COMPLEJO INMUNOGÉNICO PARA VACUNACIÓN Y MÉTODO DE OBTENCIÓN.

Complejo inmunogénico para vacunación y método de obtención.

La presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un antígeno polimerizado,

manano y un dialdehído, la composición que lo comprende, y el uso del mismo como estimulador de la respuesta inmune y vacuna, útil en el tratamiento de enfermedades infecciosas, neoplasias y alergias. Asimismo, la invención se relaciona con el método de obtención de dicho complejo inmunogénico, basado en la polimerización y conjugación simultánea del antígeno y el manano mediante el empleo de un dialdehído.

Complejo inmunogénico para vacunación y método de obtención

La presente invención se relaciona con un complejo inmunogénico que comprende un

S antígeno polimerizado, manano y un dialdehído, la composición que lo comprende, yel

uso del mismo como estimulador de la respuesta inmune y vacuna. Asimismo, la

invención se relaciona con el método de obtención de dicho complejo inmunogénico,

basado en la polimerización y conjugación simultánea del antígeno y el manano mediante

el empleo de un dialdehído. Por lo tanto, la invención se encuadra dentro del campo de la

10 inmunología y de la producción de vacunas, así como en el tratamiento y prevención de

las alergias.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las células dendríticas (OC) son células presentadoras de antígeno especializadas para

15 estimular eficazmente a los linfocitos T, y por ello son fundamentales en la inducción de

una respuesta inmune específica. Las OC inmaduras estan distribuidas de forma

estratégica en tejidos y órganos donde actúan como centinelas, tomando continuamente

muestras de antígenos en su micro-entorno. Las OC inician un proceso de maduración en

respuesta a diferentes estímulos, en los que se incluyen los propios antígenos, productos

20 de microorganismos y señales de alarma tisulares, que desemboca en la migración hacia

las áreas T de los órganos linfáticos secundarios, portando los antígenos cargados por

ellas en la periferia. Aquí, las OC maduras, que tienen un aumento en la expresión de

moléculas HLA-H y moléculas coestimuladoras, interactúan con las células T,

presentándolas los péptidos antigénicos tras su procesamiento, y estimulándolas para

25 iniciar la respuesta específica.

Las OC inmaduras capturan los antígenos por endocitosis mediada por receptor,

micropinocitosis y fagocitosis. Existen diferentes receptores implicados en la captura

endocítica, entre los que se encuentran los receptores para manosa (MR) (CD206 y

30 CD209) . A través de dominios de reconocimiento de carbohidratos reconocen residuos

terminales de manosa, fucosa y/o N-acetilglucosamina. Los ligandos naturales incluyen

productos de origen bacteriano (glicoproteínas y glicolípidos) , así como glicoproteínas de

mamíferos con alto contenido en manosa. Los MR se expresan en macrófagos y OC

inmaduras, interviniendo en la endocitosis de antígenos manosilados para su

procesamiento y presentación a los linfocitos T.

La inmunoterapia en las enfermedades alérgicas mediadas por anticuerpos IgE se basa

S en la administración de vacunas terapéuticas cuyos antígenos son los mismos alérgenos

frente a los que el paciente alérgico está sensibilizado. Los alérgenos son proteínas

procedentes de pólenes, ácaros del polvo, epitelios, etc, que son las superestructuras

transportadas por el aire que respira el enfermo (inhalantes ambientales) . Es

ampliamente aceptado que la eficacia clínica de estas vacunas se asocia a la dosis de

10 alérgeno administrada, por lo que la OMS y las guías consenso de las sociedades

científicas recomiendan que las vacunas se preparen con una concentración suficiente de

alérgenos. Esta necesidad hace que la respuesta del paciente alérgico a la dosis de

vacuna suponga riesgo de efectos adversos que se tratan de limitar. Una vía para ello es

la preparación de vacunas a base de alérgenos modificados (alergoides) con menor

15 capacidad de reacción con los anticuerpos IgE (menor alergenicidad) .

Las modificaciones químicas basadas en el tratamiento de los alérgenos con

formaldehido y/o glutaraldehído son las más usadas por los fabricantes de vacunas. La

reacción de grupos aldehídos (R-CHO) con los grupos aminos (R-NH2) presentes en los

20 aminoácidos de los alérgenos, por ejemplo, lisinas, es la base de la modificación. Al

contrario del formaldehido que es un mono-aldehído, el glutaraldehído es un di-aldehído

con dos grupos R-CHO, capaz de reaccionar con R-NH2 de lisinas presentes en

moléculas distintas. Esto produce una polimerización de los alérgenos y una pérdida de

reactividad con los anticuerpos IgE específicos (el alergoide que se forma a través del

25 formaldehido se basa en la modificación estructural de la proteína, no por su

polimerización) . Se considera que esta polimerización es la que determina la menor

alergenicidad del alergoide, al perder los anticuerpos IgE su accesibilidad para reaccionar

con sus epitopos (sitios de unión al alérgeno) y reducir el número de mastocitos

sensibilizados con IgE que pueden ser activados por ellos. La pérdida de alergenicidad

30 de los alérgenos polimerizados puede conllevar una pérdida de inmunogenicidad, lo que

reduciría la eficacia clínica de estos preparados. Se ha sugerido que la polimerización

reduce el acceso de los MR en las OC a los residuos de manosa de los alérgenos y que

ello es determinante para la pérdida de inmunogenicidad de los alérgenos polimerizados.

Esto es apoyado por el hecho de que los residuos de manosa son uno de los principales

ligandos utilizados por las DC para la captación de alérgenos, y que estas células juegan

un papel crítico en la presentación de alérgenos a los linfocitos T respondedores.

Los métodos de conjugación de azúcares con proteínas se basan principalmente en la

S activación del azúcar por un proceso de oxidación, a través de la generación de grupos

aldehídos reactivos (R-CHO ) por conversión de los grupos cis-glicol. Los R-CHO

generados en el azúcar oxidado, tras tratamiento con meta-per y odato por ejemplo,

pueden reaccionar con los grupos E-aminos de lisinas dando lugar a la formación de

bases de Schiff. Esta metodología resulta muy apropiada para conjugar glicoproteínas (p.

10 ej., enzimas, anticuerpos) , ya que se aprovecha su residuo carbohidrato para la

conjugación y evita la porción proteica asociada a su actividad biológica.

Aunque la oxidación del azúcar con per y odato se ha descrito también para manosilar

proteínas (Masarova et al. 2002. Int. J. Polymer. Anal. Charact., 7: 106-116) , incluyendo

15 alérgenos (Weinberger et al. 2013. J Control Release, 165: 101-109) , su uso para

manosilar antígenos polimerizados tiene dos importantes inconvenientes:

a) La oxidación de los azúcares produce la rotura de los enlaces entre los átomos de

carbono adyacentes que contienen los grupos hidroxilos (OH) , y que son la base

para la generación de aldehídos reactivos. Dicha rotura afecta a la estructura de la

20 manosa (Shibuya, N., et al. 1988. J. Biol. Chem., 263: 728-734) , alterándose su

capacidad de unión con lectinas que reconocen manosa (Masarova et al. 2001 ,

Chem. Pap. 55: 130-135) y de activación de DC (Sheng el al, 2006. Immunology,

118:372-383) . Aunque se puede minimizar la pérdida de la integridad estructural

de la manosa disminuyendo el grado de oxidación (Masarova et al. 2001 , Chem.

25 Pap. 55: 130-135) , su eficacia para la conjugación en condiciones más suaves

queda supeditada a la naturaleza de la proteína a manosilar (Weinberger et al.

2013, J. Control Release, 165: 101-109) . Para preservar la manosa en su forma

nativa se ha intentado la manosilación de proteínas mediante reacciones de

glicosilación a alta temperatura pero con resultado negativo en ausencia de

30 oxidación (Kanska et al. 2008. Biotechnol. Appl. Biochem. 49: 57-64) .

b) La manosa activada tras su oxidación genera aldehídos reactivos que deben

interaccionar con grupos aminos libres de la proteína a manosilar. Sin embargo,

la polimerización de proteínas con glutaraldehído produce una drástica reducción

de estos grupos aminos, al haber sido ya utilizados en su reacción con el propio glutaraldehído. En estas condiciones, es previsible que la eficacia de la manosa activada para manosilar proteínas previamente tratadas con glutaraldehído sea muy baja, de la misma forma que lo es la capacidad del glutaraldehído para polimerizar en defecto de grupos aminos a los que unirse (Silva el al. 2004. Food Technol. Biotechnol. 42: 51-56) . Este inconveniente no solo afecta a la manosilación de alérgenos polimerizados, sino a la de cualquier proteína polimerizada con glutaraldehido que eventualmente se quiera manosilar.

Patterson el al. 1977 (J Allergy Clinical Immunology 59: 314-319) describen la polimerización de alérgenos (polen de gramíneas) con glutaraldehído. Los alérgenos polimerizados resultan hipoalergénicos ya que tienen reducidad su capacidad de activación de los mastocitos sensibilizados... [Seguir leyendo]

1. Un complejo inmunogénico que comprende un antígeno poli me rizado, manano y un dialdehído.

2. Complejo inmunogénico según la reivindicación 1, en el que el manano procede de un vegetal, de un hongo o de una levadura.

3. Complejo inmunogénico según la reivindicación 2, en el que la levadura es

seleccionada del grupo que consiste en Saccharomyces ssp., Pichia ssp. y Cándida ssp.

4. Complejo inmunogénico según la reivindicación 3, en el que Saccharomyces ssp. es S. cerevisiae.

5. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el manan o comprende grupos amino.

6. Complejo inmunogénico según la reivindicación 5, en el que los grupos amino se encuentran en el aminoácido lisina.

7. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el antígeno polimerizado comprende al menos dos antígenos iguales o distintos entre sí.

8. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el dialdehído se selecciona del grupo que consiste en glutaraldehído, glioxal, malonaldehído, succinaldehído yadipaldehído.

9. Complejo inmunogénico según la reivindicación 8, en el que el dialdehído es glutaraldehído.

10. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el antígeno polimerizado está unido al manano a través del dialdehído.

. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el antígeno está unido al manano mediante atrapamiento físico por el antígeno polimerizado.

12. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el antígeno es un alérgeno.

13. Complejo inmunogénico según la reivindicación 12, en el que el alérgeno se selecciona del grupo que consiste en pólenes, ácaros, epitelios, esporas de hongos y combinaciones de ellos.

14. Complejo inmunogénico según la reivindicación 13, en el que el polen procede de la especie Phfeum pratense, Dactylis g/amerala, Cynodon dactylon, Lolium perenne, Trisetum spp., Olea europaea, Cuppresus spp., Ambrosía spp., Betula spp., Platanus spp., Cor y lus avellana o Alnus glutinosa.

15. Complejo inmunogénico según la reivindicación 13 ó14, en el que el ácaro pertenece a la especie Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides (afinae o Blomia tropicalis.

16. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el epitelio pertenece a la especie Felis domesticus o Canis familiafis.

17. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en el que la espora del hongo pertenece a la especie Alternarla alternata o Alternaria tenuis.

18. Complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la proporción antígeno:manano es de entre 1:10 y 1 :0, 1, preferiblemente 1:0, 3 ó 1 :0, 5.

19. Método para obtener un complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende (i) preparar una disolución que comprende un antígeno y manano, y (ii) añadir un dialdehído a dicha disolución.

20. Método según la reivindicación 19, que además comprende una etapa (jii) que comprende la adición de un agente neutralizante, preferiblemente glicina, para detener la reacción de polimerización.

21 . Método según la reivindicación 19 Ó 20, que además comprende una etapa (iv) de aislamiento del complejo inmunogénico .

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , en el que el manan o procede de un vegetal, de un hongo o de una levadura.

23. Método según la reivindicación 22, en el que la levadura se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces ssp., Pichia ssp. y Cándida ssp.

24. Método según la reivindicación 23, en el que Saccharomyces ssp. es S. cerevisiae.

25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24, en el que el manan o comprende grupos amino.

26. Método según la reivindicación 25, en el que los grupos amino se encuentran en el 20 aminoácido lisina.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 26, en el que el antígeno polimerizado comprende al menos dos antígenos iguales o distintos entre sí.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, en el que el dialdehído se selecciona del grupo que consiste en glutaraldehído, glioxal, malonaldehído, succinaldehído y adipaldehído.

29. Método según la reivindicación 28, en el que el dialdehído es glutaraldehído.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 29, en el que el antígeno es un alérgeno.

31. Método según la reivindicación 30, en el que el alérgeno se selecciona del grupo que consiste en pólenes, ácaros, epitelios, esporas de hongos y combinaciones de ellos.

32. Método según la reivindicación 31 , en el que el polen procede de la especie Phleum pratense, Dactylis g/amerala, Cynodon dactylon, Lolium perenne, Trisetum spp., Olea europaea, Cuppresus spp., Ambrosía spp., Betula spp., Platanus spp., Cor y lus avellana o Alnus glutinosa.

33. Método según la reivindicación 31 Ó 32, en el que el ácaro pertenece a la especie Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae o B/amia tropicalis.

34. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, en el que el epitelio pertenece a la especie Felis domesticus o Canis familiaris.

35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 34, la espora del hongo pertenece a la especie Alternaria alternata o Alternaria tenuis.

36. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 35, en el que la proporción antígeno:manano es de entre 1 :10 y 1 :0, 15, preferiblemente, 1 :0, 3 ó 1 :0, 5.

37. Composición farmacéutica que comprende un complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

38. Composición farmacéutica según la reivindicación 37, que comprende, además, un adyuvante.

39. Composición farmacéutica según la reivindicación 38, en el que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en hidróxido de aluminio, fosfato cálcico, tirosina, monofosforil lípido A y chitosan.

40. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 39, que comprende, además, una sustancia activa adicional.

. Composición según la reivindicación 40, en la que dicha sustancia activa adicional

comprende un agente antihistamínico, una hormona esteroidea, un antagonista de receptores de histamina, leucolrienos o mezclas de los mismos.

42. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41, en el que la composición está formulada en micropartículas, nanopartículas o liposomas.

43. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42, en el que la composición está en una forma farmacéutica de administración sólida, en una forma farmacéutica de administración líquida, o en una forma farmacéutica de administración que comprende un sistema disperso.

44. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 43, en el que la composición farmacéutica está en una forma farmacéutica adecuada para su administración por vía parenteral, intranasal, perioral, sublingual, oral, transdérmica o tópica.

45. Uso de un complejo inmunogénico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la elaboración de una composición farmacéutica.

46. Uso según la reivindicación 45, para estimular y/o inducir la respuesta inmune en un 25 sujeto.

47. Uso según la reivindicación 45, como vacuna.

48. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 45 a 47, para el tratamiento de una 30 enfermedad infecciosa, una neoplasia o de la alergia en un sujeto.