COMPLEJOS INHIBIDORES HDM2 Y USOS DE LOS MISMOS.

Un cristal que consiste en los restos aminoácido 17-111 de HDM2 del SEQ ID NO:

1, con un ligando, donde dicho ligando es un inhibidor de molécula pequeña de HDM2, donde dicho inhibidor de molécula pequeña no peptídico evita que HDM2 interaccione con p53, y donde dicho cristal tiene un grupo espacio seleccionado del grupo que consiste en un grupo espacio trigonal de P3221 y un grupo espacio tetragonal de P43212

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/012347.

Solicitante: ORTHO-MCNEIL PHARMACEUTICAL, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: U.S. ROUTE 202,RARITAN, NJ 08869.

Inventor/es: SCHUBERT,CARSTEN, GRASBERGER,BRUCE, MAGUIRE,DIANE,JOHNSON & JOHNSON PHARM, DECKMAN,INGRID, SPURLINO,JOHN.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 23 de Diciembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/82 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Productos de traducción de oncogenes.
  • G01N33/574T

Clasificación PCT:

  • C12N9/64 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › que provienen de tejido animal, p. ej. renina.
  • C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.
  • G01N33/48 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
  • G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G06F19/00

Clasificación antigua:

  • C12N9/64 C12N 9/00 […] › que provienen de tejido animal, p. ej. renina.
  • C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
  • C12Q1/70 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen virus o bacteriófagos.
  • G01N33/48 G01N 33/00 […] › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
  • G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
  • G06F19/00
COMPLEJOS INHIBIDORES HDM2 Y USOS DE LOS MISMOS.

Fragmento de la descripción:

Complejos inhibidores HDM2 y usos de los mismos.

Campo de la invención

La presente invención tiene que ver generalmente con los campos de la biología molecular, la cristalización de proteínas, el análisis de difracción con rayos X, la determinación de la estructura tridimensional, el modelado molecular y el diseño racional de fármacos basado en la estructura. La presente invención proporciona péptidos HDM2 cristalizados así como descripciones de los patrones de péptidos así como las descripciones de los patrones de difracción de rayos X. Los patrones de difracción de rayos X de los cristales en cuestión tienen suficiente resolución de manera que se puede determinar la estructura tridimensional de HDM2 con resolución atómica, se pueden identificar los sitios de unión al ligando de HDM2, y se pueden modelar las interacciones de los ligandos con los restos aminoácido de HDM2.

Los mapas de alta resolución proporcionados por la presente invención y los modelos preparados utilizando tales mapas también permiten el diseño de ligandos que pueden funcionar como agentes activos. De este modo, la presente invención tiene aplicaciones en el diseño de agentes activos, que incluyen, pero no están limitados a, aquellos que encuentran uso como inhibidores de oncoproteínas MDM2 y HDM2.

Antecedentes de la invención

HDM2: Estructura y Función

La HDM2 (proteína de dobles diminutos humana 2) es el producto de la expresión en exceso de hdm2, un oncogén que es expresado en exceso en un subgrupo de tumores humanos incluyendo sarcomas de tejidos blandos, glioblastomas y carcinomas mamarios (Oliner, J.D. et al., Nature, 358(6381):80-83 (1992); Reifenberger, G. et al., Cancer Res., 53:2736-2739 (1993); Bueso-Ramos, C.E. et al., Breast Canc. Res. Treat., 37(2):179-188 (1996)).

La caracterización funcional de este oncogén reveló una interacción entre HDM2 y p53, un supresor tumoral central para detener el crecimiento celular y la apoptosis (Momand, G.P. et al., Cell, 69:1237 (1992)). HDM2 es una diana transcripcional de p53, y como tal, HDM2 y p53 forman un bucle regulado precisamente (Wu, X. et al., Genes and Dev., 7:1126-1132 (1992)). HDM2 es regulado adicionalmente por la ubiquitinación y por la formación de un complejo con Arf, que secuestra HDM2 en el nucleolo (Tao, W. and Levine, A.J., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96 (12): 6937-6941 (1999); Weber, J.D. et al., Nat. Cell Biol., 1(1):20-26 (1999)).

Existen numerosas lineas de evidencia que sugieren que HDM2 también puede funcionar independientemente de p53. Se han encontrado variantes de empalme de HDM2 que no contienen el dominio de unión a p53 en tumores humanos y se ha demostrado que poseen capacidad transformante (Sigalas, I. et al. Nat. Med. 2(8):912-917 (1996)). Los estudios in vivo también han demostrado que el espectro de tumores que se desarrollan en ratones transgénicos que expresan HDM2 en exceso es diferente del espectro encontrado en ratones nulos para p53 y que HDM2 puede inducir sarcomagénesis en animales nulos para p53 (Jones, S.N. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95 (26) :15608-15612 (1998)). Por último, otros compañeros de unión de HDM2 podrían ayudar a la función de HDM2 a lo largo de la ruta oncogénica, por ejemplo, inhibición por HDM2 de la detención de G1 independiente de p53 inducida por MTBP (Boyd, M.T. et al., J. Biol. Chem. 275 (41):31883-318 90 (2000)).

Los informes sobre el aumento de la muerte de células tumorales tras la inhibición de hdm2 por nucleótidos antisentido (Chen, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95 (1): 195-200 (1998); Chen, L. et al., Mol. Med., 5(1):21-34 (1999); Tortora, G. et al., Int. J. Cancer, 88 (5): 804-809 (2000)) y las mini-proteínas de unión a HDM2 (Bottger, A. et al., Curr. Biol., 7(11):860-869 (1997)) corroboran la predicción de que la inhibición de HDM2 activará p53 y a su vez desencadenará la apoptosis. Siguiendo con esta idea, cabría esperar que un inhibidor de molécula pequeña generado contra el surco de unión a p53 de HDM2 evitara la interacción de las dos proteínas e indujera la actividad de p53. Se ha sugerido adicionalmente que la inhibición de la interacción entre p53 y HDM2 actuará de forma aditiva o sinérgica con los agentes quimioterapéuticos convencionales en el tratamiento de neoplasmas, y esto también es apoyado por el trabajo en el que se utilizan constructos hdm2 antisentido (Wang, H. et al., Clin. Canc. Res. 7(11):3613-3624 (2001)).

MDM2: Estructura y Función

El mdm2, el homólogo murino de HDM2 se encontró originalmente en cromosomas diminutos dobles de ratón y se identificó inicialmente como uno de los tres genes amplificados en una línea celular tumorigénica (Cahilly-Snyder., L. et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:235-244' (1987)). Se encontró con posterioridad que su producto proteico forma un complejo con p53, que se observó primero en una línea celular de fibroblastos de rata (Clon 6) previamente transfectada con un gen p53 de ratón sensible a la temperatura (Michalovitz, D. et al., Cell 62:671-680 (1990)). La linea de células de rata creció bien a 37ºC pero mostró una detención en G1 cuando se desplazaba a 32ºC, lo que concordaba completamente con un desplazamiento dependiente de la temperatura observado en la conformación y la actividad de p53. No obstante, el complejo p53-MDM2 solamente se observaba en abundancia a 32ºC, temperatura a la cual p53 se encontraba predominantemente en forma funcional o de "tipo salvaje" (Barak, Y. et al., EMBO J. 11:2115-2121 (1992) y Momand, J. et al., Cell 69:1237-1245 (1992)). Desplazando la línea celular de rata a 32ºC y bloqueando la síntesis de proteína de novo se demostró que solamente la p53 de "tipo salvaje" inducía la expresión del gen mdm2, explicando de ese modo la abundancia diferencial del complejo en términos de la actividad transcripcional de p53 (Barak, Y. et al., EMBO J. 12:461-468 (1993)). La explicación se desarrolló adicionalmente mediante la identificación de un sitio de unión al ADN para p53 de tipo salvaje en el primer intrón del gen mdm2 (Wu, X. et al., Genes Dev. 7:1126-1132 (1993)). Los constructos informadores que empleaban este sitio de unión al ADN de p53 revelaron que eran inactivados cuando p53 de tipo salvaje era expresada simultáneamente con MDM2.

Esta inhibición de la actividad transcripcional de p53 puede estar causada por el bloqueo por MDM2 del dominio de activación de p53 y/o el sitio de unión al ADN. Por consiguiente, se propuso que la expresión de mdm2 está autorregulada, por medio del efecto inhibidor de la proteína MDM2 sobre la actividad transcripcional de p53 de tipo salvaje. Este bucle de retroalimentación autorreguladora de p53-mdm2 proporcionó una nueva percepción en cuanto a cómo podría estar regulado el crecimiento celular por p53. Se considera que hasta un tercio de los sarcomas humanos superan el control del crecimiento regulado por p53 mediante la amplificación del gen mdm2 (Oliner, J.D. et al., Nature 358:80-83 (1992)). Por lo tanto, la interacción entre p53 y MDM2 representa una diana terapéutica potencial clave.

p53: Interacción con HDM2 y MDM2

p53 es un factor de transcripción para numerosas proteínas que ocasionan la detención del ciclo celular o la muerte celular mediante apoptosis, tales como p21, 14-3-3s, y bax. El nivel y la actividad transcripcionales de p53 se incrementan por los daños en el ADN celular. La proteína MDM2 inhibe la función de p53 uniéndose a una hélice N-terminal anfipática de p53, abrogando la interacción de p53 con otras proteínas y su actividad de transactivación. La interacción con MDM2 también dirige p53 a la degradación de proteína dependiente de ubiquitina. MDM2 también muestra efectos independientes de p53 sobre el ciclo celular, posiblemente mediante la interacción directa con algunos de los efectores aguas abajo tales como pRB y EF2 (Revisado por Zhang, R. and Wang, H., Cur. Pharm. Des. 6:393-416 (2000)).

Las mutaciones de la proteína p53 se producen en el 50% de todos los cánceres humanos (revisado por Agarwal, M.L. et al. J. Biol. Chem. 273:1-4 (1998); Levine, A.J., Cell 88:323-331(1997); y, referencias citadas en Oren; M., J. Biol. Chem. 274:36031-36034 (1999)). En circunstancias normales, p53 es una proteína latente y muy lábil, que funciona con una vida media muy corta de unos pocos minutos (Rogel, A. et al., Mol. Cell. Biol. 5:2851-2855 (1985)). La lesión o el estrés del ADN inducen un notable incremento de la estabilidad de p53 (Kastan, M.B. et al.,...

 


Reivindicaciones:

1. Un cristal que consiste en los restos aminoácido 17-111 de HDM2 del SEQ ID NO: 1, con un ligando, donde dicho ligando es un inhibidor de molécula pequeña de HDM2, donde dicho inhibidor de molécula pequeña no peptídico evita que HDM2 interaccione con p53, y donde dicho cristal tiene un grupo espacio seleccionado del grupo que consiste en un grupo espacio trigonal de P3221 y un grupo espacio tetragonal de P43212.

2. El cristal de la reivindicación 1, donde el cristal difracta eficazmente los rayos X para la determinación de las coordenadas atómicas para una resolución de al menos aproximadamente 3,0 Å.

3. El cristal de la reivindicación 1, donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en Ácido (4-cloro-fenil)-[3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-acético; Ácido [8-cloro-3-(4-cloro-fenil)-7-yodo-2,5-dioxo-1,2,3,5-tetrahidro-benzo[e][1,4]diazepin-4-il]-(4-cloro-fenil)-acético); y sus derivados.

4. Un método para la producción de un complejo cristalino que comprende un polipéptido HDM2-ligando que comprende:

(a) poner en contacto el polipéptido HDM2 con dicho ligando en una solución adecuada que comprende PEG y NaSCN; y,
(b) cristalizar dicho complejo resultante de polipéptido HDM2-ligando de dicha solución,

donde el polipéptido HDM2 consiste en los restos aminoácido 17-111 del SEQ ID NO:1.

5. El método de la reivindicación 4, donde dicho PEG tiene un intervalo de peso molecular medio de 100 a 1.000, donde dicho PEG está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 0,5% p/v a aproximadamente 10% p/v y dicho NaSCN está presente en solución en un intervalo de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 150 mM.

6. El método de la reivindicación 5, donde dicho PEG tiene un peso molecular medio de aproximadamente 400 y está presente en solución a aproximadamente 2% p/v y dicho NaSCN está presente en solución a aproximadamente 100 mM.

7. El método de la reivindicación 6, donde dicha solución comprende adicionalmente (NH4)2SO4 aproximadamente 1,8-2,4 M y tampón aproximadamente 100 mM.

8. Un método para la producción de un cristal de la reivindicación 1 que comprende:

(i) formar un complejo de un péptido que consiste en los aminoácidos 17-111 del SEQ ID NO: 1 con una pequeña molécula;
(ii) concentrar dicho complejo; y
(iii) permitir que dicho complejo concentrado cristalice.

9. Un método para la producción de un complejo cristalino que comprende:

mezclar 1-2 µl de proteína HDM2 que consiste en los aminoácidos 17-111 del SEQ ID NO: 1 formando complejo con una molécula pequeña y concentrada a aprox. 10 mg/ml a una razón 1:1 con solución de pocillo ((NH4)2SO4 1,8-2,4 M y tampón 100 mM pH 6,5-9,0, PEG 400 al 2%, NaSCN 100 mM);

colocar dicha solución mixta sobre un cubre de vidrio;

invertir el cubre de vidrio y sellar el cubre de vidrio sobre un reservorio de 500-1000 µl de solución de pocillo;

incubar el cubre de vidrio a 4ºC durante aproximadamente 3 a aproximadamente 7 días para permitir la formación de cristales; y

recoger los cristales.


 

Patentes similares o relacionadas:

Nuevo péptido con cuatro epítopos CTL unidos, del 15 de Abril de 2020, de TAIHO PHARMACEUTICAL CO., LTD.: Un péptido que consiste en 4 epítopos unidos, en el que los 4 péptidos de epítopo se seleccionan del grupo que consiste en los péptidos de epítopo CTL: el péptido como […]

Receptores de células T anti-KRAS mutado, del 8 de Enero de 2020, de The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services (100.0%): Receptor de células T (TCR) aislado que tiene especificidad antigénica para un epítopo mutado presentado en el contexto de una molécula de HLA-A11, consistiendo […]

Vacuna peptídica que comprende péptido ras mutante y agente quimioterapéutico, del 18 de Junio de 2019, de TARGOVAX ASA: Al menos un péptido, adecuado para provocar una respuesta inmunitaria, en el que el o cada péptido corresponde a un fragmento de una proteína RAS de tipo silvestre pero tiene […]

Proteína Brachyury, vectores adenovirales que codifican proteína Brachyury y su uso, del 5 de Junio de 2019, de The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services: Una cantidad eficaz de un vector adenoviral que codifica (a) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en un 90 % a […]

Nuevo antígeno de cáncer EEF2, del 17 de Abril de 2019, de INTERNATIONAL INSTITUTE OF CANCER IMMUNOLOGY, INC.: Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de cánceres en un sujeto positivo para HLA-A*2402, en donde dicha composición farmacéutica […]

Moléculas de fusión KIF5B-RET y usos de las mismas, del 14 de Marzo de 2019, de Foundation Medicine, Inc: Un agente anticáncer para su uso en un procedimiento de tratamiento a un sujeto que tiene un cáncer colorrectal con una fusión del miembro de la […]

Polipéptidos y polinucleótidos, y usos de los mismos como una diana farmacológica para producir fármacos y agentes biológicos, del 9 de Enero de 2019, de COMPUGEN LTD: Un anticuerpo monoclonal o policlonal o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al ectodominio de C1ORF32 o porciones o variantes del mismo y bloquea la interacción […]

Una mezcla de péptidos, del 18 de Septiembre de 2018, de TARGOVAX ASA: Una mezcla de péptidos adecuada para desencadenar una respuesta inmunitaria que comprende un primer, segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo y octavo péptido, cada […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .