de 1, 5 Ig/ml de Spn (cuadrados negros) . Se representa la supervivencia relativa después de 48 h con un SEM de 10 experimentos. B: Para visualizar la potenciación citotóxica se representa el cociente de la supervivencia relativa en ausencia y en presencia de Spn para la toxina inmunoadaptadora SA2E (círculos negros) y para Sap-3 sin ligando (cuadrados negros) .

Figura 5. Efecto de diferentes concentraciones de Spn sobre inmunotoxinas que contienen adaptador y sin adaptador. A: se incubaron células HER14 durante 48 h con SA2E a cuatro concentraciones diferentes junto con concentraciones variables de Spn y se determinó la supervivencia relativa. B: Se aplicó la inmunotoxina SE sin adaptador (Sap-3 unida directamente a EGF) en lugar de SA2E. En ambos paneles se añadió a efectos de comparación la curva para el efecto inespecífico de la Spn sola, que ya se representó en la Figura 2A. Todas las barras de error representan el SEM de 4 experimentos (7 experimentos para la Spn sola) . Figura 6. Citotoxicidad dependiente de receptor en presencia y en ausencia de Spn. Se representa la supervivencia relativa de células MCF-7, que expresan aproximadamente 40 veces menos de EGFR sobre su superficie celular en comparación con las células HER14, después de la incubación durante 48 h con concentraciones variables de SA2E (círculos) o Sap-3 sin ligando (cuadrados) en ausencia (A, símbolos blancos) y en presencia (B, símbolos negros) de 1, 5 Ig/ml de Spn. Barras de error: SEM de 4 a 6 experimentos. C: Cociente de la supervivencia relativa en ausencia y en presencia de Spn para SA2E (círculos) y Sap-3 (cuadrados) . Figura 7. Citotoxicidad independiente de receptor en presencia y en ausencia de Spn. A: Supervivencia relativa de células NIH-3T3, que no expresan EGFR humano, después de una incubación durante 48 h con concentraciones variables de SA2E (círculos) , SE (rombos) o Sap-3 sin ligando (cuadrados) en ausencia de Spn. B: Igual que en A pero en presencia de 1, 5 Ig/ml de Spn. Barras de error en ambos paneles: SEM de 4 experimentos.

Ejemplo 1

Abreviaturas: EGF, factor de crecimiento epidérmico; EGFR, receptor del EGF; IT, inmunotoxina; PBS, tampón fosfato salino; PTD, dominio de transducción de proteínas; RIP, proteína inactivadora de los ribosomas; Sap-3, saporina-3 marcada con His; Spn, Saponinum album de Gypsophila paniculata L; SE, proteína de fusión directa de Sap-3 y EGF; SA2E, Sap-3 unida a EGF a través de un adaptador molecular escindible.

Construcción del plásmido y expresión de la toxina inmunoadaptadora Todos los cebadores y los oligonucleótidos se adquirieron de Metabion (Martinsried, Alemania) . Se construyó el ADN de la IT en pLitmus28 (NEB, Frankfurt, Alemania) y se transcribió a partir de un vector de expresión pET11d (Novabio-chem, Schwalbach, Alemania) como se ha descrito en detalle previamente (9) . La toxina inmunoadaptadora usada en este estudio (SA2E, idéntica a SapAd*EGF en (9) ) consiste en una saporina-3 marcada 6 x con His N-terminal (este cDNA se proporcionó generosamente por Serena Fabbrini, San Raffaele Scientific Institute, Milán, Italia) , el adaptador y EGF. El adaptador se compone de un péptido de escisión citosólica (YVHDEVDRGP) que contiene sitios escindibles por caspasa y una secuencia de reconocimiento de levadura para la escisión citosólica, un PTD (PLSSIFSRIGDP) derivado del dominio PreS2 del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (26) y un péptido de escisión endosómica (RHRQPRGNRVGRS) que contiene la exotoxina de Pseudomonas y un sitio de escisión de la toxina de la difteria modificada. Como control para la especificidad mediada por ligando se usó saporina-3 marcada con His (Sap-3) sin adaptador y sin ligando.

Para la expresión, el plásmido de ADN se transformó en la cepa de Escherichia coli Rosetta DE3 pLysS (Novagen, Schwalbach, Alemania) . Las células transformadas se hicieron crecer durante una noche en medio LB suplementado con 50 Ig/ml de ampicilina y glucosa al 0, 5 %. El cultivo incubado durante una noche se usó para inocular 1 litro de medio LB que contiene 50 Ig/ml de ampicilina y crecer a A600 = 0, 5-0, 6. Se añadió º-D-tiogalactopiranósido de isopropilo a una concentración final de 1 mM y el cultivo se incubó de forma adicional durante 3 h. Las células se cosecharon por centrifugación (10 min, 4 °C, 3400 g) y los sedimentos del cultivo se almacenaron a -20 °C o bien se procesaron inmediatamente.

Purificación de la toxina inmunoadaptadora y ensayo de la actividad enzimática Los sedimentos se lisaron en condiciones de desnaturalización y se purificaron tanto la Sap-3 como la SA2E por cromatografía en agarosa con níquel-ácido nitrilotriacético de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Qiagen, Hilden, Alemania) . Brevemente, las células se sonicaron sobre hielo tres veces durante 30 s (Branson sonoplus, microtip SH213G, ciclo trabajo al 20 %) con rupturas de 1 min y se centrifugaron a 48000 g durante 30 min a 4 °C. El sobrenadante se sometió a cromatografía de afinidad en una columna de 4 ml de níquel-ácido nitrilotriacético preequilibrada. Las toxinas se eluyeron usando urea 8 M (pH 4, 5) y las fracciones correspondientes se dializaron frente a Tris-HCl 50 mM / NaCl 100 mM (pH 7, 5) . Se estimó que los materiales finales tenían una pureza de un 95 % como se evaluó mediante tinción de Coomassie y plata después de SDS-PAGE.

La actividad enzimática de la saporina-3 en todos los constructos se cuantificó usando un ensayo colorimétrico como se ha descrito (27) . Todas las toxinas usadas en el presente estudio exhibieron in vitro una actividad de Nglicosidasa idéntica sobre sustratos de ácidos nucleicos. La concentración de proteína purificada se estimó usando el kit de ensayo Advanced Protein Assay Kit (Cytoskeleton Inc.) . La cantidad de toxinas de longitud completa se corrigió después de los análisis mediante SDS-PAGE [12 % (p/v) gel] en condiciones reductoras y barrido densitométrico usando estándares de proteínas.

Experimentos de cultivos celulares Los experimentos de cultivos celulares se realizaron con células embrionarias NIH-3T3 de ratón Swiss no transfectadas (obtenidas de la DSMZ, la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares) como control, células NIH-3T3 transfectadas con receptor del EGF humano (EGFR) a las que se hace referencia como células HER14 (un gentil regalo del Prof. E. J. van Zoelen, Departmento de Biología Celular, University of Nijmegen, Países Bajos) , y la línea celular MCF-7 de adenocarcinoma de mama humano (obtenido en ATCC, Rockville, MD) . Mientras que las células HER14 expresan aproximadamente 4 x 105 de moléculas de EGFR por célula, las células MCF-7 poseen un número menor de aproximadamente 1 x 104 de EGFR por célula. Las células se mantuvieron en MEM de Dulbecco con Glutamax™ 1 (Invitrogen /Gibco, Karlsruhe, Alemania) suplementado con FCS al 10 % (BioChrom KG, Berlin, Alemania) , 100 U/ml de penicilina y 100 Ig/ml de estreptomicina. Las células se cultivan a 37 °C, CO2 al 5 % y humedad del 95 %.

Para la determinación de las curvas de respuesta a dosis, las células se tripsinaron, se lavaron 3 x con PBS, se sembraron en placas de 96 pocillos (pretratadas con gelatina al 0, 1 % en PBS) a una concentración de 5000 células por pocillo y se dejaron sin tratamiento durante 16 h. Las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con 180 Il de medio que contenía 1, 5 Ig/ml de Saponinum album de Gypsophila paniculata L. (Spn) excepto cuando se varió como se indica en las figuras. La Spn se adquirió de Merck AG, Alemania. Después de 5 min se añadieron 20 Il de toxina (Sap-3 o SA2E) a concentraciones finales definidas generalmente en el intervalo de 0, 0001 a 30 nM y las células se cultivaron durante 48 h. Para determinar el efecto de citotoxicidad sinérgica con dependencia del tiempo y del orden de aplicación, se preincubó Spn durante 5 min o 1 h y a continuación se eliminó por lavado mediante lavados en tándem con PBS o bien se dejaron sobre las células junto con las toxinas. De forma análoga las toxinas se preincubaron durante 5 min o 1 h y a continuación se eliminaron por lavado o bien se incubaron junto con la Spn (añadida de una solución de reserva de 3 mg/ml) . Cuando se aplicaron al mismo tiempo, Sap-3 y Spn se premezclaron y se añadieron a 180 Il de medio.

Ensayo de citotoxicidad

El ensayo de citotoxicidad se basa en la escisión de diacetato de fluoresceína por parte de células vivas y se realizó como se describe en Nygren et al. (28) . Después de la incubación de las células con las toxinas, se lavaron dos veces con PBS y se incubaron con diacetato de fluoresceína (10 Ig/ml; Sigma, Alemania) durante 1 h. Se midió la florescencia usando un lector de microplacas (Spectra Max Gemini, Molecular Devices) con una A de excitación y de emisión de 485 nm y 538 nm respectivamente. El índice de supervivencia se calculó después de la sustracción del blanco (pocillos sin células) como el porcentaje de células vivas en los pocillos tratados con respecto a las células no tratadas (células sin toxina) .

Ejemplo 2

Optimización de concentración y puntos de tiempo para la administración de Spn La purificación, ensayo de actividad enzimática y determinación de curvas de respuesta a dosis está bien establecida para las toxinas inmunoadaptadoras (9, 27) . Para todos los experimentos sólo se usaron aquellas toxinas que exhibieron al menos un 95 % de pureza (como se evalúa mediante tinción de Coomassie y plata) y una liberación de adenina de ADN de esperma de arenque en el intervalo de 600-700 pmol de adenina por pmol de toxina por hora (como se determina mediante un ensayo de cuantificación colorimétrica de adenina (27) ) . Se ensayó primero la citotoxicidad de la Spn (Figura 1) sola o bien en dos concentraciones seleccionadas en presencia de la toxina inmunoadaptadora SA2E sobre células HER14 que expresan el receptor diana. La Spn no tiene o, si así fuera, tiene un efecto estimulante mínimo sobre las células HER14 hasta 3 Ig/ml (Figura 2A) . A 5 Ig/ml y concentraciones superiores se produce un efecto citotóxico considerable (CI50 = 10, 3 Ig/ml, extrapolado) . Al aplicar una concentración no tóxica (1, 5 Ig) y tóxica (5 Ig) de Spn en un estudio de respuesta a dosis de SA2E (Figura 2B) se muestra claramente que la Spn en la concentración no tóxica potencia la citotoxicidad de SA2E aproximadamente 3560 veces (de un CI50 de 2, 4 nM a 0, 67 pM) . Por el contrario, el efecto de un aumento adicional en la concentración de Spn hasta el nivel tóxico de 5 Ig/ml sólo incrementa la citotoxicidad hasta un valor de CI50 de 0, 44 pM indicando que el efecto sinérgico extremo está mediado por concentraciones no tóxicas de Spn mientras que el efecto adicional de concentraciones tóxicas de Spn es únicamente aditivo. También se observa la misma potenciación relativa del efecto tóxico mediado por Spn a 5 Ig/ml comparado con 1, 5 Ig/ml (a mayores concentraciones absolutas) cuando se aplica Sap-3 sin ligando, indicando que este efecto es independiente del ligando y por lo tanto no deseable. Por lo tanto, los presentes inventores usaron 1, 5 Ig/ml de Spn como estándar para todas sus investigaciones posteriores. No obstante, los presentes inventores también realizaron más experimentos con 5 Ig/ml de Spn y el efecto, sin embargo, no difiere del efecto mostrado en la Figura 2B y por lo tanto no se muestra para datos sucesivos (excepto para variaciones de Spn explícitas) .

Ya que el mecanismo de sinergia es desconocido, no está claro si es ventajosa una premezcla paralela o una administración posterior y, si lo último fuera cierto, qué compuesto se debería aplicar primero y durante qué periodo de tiempo. Los presentes inventores realizaron todos los experimentos correspondientes en las dos modalidades, concretamente con eliminación por lavado del primer componente antes de añadir el segundo y por simple adición del segundo componente, dando como resultado una incubación de 48 h de SA2E y Spn. La Figura 3 muestra que una eliminación por lavado de cualquiera de los dos componentes no condujo a ninguna potenciación de la citotoxicidad comparando con el tratamiento de SA2E sola (0 min, columna clara) , excepto cuando las células se pretrataron con Spn durante 5 min. La falta de sinergia después de la eliminación por lavado indica que la acción de la Spn sobre las células es reversible (como se muestra mediante la preincubación de Spn) y que la Spn debe estar presente antes de la unión de SA2E a su receptor (como se muestra mediante la preincubación de SA2E) . Al comparar sin la eliminación por lavado, la preincubación durante 5 min con SA2E resulta en una potenciación de la sinergia, que se reduce al nivel de la obtenida sin preincubación (0 min, columna oscura) después de un periodo más prolongado de preincubación. Esto se puede atribuir a la internalización de SA2E unida impidiendo la colocalización de Spn. El pretratamiento de las células con Spn condujo a una mayor citotoxicidad que en los experimentos correspondientes con pretratamiento de SA2E. De modo similar a la preincubación de SA2E, la preincubación de 60 min con Spn resultó en un descenso del efecto sinérgico comparado con la preincubación de 5 min aunque, sin embargo, esta citotoxicidad es todavía mayor que la que se obtiene sin preincubación. Esto implica que la interacción de la Spn con la membrana celular prepara a la célula para una mejora de la captación. El descenso con tiempos incubación más prolongados es posible debido a la degradación metabólica o a la oxidación de las saponinas. Sorprendentemente, un tratamiento simultáneo de Spn y SA2E causa una citotoxicidad considerablemente menor que con un pretratamiento corto de cualquiera de los dos compuestos. Sin el deseo de quedar unido a teoría alguna, esto sugiere que Spn y SA2E interactúan directamente de forma que se evitan mutuamente para cumplir con su tarea. El máximo de toxicidad sinérgica se alcanza cuando se preincuba la Spn durante 5 min y se añade SA2E sin eliminación por lavado de Spn, y por lo tanto estas condiciones se aplicaron para todos los experimentos posteriores.

Efecto de la Spn sobre la especificidad dependiente de ligando Para investigar cómo afecta la Spn a la especificidad de las ITs se realizaron dos series de experimentos. Primero, se midió el efecto sobre la citotoxicidad de SA2E y de Sap-3 sin ligando para determinar la función del ligando; segundo, se ensayó SA2E sobre diferentes líneas celulares que varían en la expresión de EGFR en la superficie

celular (véase posteriormente) para definir la función del receptor. La Sap-3 sin ligando en ausencia de Spn no reveló citotoxicidad hasta 30 nM (Figura 4A) y un valor de CI50 de 175 nM (no se muestra CI50) . Por el contrario, en presencia de la concentración no tóxica de Spn (1, 5 Ig) , Sap-3 exhibió un efecto citotóxico 790 veces superior con un valor de CI50 de 0, 22 nM (Figura 4A) . La citotoxicidad observada es 10 veces mayor que la de SA2E en ausencia de Spn (2, 4 nM) aunque, sin embargo, 330 veces menor que la de SA2E en presencia de Spn (0, 67 pM) . Por lo tanto el efecto potenciador de Spn sobre la toxicidad inespecífica de la Sap-3 sin ligando es 5 veces menor que el efecto potenciador de la SA2E específica de célula diana (comparando 790 veces para Sap-3 con 3560 veces para SA2E, véase la Tabla 1) . Esto significa que la aplicación combinada de Spn con SA2E amplía la ventana terapéutica de concentración de SA2E y simultáneamente disminuye drásticamente la concentración requerida para un tratamiento eficaz de célula diana.

Para cuantificar y visualizar mejor estos efectos los presentes inventores calcularon el cociente de las citotoxicidades relativas determinadas en presencia y en ausencia de Spn. Mientras que un cociente cercano a uno a concentraciones bajas de SA2E significa que no se puede observar una actividad tóxica en ambas condiciones (con y sin Spn) , la disminución del cociente a concentraciones elevadas se atribuye al incremento de citotoxicidad de SA2E en ausencia de Spn. En el pico de concentración el efecto potenciador de Spn alcanza su máximo. La Figura 4B revela que la Spn muestra efectos claros sobre la toxicidad de SA2E a concentraciones de IT mayores de 0, 3 pM con un máximo a 100 pM. En cambio, sólo se observa un impacto sobre la toxicidad de la Sap-3 a concentraciones mayores de 100 pM. Por lo tanto existe una ventana terapéutica muy amplia que varía de 1 a 100 pM de IT.

Para asegurar que el efecto observado de la Spn es realmente dependiente de ligando y que no depende del adaptador molecular, los presentes inventores también ensayaron una IT sin ligando en la que el EGF se acopla directamente a Sap-3 (SE) . La comparación de la citotoxicidad a diferentes concentraciones de Spn para 4 concentraciones de IT dentro de la ventana terapéutica revela que no se puede observar ninguna diferencia significativa para SA2E y para SE sin adaptador (Figuras 5A y 5B respectivamente) . Los experimentos presentados en este punto corroboran nuestros resultados anteriores que mostraban que las ITs exhiben una citotoxicidad similar y que la reducción de los efectos secundarios de las toxinas inmunoadaptadoras sobre las células no diana se atribuye a su deseada escisión intracelular en el interior de las células diana y reducida vida media (9) . Los presentes inventores también realizaron todas las demás investigaciones del presente estudio con SE, además de con SA2E. Los resultados fueron casi idénticos y por lo tanto sólo se han añadido de forma ejemplar en la Figura 7. Independientemente de la concentración de IT todas las curvas de la Figura 5 exhiben casi el mismo curso indicando que todas las concentraciones descansan dentro de la ventana terapéutica. Esta amplia ventana se puede usar ventajosamente para ajustar la concentración de IT a los requisitos de la célula diana (véase posteriormente) .

Efecto de la Spn sobre la especificidad dependiente de receptor

Para investigar la especificidad dependiente de receptor, los presentes inventores analizaron el efecto mediado por Spn sobre la citotoxicidad de SA2E y Sap-3 adicionalmente en células MCF-7 y en células NIH-3T3 no transfectadas. La línea celular MCF-7 de adenocarcinoma de mama humano expresa aproximadamente 40 veces menos moléculas de EGFR que HER14 (1 x 104 receptores por célula comparado con 4 x 105) . A diferencia de la toxicidad sobre las células HER14, SA2E sólo exhibe un ligero efecto citotóxico sobre las células MCF-7 no alcanzando el valor de CI50 de 300 nM (Figura 6A) . Esto se corresponde con los resultados anteriores y probablemente es debido al menor número de receptores. En presencia de Spn, sin embargo, se observa un claro efecto citotóxico con un valor de CI50 de aproximadamente 2, 7 pM, una concentración 4 veces mayor que para las células HER14 (0, 67 pM, Figura 2B) y por lo tanto reflejando el reducido número de receptores sobre las células MCF-7. Aunque la Sap-3 no posee ligando y por lo tanto su citotoxicidad es independiente del nivel de receptores sobre la superficie de la célula, tiene un efecto ligeramente inferior sobre las células MCF-7 (0, 63 nM comparado con 0, 22 nM sobre HER14) . Ya que las células HER14 y MCF-7 son líneas celulares completamente diferentes provinientes de ratón y ser humano, respectivamente, exhiben aparentemente una diferente sensibilidad metabólica frente a la Sap-3. Cuando se extrapola la curva de citotoxicidad en la Figura 6A para las células MCF-7 incubadas sin Spn se calcula un valor de CI50 de aproximadamente 1000 nM tanto para SA2E como para Sap-3 (Tabla 1) . Por lo tanto, la Spn potencia la citotoxicidad de Sap-3 inespecífica independiente de ligando para las células MCF-7 solo 1450 veces y, en cambio, la citotoxicidad de SA2E específica dependiente de ligando 385000 veces. Los cocientes de los tratamientos con y sin Spn mostraron una dosis óptima en el intervalo de 0, 01 a 0, 3 nM (Figura 6C) demostrando que la concentración eficaz de IT se puede ajustar fácilmente de acuerdo con la expresión del receptor sobre la superficie de las células diana. La mayor dispersión de los valores se debe al ligero aumento de la dispersión de los datos primarios que se refuerza con la formación del cociente.

Cuando se aplica a células humanas NIH-3T3 sin EGFR no se observa ninguna diferencia entre Sap-3, SA2E y SE (Figuras 7A, B) demostrando que la captación específica de SA2E y SE depende fuertemente del receptor. Las curvas idénticas reflejan la captación inespecífica de las ITs. Se calcularon valores de CI50 de 83 (Sap-3) , 112 (SE) y 135 nM (SA2E, extrapolados) en ausencia de Spn y de 0, 17 (Sap-3) , 0, 13 (SA2E) y 0, 25 nM (SE) en presencia de Spn. Estos valores son casi idénticos a los determinados para Sap-3 sobre células HER14 (0, 22 nM) , que era lo esperado ya que las células HER14 son células NIH-3T3 transfectadas.

Los resultados de los presentes inventores muestran claramente que las concentraciones eficaces de los agentes farmacológicamente activos, por ejemplo ITs se pueden reducir drásticamente cuando se administran junto con

concentraciones no tóxicas de una saponina, por ejemplo Spn. Además se amplía la ventana terapéutica de concentración ya que el efecto potenciador de la saponina sobre el agente farmacológicamente activo sin un componente específico de célula diana, por ejemplo un ligando, es extraordinariamente menor que para los agentes con un componente específico de célula diana, por ejemplo ITs. Por lo tanto, el concepto de la aplicación combinada de una saponina y un agente farmacológicamente activo acoplado a un componente específico de célula diana es una herramienta prometedora para potenciar la función del agente farmacológicamente activo, como se ejemplifica mediante el aumento de la citotoxicidad específica de las ITs sobre células diana y la reducción de los efectos secundarios durante la terapia tumoral.

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24. Mochizuki, M., Yoo, Y.C., Matsuzawa, K., Sato, K., Saiki, L, Tono-oka, S., Samukawa, K., and Azuma, I. 1995. Inhibitor y effect of tumor metastasis in mice by saponins, ginsenoside-Rb2, 20 (R) - and 20 (S) ginsenoside-Rg3, of red ginseng. Biol Pharm Bull. 18:1197-1202.

25. Sato, K., Mochizuki, M., Saiki, I., Yoo, Y.C., Samukawa, K., and Azuma, I. 1994. Inhibition of tumor angiogenesis and metastasis by a saponin of Panax ginseng, ginsenoside-Rb2. Biol Pharm Bull. 17:635-639.

26. Oess, S., and Hildt, E. 2000. Novel cell permeable motif derived from the PreS2-domain of hepatitis-B virus surface antigens. Gene Ther. 7:750-758.

27. Heisler, I., Keller, J., Tauber, R., Sutherland, M., and Fuchs, H. 2002. A Colorimetric Assay for the Quantitation of Free Adenine Applied to Determine the Enzymatic Activity of Ribosome-Inactivating Proteins.

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29. Hebestreit, P. and Melzig, M.F. 2003. Cytotoxic Activity of the Seeds from Agrostemma githago var. githago. Planta Med. 69:921-925.

TABLAS

Tabla 1. Valores de CI50 (nM) y factores de potenciación mediados por Spn para Sap-3 y SA2E sobre diferentes líneas celulares en ausencia y en presencia de Spn.

línea celular Sap-3 SA2E

1, 5 Ig/ml de factor de 1, 5 Ig/ml de factor de sin Spn sin Spn

Spn potenciación Spn potenciación HER14 175 0, 22 790 2, 4 0, 00067 3560 MCF-7 920 ex 0, 63 1450 1040 ex 0, 0027 385000 NIH-3T3 83 0, 17 490 135 ex 0, 13 1050

ex: los valores se extrapolan a partir de los datos de las Figuras 6 A y 7A




Reivindicaciones:

1. Una composición que comprende al menos un agente farmacológicamente activo que tiene un efecto farmacológico detectable sobre una célula o un organismo, acoplado a un componente específico de célula diana que se une de forma específica a una célula diana, y al menos una saponina, seleccionándose dicha saponina entre el grupo que comprende las saponinas triterpenoides con estructuras básicas que pertenecen al tipo del 12, 13-dehidrooleanano con una función aldehído en posición 23, en la que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana es una toxina quimérica o un conjugado de toxina, siendo dicha toxina quimérica o conjugado de toxina una proteína recombinante sencilla, en la que dicho agente farmacológicamente activo no es una saponina, y no es una proteína de unión a antígeno que comprende una región de unión al antígeno y una región o regiones de un anticuerpo que media o median procedimientos inmunológicos dependientes de anticuerpos, tales como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, activación del complemento, opsonización y fagocitosis, en la que dicho componente específico de célula diana se selecciona entre el grupo que comprende (a) proteínas, tales como proteínas naturales, proteínas recombinantes, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, ligandos proteicos y lipoproteicos, tales como factores de crecimiento como por ejemplo EGF, GM-CSF, VEGF, TGF y quimeras de los mismos, citoquinas como por ejemplo interleucinas, interferones, transferrina, moléculas de adhesión como por ejemplo CD4 y activador de plasminógeno de tipo uroquinasa, (b) péptidos, tales como péptidos naturales y péptidos sintéticos, (c) hormonas y las combinaciones de (a) - (c) , y en la que dicha célula diana se selecciona entre el grupo que comprende células cancerosas, y en la que dicho agente farmacológicamente activo es una citotoxina que se selecciona entre el grupo que comprende (a) proteínas vegetales tóxicas, tales como proteínas inactivadora de ribosomas (RIP) , en particular proteínas de tipo I como por ejemplo saporina, diantina, gelonina, PAP y fragmentos enzimáticamente activos de las mismas y la cadena A de proteínas de tipo II como por ejemplo de ricina, abrina, lecitina de muérdago (viscumina) , y modecina, pero sin excluir otros fragmentos o proteínas de tipo II de longitud completa, (b) proteínas y péptidos fúngicos tóxicos, tales como a-sarcina o mitogilina, (c) toxinas bacterianas, tales como la toxina de la difteria o la exotoxina de Pseudomonas, y (d) proteínas animales tóxicas, tales como angiogenina o granzima B, en particular de origen humano.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque, en dicha toxina quimérica o conjugado de toxina, dicho agente farmacológicamente activo se acopla a dicho componente específico de célula diana a través de una unión covalente.

3. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicho componente específico de célula diana es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo o un factor de crecimiento, citoquina o transferrina o una combinación de cualquiera de estos.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicha saponina es Saponinum album de Gypsophila paniculata.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque dicha composición comprende adicionalmente al menos una de las siguientes unidades funcionales: una proteína de transporte capaz de transportar dicho agente farmacológicamente activo al interior de una célula, un enlace de escisión citosólica y un enlace de escisión endosómica.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizada porque dicho agente farmacológicamente activo se acopla a dicho componente específico de célula diana a través de dicha proteína de transporte, enlace de escisión citosólica y/o enlace de escisión endosómica.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

5. 6, caracterizada porque dicha proteína de transporte es un dominio transducción de proteínas (PTD) , dicho enlace de escisión citosólica es parte de un péptido y dicho enlace de escisión endosómica es parte de un péptido.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un medicamento.

9. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un animal que tiene una enfermedad seleccionada entre el grupo que comprende enfermedades cancerosas.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque dicha saponina se debe administrar por separado de dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

9. 10, caracterizado porque dicha saponina se debe administrar a través de una vía diferente a la vía de administración de dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque dicha saponina se debe administrar a través de inyección y dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana se administra a través de ingestión o viceversa.

13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

9. 10, caracterizado porque dicha saponina se debe

administrar a través de la misma vía que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque dicha administración se produce a través de inyección.

15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicacione.

9. 15, caracterizado porque dicha saponina se debe

administrar antes que dicho agente farmacológicamente activo acoplado a dicho componente específico de célula diana.

16. Un kit que comprende, en uno o más envases, dicha composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8.

17. Kit de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque dicho agente farmacológicamente activo acoplado 15 a dicho componente específico de célula diana y dicha saponina están en envases separados.


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