Complejos de calcio y de fosfopéptidos.

Un método para producir un complejo de fosfato de calcio amorfo estabilizado a partir de una forma básica defosfato de calcio amorfo estabilizada por un fosfopéptido de caseína,

donde dicho fosfopéptido incluye la secuenciade aminoácidos Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu, formado por titulación de iones calcio e iones fosfato manteniendosimultáneamente el pH por encima de 7 en presencia de dicho fosfopéptido.

Complejos de calcio y de fosfopéptidos La presente invención se refiere a nuevos complejos en los que fosfatos de calcio amorfos son estabilizados por fosfopéptidos. Estos complejos tienen efectos anticariogénicos y se pueden usar también como suplementos dietéticos para aumentar la biodisponibilidad del calcio y para curar o prevenir enfermedades asociadas a deficiencias de calcio. También se proporcionan métodos de preparación de los complejos de la invención y de tratamiento o prevención de caries dentales, malabsorción de calcio y enfermedades óseas.

Antecedentes Caries dental

La caries dental se inicia por desmineralización del tejido duro de los dientes por acción de los ácidos orgánicos producidos a partir de la fermentación del azúcar de la dieta por bacterias odontopatógenas de la placa dental.

Aunque la prevalencia de caries dentales ha disminuido por el uso de fluoruro en los países más desarrollados, la enfermedad sigue siendo un problema importante de salud pública. La carga económica estimada del tratamiento de las caries dentales en Australia en 1991 fue de $471 millones, superior al de otras enfermedades relacionadas con la dieta, como las coronariopatías, la hipertensión o los accidentes cerebrovasculares.

En los países en desarrollo donde está aumentando la disponibilidad de alimentos industrializados, también está aumentando la prevalencia de caries dentales. Estudios recientes han puesto de relieve una serie de variables sociodemográficas asociadas al riesgo de desarrollar caries; hay un alto riesgo asociado al origen étnico y al nivel socioeconómico bajo. El nivel de individuos con alto riesgo se ha mantenido constante a pesar de que la gravedad y la prevalencia globales de la enfermedad en la comunidad han disminuido. Las caries dentales, por lo tanto, siguen siendo un problema importante de salud pública, particularmente en determinados grupos étnicos y en grupos socioeconómicos bajos. Esto pone de relieve la necesidad de un anticariogénico no tóxico, que pueda complementar los efectos del fluoruro para reducir aún más la incidencia de caries dentales. Sería particularmente deseable contar con un agente que pudiera disminuir la dosis de fluoruro necesaria para reducir la incidencia de caries en vista de la ansiedad de la comunidad con respecto al fluoruro y en vista del hecho de que puede producirse fluorosis incluso en las dosis utilizadas actualmente.

El grupo de alimentos con actividad anticaries más reconocido es el de los productos lácteos (leche, concentrados de leche, leche en polvo y quesos) . La patente de Estados Unidos Nº 5, 130, 123 da a conocer que el componente responsable de esta actividad anticariogénica es la caseína. Sin embargo, el uso de la caseína como anticariogénico está impedido por sus propiedades organolépticas adversas y los muy altos niveles necesarios para su actividad.

Las investigaciones preliminares determinaron que fosfopéptidos trípticos de caseína contribuyeron a la actividad anticariogénica y este fue el tema de la patente de Estados Unidos Nº 5, 015, 628. En particular, los péptidos Bos as1-caseína X-5P (f59-79) [1], Bos ß-caseína X-4P (f1-25) [2], Bos as2-caseína X-4P (f46-70) [3] y Bos as2-caseína X-4P (f1-21) [4] se dieron a conocer en la patente de Estados Unidos 5, 015, 628 de la manera siguiente:

[1] Gln59-Met-Glu-Ala-Glu-Ser (P) -Ile-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Ser (P) -Val-Glu-Gln- Lys79. as1 (59-79)

[2] Arg1-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser (P) -Leu-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-Ser-Ile- Thr-Arg25. ß (1-25)

[3] Asn46-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-Ser (P) -Ala-Glu-Val-Ala-Thr- Glu-Glu-

[4] Lys1-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Ser (P) -Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys21. as2 (1-21)

La determinación preliminar de los fosfopéptidos anteriores para usar en combinación con CaHPO4 e hidroxiapatita proporcionó nuevos péptidos con propiedades anticariogénicas. Sin embargo, investigaciones posteriores determinaron que el motivo secuencial del agrupamiento Ser (P) de los fosfopéptidos dados a conocer antes, tiene la inesperada capacidad de estabilizar su propio peso en fosfato de calcio amorfo. La capacidad de los fosfopéptidos anteriores y en particular del motivo Ser (P) de estabilizar el fosfato de calcio amorfo fue absolutamente inesperada y no fue dada a conocer ni comunicada en ninguna publicación conocida por los solicitantes. Encontramos en la actualidad que la forma amoría del fosfato de calcio Ca3 (PO4) 1.87 (HPO4) 0.2xH2O donde x ? 1 estabilizada por los fosfopéptidos de caseína, es la forma básica de fosfato de calcio no cristalino más soluble y una forma superior de fosfato de calcio que previene las caries y aumenta la biodisponibilidad del calcio. El fosfato de calcio amorfo (ACP) se debe preparar por titulación cuidadosa de iones Ca (por ej. CaCl2) e iones fosfato (por ej. NaHPO4) manteniendo simultáneamente el pH por encima de 7 (preferentemente 9.0) en presencia del fosfopéptido. A medida que se forma ACP, el fosfopéptido se une a los núcleos nacientes y estabiliza el ACP como un complejo de fosfopéptido-ACP. Sin el fosfopéptido, el ACP precipitará de la solución y se transformará en minutos en la fase de fosfato de calcio más estable, la hidroxiapatita cristalina (HA) . La HA, al ser insoluble tiene una actividad anticariogénica limitada y presenta al calcio en una forma poco biodisponible. La fase ácida del fosfato de calcio, CaHPO4, aunque es sin duda más soluble que la hidroxiapatita, se une poco al fosfopéptido y se localiza escasamente en la superficie del diente y por lo tanto también tiene actividad anticariogénica limitada. La inesperada capacidad de los fosfopéptidos mencionados antes y en particular del motivo del agrupamiento Ser (P) de estabilizar el fosfato de calcio amorfo no fue dada a conocer ni comunicada en la patente de Estados Unidos Nº 5, 015, 628 y proporciona por primera vez un método confiable y eficaz de producir un complejo de fosfato de calcio amorfo estabilizado, con ventajas distintivas y novedosas en tratamientos y administración de calcio. La patente de Estados Unidos Nº 5, 015, 628 no da a conocer la fase excepcional de fluoruro pentafosfato de calcio amorfo Ca8 (PO4) 5F x H2O donde x ? 1 que encontramos ahora que es estabilizada por los fosfopéptidos anteriores y que se puede localizar en la superficie del diente para proporcionar una eficacia anticaries superior. Esta inesperada capacidad de estabilizar el fosfato de calcio amorfo constituye la base de la presente invención.

Reynolds EC (Proceedings of the Nutrition Society of Australia (1995) , 95-102) describe un método para producir complejos de CPP-ACP ácidos que contienen principalmente iones HPO42-y H2PO4- colocando complejos ya formados en soluciones con diferentes valores de pH.

WO 93/03707 describe fosfato de calcio ácido unido a péptido formado a partir de péptidos suspendidos en una solución de Tris/CHES a diferentes pH antes de ser mezclados con soluciones que contienen iones de calcio y fosfato.

WO 94/00146 describe el uso de fosfato de calcio ácido unido a péptido para el tratamiento de la hipersensibilidad dental.

Resumen de la invención En un aspecto, la invención proporciona un complejo estable de fosfato de calcio, que comprende fosfato de calcio amorfo o un derivado de éste estabilizados por un fosfopéptido, donde dicho fosfopéptido contiene la secuencia -Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-.

El fosfato de calcio amorfo (ACP) tiene preferentemente la fórmula [Ca3 (PO4) 1.87 (HPO4) 0.2 x H2O] donde x ? 1. El derivado de fosfato de calcio puede ser un fluoruro pentafosfato de calcio de fórmula [Ca8 (PO4) 5 F x H2O) ] donde x 1, que proporciona fluorofosfato de calcio amorfo (ACFP) .

El fosfopéptido (PP) puede provenir de cualquier fuente; se puede obtener por digestión tríptica de la caseína u otras proteínas ricas en fosfo-ácido como fosfitina, o por síntesis química o recombinante, siempre que contenga la secuencia básica -Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-. La secuencia que flanquea esta secuencia base puede ser cualquier secuencia. Sin embargo, se prefieren esas secuencias flanqueantes de as1 (59-79) [1], ß (1-25) [2], as2 (46-70) [3] y as2 (1-21) [4]. Las secuencias flanqueantes pueden ser modificadas opcionalmente por supresión, adición o sustitución conservadora de uno o más residuos. La composición y la secuencia de aminoácidos de la región flanqueante no son críticas siempre y cuando se mantenga la conformación del péptido, y que todos los grupos fosforilo y carboxilo que interaccionan con los iones calcio se mantengan como las regiones flanqueantes... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir un complejo de fosfato de calcio amorfo estabilizado a partir de una forma básica de fosfato de calcio amorfo estabilizada por un fosfopéptido de caseína, donde dicho fosfopéptido incluye la secuencia de aminoácidos Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu, formado por titulación de iones calcio e iones fosfato manteniendo simultáneamente el pH por encima de 7 en presencia de dicho fosfopéptido.

2. El método de la reivindicación 1, donde el pH es 9.0.

3. Un método para producir un complejo de fosfato de calcio estable que incluya una forma básica de fosfato de calcio amorfo estabilizada por un fosfopéptido, donde dicho fosfopéptido contiene la secuencia de aminoácidos Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu, que comprende los pasos de:

(i) obtener una solución de fosfopéptido con un pH de 9.0;

(ii) mezclar (i) con soluciones que contengan calcio y fosfato inorgánico, y mantener el pH en 9.0.

4. Un complejo que contiene una forma básica de fosfato de calcio amorfo estabilizada por un fosfopéptido, donde dicho fosfopéptido contiene la secuencia de aminoácidos Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu, que es directamente producido con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Un complejo de acuerdo con la reivindicación 4, donde dicho fosfopéptido contiene la secuencia de aminoácidos elegida entre cualquiera de las siguientes:

[1] Gln59-Met-Glu-Ala-Glu-Ser (P) -Ile-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-Ile-Val-Pro-Asn-Ser (P) -Val-Glu-Gln-Lys79. as1 (59-79)

[2] Arg1-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-Ser (P) -Leu-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-SerlIe- Thr-Arg25. ? (1-25)

[3] Asn46-Ala-Asn-Glu-Glu-Glu-Tyr-Ser-Ile-Gly-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-Ser (P) -Ala-Glu-Val-Ala-Thr-GluGlu-Val-Lys70. as2 (46-70)

[4] Lys1-Asn-Thr-Met-Glu-His-Val-Ser (P) -Ser (P) -Ser (P) -Glu-Glu-Ser-Ile-Ile-Ser (P) -Gln-Glu-Thr-Tyr-Lys21. as2 (1-21) .

6. Un vehículo de administración concebido para colocalizar iones incluidos los iones calcio y fosfato en un sitio diana, donde dicho vehículo de administración contiene como principio activo, el complejo de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.

7. El vehículo de administración de la reivindicación 6 que es uno de los siguientes: pasta dentífrica, polvo dentífrico, dentífrico líquido, enjuague bucal, trociscos, goma de mascar, pasta dental, crema para masaje gingival, comprimidos para gargarismos, productos lácteos y otros productos alimenticios.

8. Una composición farmacéutica que contiene un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 en combinación con un excipiente farmacéutico.

9. Una composición anticariogénica que contiene la composición de la reivindicación 8 o el vehículo de administración de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 adaptada para el uso anticariogénico.

10. Una composición terapéutica que contiene la composición de la reivindicación 8 adaptada para uso terapéutico.

11. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 que tiene un pH entre aproximadamente 4.5 y aproximadamente 9.

12. Un complemento alimenticio que contiene un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5.

13. Un complemento alimenticio de acuerdo con la reivindicación 12 donde dicho complemento contiene de 0.1 a 100% p/p de dicho complejo.

14. Un complemento alimenticio de acuerdo con la reivindicación 13 donde dicho complemento contiene 2% p/p de dicho complejo.

15. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 destinado al tratamiento o la prevención de las caries dentales o la erosión dental.

16. El complejo destinado al tratamiento o la prevención de las caries dentales o la erosión dental de acuerdo con la

reivindicación 15, donde dicha composición farmacéutica se administra a los dientes o las encías de un sujeto que lo necesita.

17. El complejo destinado al tratamiento o la prevención de las caries dentales o la erosión dental de acuerdo con la 5 reivindicación 15 o 16 donde dicha composición farmacéutica se administra tópicamente.

18. Un complejo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 para usar en el tratamiento de una o más afecciones relacionadas con la pérdida de calcio del organismo incluidos los huesos, la deficiencia de calcio o la malabsorción de calcio.