Colorantes fluorescentes de fosfonato y conjugados.

Un reactivo colorante fluorescente que tiene la fórmula:**Fórmula**

en donde

FI es un componente colorante fluorescente;

Lf es un grupo enlazante que tiene un miembro unido seleccionado del grupo que consiste en un grupo funcional protegido o no protegido, un grupo reactivo, un resto enlazante polifuncional, un resto de fosforamidita y un soporte sólido;

el subíndice m es un número entero de 0 a 1;

Pz es un grupo fosfonato de ión dipolar protegido que tiene la fórmula (a) o (b):

en donde la línea ondulada indica la unión directa a un carbono sp2 de dicho componente colorante fluorescente;

L es un grupo enlazante;

cada uno de RA y RB se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo(C1-C8) y un grupo protector lábil; Rc se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo(C1-C8), arilo, aril alquilo(C1-C4), un grupo protector lábil o un grupo enlazante alquileno que tiene un grupo hidroxi distal o hidroxi protegido;

el subíndice n es un número entero de 1 a 2;

y una sal del mismo.

Colorantes fluorescentes de fosfonato y conjugados Antecedentes de la invención La presente invención proporciona varios colorantes modificados, tales como colorantes de xanteno, incluyendo rodaminas, rodoles y fluoresceínas que están sustituidos con uno o dos grupos fosfonato de ión dipolar protegidos. Los colorantes de la invención, que incluyen colorantes y conjugados de colorantes químicamente reactivos, son útiles como sondas fluorescentes, particularmente en muestras biológicas.

Se sabe que los colorantes fluorescentes son particularmente útiles en aplicaciones biológicas en las que se requiere un reactivo de detección que sea altamente sensible. Los colorantes fluorescentes se usan para marcar tanto con un color visible como con fluorescencia a otros materiales. Los colorantes de la presente invención son derivados de fosfonato de colorantes basados en xanteno que son típicamente derivados de fluoresceína, rodamina o rodol:

Los colorantes de “fluoresceína” incluyen derivados de 3H-xanten-6-ol-3-ona que están sustituidos típicamente en la posición 9 por un grupo 2-carboxifenilo. Los colorantes de “rodamina” incluyen derivados de 6-amino-3H-xanten-3imina que están sustituidos típicamente en la posición 9 por un grupo 2-carboxifenilo. Los colorantes de “rodol” incluyen derivados de 6-amino-3H-xanten-3-ona que están sustituidos típicamente en la posición 9 por un grupo 2carboxifenilo. Las fluoresceínas, rodaminas y rodoles están sustituidos típicamente por un derivado capaz de formar un anillo de lactona o lactama de 5 o 6 miembros. Por ejemplo, en el caso de la fluoresceína, la forma espirolactona del colorante tiene la siguiente estructura:

Muchos colorantes fluorescentes comerciales tienen una naturaleza aromática policíclica y son hidrófobos. Esas moléculas son también propensas a minimizar la exposición a cualquier entorno hidrófilo mediante interacciones con superficies y residuos hidrófobos cercanos. Estas interacciones incluyen interacción colorante-colorante e interacciones colorante-biomolécula (p.ej. proteínas, lípidos, oligonucleótidos) . Las interacciones hidrófobas pueden causar un efecto inactivador sustancial para colorantes fluorescentes (véase por ejemplo Randolph, J.B.; Waggoner,

A.S. Nucleic Acids Res. 1997, 25 (14) , 2923-2929, y las referencias allí citadas) . Un método para vencer este problema es mejorar el carácter hidrófilo del colorante introduciendo, por ejemplo, un sustituyente sulfonato en la molécula del colorante (se describen colorantes de carbocianina sulfonados en la patente de EE.UU. 5.268.486, y se describen colorantes de xantenos sulfonados en la patente de EE.UU. 6.130.101) .

Johnson et al (1991) Analytical Biochemistr y 198, 228-237 describe sondas de membrana fluorescentes que incorporan fluoróforos de difluoruro de dipirrometenoboro. Monti et al (1992) Biochemica et Biophysica Acta. 1124, 80-87, describe la absorción y metabolismo de análogos de sulfatida fluorescentes en fibroblastos de piel cultivados. Xu et al (1996) Bioimaging, 4, 198-207, describe secciones transversales de excitación por multifotones de fluoróforos moleculares. Mattjus et al (1999) Analytical Biochemistr y 268, 297-304, describe un planteamiento de transferencia de energía de resonancia energética de fluorescencia para hacer un seguimiento de la transferencia de glicolípidos mediada por proteínas entre membranas vesiculares. La patente de EE.UU. Nº 3.809.694 describe fosfonatos de dihidrofenantridina. La patente de EE.UU. Nº 5.916.877 describe derivados fluorescentes de 1peptidilaminoalcanofosfonato, y su uso en la detección y estudio de la distribución de serina proteasas en células y

sistemas biológicos. La solicitud de patente internacional WO 03/023357 describe un método para preparar un agente biológico marcado con colorante fluorescente, comprendiendo el método poner en contacto el agente biológico no marcado con un derivado de lactona condensado con un colorante fluorescente. La solicitud de patente internacional WO 2004/101579 describe sensores fluorescentes de fosfonatos sustituidos y el uso de los mismos. Yang et al (2005) Chem. Eur. J. 11, 4191-4198, describe propiedades de absorción de dos fotones de derivados de 2, 6-bis (estiril) antraceno.

La presente invención describe colorantes, que incluyen colorantes de fluoresceína, rodol y rodamina, que están sustituidos por al menos un resto de fosfonato de ión dipolar protegido. Los colorantes sustituidos con fosfonato de la invención poseen considerables ventajas sobre sus análogos hidrófobos no sustituidos. Estando ionizado, el grupo fosfonato protegido lleva hidrofilicidad adicional a las moléculas de colorante, aumentando su solubilidad en disoluciones acuosas, de manera importante, el rendimiento cuántico de los nuevos colorantes no disminuye por la introducción de un resto fosfonato. En contraste con los colorantes sulfonados, los colorantes de la invención son compatibles con las condiciones de síntesis usadas en los sintetizadores comerciales de oligonucleótidos.

Breve compendio de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona un reactivo colorante fluorescente que tiene la fórmula:

en donde FI es un componente colorante fluorescente; Lf es un grupo enlazante que tiene un miembro unido seleccionado del grupo que consiste en un grupo funcional protegido o no protegido, un grupo reactivo, un resto enlazante polifuncional, un resto de fosforamidita y un soporte sólido; el subíndice m es un número entero de 0 a 1; Pz es un grupo fosfonato protegido que tiene la fórmula (a) o (b) :

en donde la línea ondulada indica la unión directa a un carbono sp2 de dicho componente colorante fluorescente; L es un grupo enlazante; cada uno de RA y RB se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C8) y un grupo protector lábil, el subíndice n es un número entero de 1 a 2; Rc es H, alquilo (C1-C8) , arilo, aril-alquilo (C1-C4) , un grupo protector lábil o un grupo enlazante alquileno que tiene un grupo hidroxi distal o hidroxi protegido; y una sal del mismo.

En otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para preparar reactivos colorantes fluorescentes de fosfonato, así como métodos para usar sondas (p.ej., sondas de oligonucleótidos) que tienen unidos colorantes fluorescentes de fosfonato como los proporcionados en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 ilustra las estructuras de clases seleccionadas de colorantes de benzoxanteno de la presente invención.

La Figura 2 ilustra las estructuras de clases seleccionadas de colorantes de benzofenoxazina de la presente invención.

La Figura 3 ilustra un cromatograma de HPLC de un MB-Q-oligonucleótido-XP (véase el Ejemplo 9) .

La Figura 4 ilustra la valoración de un ensayo de sonda 1, 2 MGB Eclipse para HSV en donde la sonda marcada con

FAM está multiplexada con una sonda marcada con XP (Ejemplo 13) .

Descripción detallada de la invención Abreviaturas y definiciones A menos que se indique otra cosa, los siguientes términos usados en la memoria descriptiva y reivindicaciones tienen los significados dados a continuación:

El término “alquilo” se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente lineal, ramificado o cíclico saturado, o una combinación de radicales hidrocarbonados monovalentes saturados cíclicos y lineales o ramificados que tienen el

número de átomos de carbono indicado en el prefijo. Por ejemplo, alquilo (C1-C8) pretende incluir metilo, etilo, npropilo, 2-propilo, terc-butilo, pentilo, ciclopentilo, ciclopropilmetilo y similares. Para cada una de las definiciones en la presente memoria (p.ej. alquilo, alquenilo, alcoxi, arilalcoxi) , cuando no está incluido un prefijo para indicar el número de átomos de carbono de la cadena principal en una porción alquilo, el radical o porción del mismo tendrá ocho o menos átomos de carbono en la cadena principal.

El término “alquileno” significa un radical hidrocarbonado divalente saturado lineal o un radical hidrocarbonado divalente saturado ramificado que tiene el número de átomos de carbono indicado en el prefijo. Por ejemplo, alquileno (C1-C6) pretende incluir metileno, etileno, propileno, 2-metilpropileno, pentileno, y similares.

El término “alquenilo” se refiere a un radical hidrocarbonado monovalente lineal o un radical hidrocarbonado monovalente ramificado que tiene el número de átomos de carbono indicado en el prefijo y que contiene al menos un doble enlace. Por ejemplo, alquenilo (C2-C6) pretende incluir etenilo, propenilo y similares.

El término “alquinilo” se refiere a un radical hidrocarbonado... [Seguir leyendo]

1. Un reactivo colorante fluorescente que tiene la fórmula:

en donde FI es un componente colorante fluorescente; Lf es un grupo enlazante que tiene un miembro unido seleccionado del grupo que consiste en un grupo funcional

protegido o no protegido, un grupo reactivo, un resto enlazante polifuncional, un resto de fosforamidita y un soporte sólido; el subíndice m es un número entero de 0 a 1; Pz es un grupo fosfonato de ión dipolar protegido que tiene la fórmula (a) o (b) :

en donde la línea ondulada indica la unión directa a un carbono sp2 de dicho componente colorante fluorescente; L es un grupo enlazante; cada uno de RA y RB se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C8) y un grupo protector lábil; Rc se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C8) , arilo, arilalquilo (C1-C4) , un grupo protector lábil o un grupo enlazante alquileno que tiene un grupo hidroxi distal o hidroxi protegido;

el subíndice n es un número entero de 1 a 2;

y una sal del mismo.

2. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, en donde dicho componente colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en cumarinas, benzocumarinas, xantenos, benzo[a]xantenos, benzo[b]xantenos, benzo[c]xantenos, cianinas, acridinas, difluoruros de dipirrometenoboro, fenoxazinas, benzo[a]fenoxazinas, benzo[b]fenoxazinas y benzo[c]fenoxazinas.

3. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, en donde dicho componente colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en colorantes de cumarina, colorantes de resorufina, colorantes de difluoruro de dipirrometenoboro, colorantes de rutenio bipiridilo, colorantes de transferencia de energía, colorantes de naranja de tiazol y colorantes de N-aril-1, 8-naftalimida.

4. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, en donde L es alquileno C2-C8.

5. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, en donde PZ tiene la fórmula (a) , L es un grupo enlazante alquileno y al menos uno de RA y RB es un grupo protector lábil.

6. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, en donde m es 0 y n es 1.

7. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, en donde m es 0 y n es 2.

8. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, en donde m es 1 y n es 1.

9. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 2, en donde dicho componente colorante fluorescente es un colorante de xanteno o benzoxanteno seleccionado del grupo que consiste en colorantes de fluoresceína, colorantes de rodamina y colorantes de rodol.

10. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 9, que tiene la fórmula I:

en donde A1 representa O, N-Z o N+ (Z) 2, en el que cada Z es H o alquilo (C1-C8) , o está opcionalmente combinado con R2 o R4 para formar un anillo de 5 o 6 miembros o está combinado con cada uno de R2 y R4 para formar dos anillos de 6 5 miembros condensados;

A2 representa OR o N (Z) 2, en el que cada Z es H o alquilo (C1-C8) , o está opcionalmente combinado con R1 o R1’’ para formar un anillo de 5 o 6 miembros o está combinado con cada uno de R1 y R1’’ para formar dos anillos de 6 miembros condensados; y R se selecciona de H, alquilo (C1-C8) , arilo, aril-alquilo (C1-C4) y Lf;

R1’, R1’’, R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente cada uno de H, halógeno, ciano, CF3, alquilo (C1-C8) ,

alquil (C1-C8) tio, alcoxi (C1-C8) , arilo, heteroarilo, Lf y Pz; u opcionalmente dos miembros adyacentes de R1’, R1’’, R1, R2 y R3 están combinados para formar un anillo condensado de cinco o seis miembros que es aromático, no aromático o heteroaromático y que está opcionalmente sustituido con Pz;

en donde las porciones alquilo de cualquiera de R1’, R1’’ y R1 a R4 están opcionalmente sustituidas con halógeno, carboxi, sulfo, amino, mono-o dialquilamino, alcoxi, ciano, haloacetilo o hidroxi, y las porciones alquilo de los sustituyentes tienen de 1 a 6 átomos de carbono; y las porciones arilo o heteroarilo de cualquiera de R1’, R1’’ y R1 a R4 están opcionalmente sustituidas con de uno a cuatro sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, ciano, carboxi, sulfo, hidroxi, amino, mono-o dialquil (C1-C6) amino, alquilo (C1-C6) , alquil (C1-C6) tio, alcoxi (C1-C6) , Lf y Pz;

R0 es halógeno, ciano, CF3, alquilo (C1-C8) , alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , heteroarilo sustituido o no sustituido o 20 arilo que tiene la fórmula:

en donde X1, X2, X3, X4 y X5 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste en H, halógeno, ciano, CF3, alquilo (C1-C8) , alcoxi (C1-C8) , alquil (C1-C8) tio, alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , arilo, heteroarilo, SO3H, PO3H2, CO2H, Lf y Pz, y opcionalmente, cualquiera de dos X1 a X5 adyacentes están combinados para formar un anillo aromático o heteroaromático; y

están presentes de 0 a 1 grupos Lf y de 1 a 4 grupos Pz en los compuestos de fórmula I.

11. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 9, que tiene la fórmula I (a) o I (b) :

en donde cada A es hidroxi, amino, hidroxi protegido, o amino protegido;

R1’, R1’’, R1, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente cada uno de H, halógeno, ciano, arilo, heteroarilo, CF3, alquilo (C1-C8) , alquil (C1-C8) tio, alcoxi (C1-C8) , Lf y Pz, u opcionalmente dos miembros adyacentes de R1’, R1’’, R2 y R3 están combinados para formar un anillo condensado de cinco o seis miembros que es aromático, no aromático o heteroaromático y que está opcionalmente sustituido con Pz, en donde las porciones alquilo de cualquiera de R1’, R1’’ y R1 a R4 están opcionalmente sustituidas con halógeno, carboxi, sulfo, amino, mono-o dialquilamino, alcoxi, ciano, haloacetilo o hidroxi, y las porciones alquilo de los sustituyentes tienen de 1 a 6 átomos de carbono y las porciones arilo o heteroarilo de cualquiera de R1’, R1’’ y R1 a R4 están opcionalmente sustituidas con de uno a cuatro sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, ciano, carboxi, sulfo, hidroxi, amino, mono- o dialquil (C1-C6) amino, alquilo (C1-C6) , alquil (C1-C6) tio, alcoxi (C1-C6) , Lf y Pz;

X1, X2, X3 y X4 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste en H, halógeno, ciano, CF3, alquilo (C1-C8) , alcoxi (C1-C8) , alquil (C1-C8) tio, alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , arilo, heteroarilo, SO3H, PO3H2, CO2H, Lf y Pz, y opcionalmente, cualesquiera dos X1 a X4 adyacentes están combinados para formar un anillo aromático o heteroaromático que está opcionalmente sustituido además con de uno a cuatro sustituyentes seleccionados de halógeno, ciano, carboxi, sulfo, hidroxi, amino, mono-o dialquil (C1-C6) amino, alquilo (C1-C6) , alquil (C1-C6) tio, alcoxi (C1-C6) , Lf y Pz; y

están presentes de 0 a 1 grupos Lf y de 1 a 2 grupos Pz en los compuestos de fórmulas (Ia) y (Ib) .

12. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

en donde A1 representa O o N-Z, en el que Z es H o alquilo (C1-C8) , o está opcionalmente combinado con R2 o R4 para formar un anillo de 5 o 6 miembros o está combinado con cada uno de R2 y R4 para formar dos anillos de 6 miembros condensados;

A2 representa OR o N (Z) 2, en el que cada Z es H o alquilo (C1-C8) , o está opcionalmente combinado con R1 o R1’’ para formar un anillo de 5 o 6 miembros o está combinado con cada uno de R1 y R1’’ para formar dos anillos de 6 miembros condensados, y R se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C8) , arilo, aril-alquilo (C1-C4) y Lf;

R1’, R1’’, R’, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente cada uno de H, halógeno, ciano, CF3, alquilo (C1-C8) , alquil (C1-C8) tio, alcoxi (C1-C8) , arilo, heteroarilo, Lf y Pz;

en donde las porciones alquilo de cualquiera de R1’, R1’’ y R1 a R4 están opcionalmente sustituidas con halógeno, carboxi, sulfo, amino, mono-o dialquilamino, alcoxi, ciano, haloacetilo o hidroxi, y las porciones alquilo de los sustituyentes tienen de 1 a 6 átomos de carbono; y las porciones arilo o heteroarilo de cualquiera de R1’, R1’’ y R1 a R4 están opcionalmente sustituidas con uno a cuatro sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, ciano, carboxi, sulfo, hidroxi, amino, mono-o dialquil (C1-C6) amino, alquilo (C1-C6) , alquil (C1-C6) tio, alcoxi (C1-C6) , Lf y Pz; y

están presentes de 0 a 1 grupos Lf y de 1 a 2 grupos Pz en los compuestos de fórmula (IX) .

13. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

en donde R’, R1’, R1’’, R1’’’, R2 y R3 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste en H, halógeno, ciano, CF3, alquilo (C1-C8) , alquil (C1-C8) tio, alcoxi (C1-C8) , arilo, heteroarilo, Lf y Pz;

en donde las porciones alquilo de cualquiera de R1’, R1’’, R1’’’ y R1 a R3 están opcionalmente sustituidas con halógeno, carboxi, sulfo, amino, mono-o dialquilamino, alcoxi, ciano, haloacetilo o hidroxi, y las porciones alquilo de los sustituyentes tienen de 1 a 6 átomos de carbono; y las porciones arilo y heteroarilo de cualquiera de R1’, R1’’, R1’’’ y R1 a R3 están opcionalmente sustituidas con de uno a cuatro sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en halógeno, ciano, carboxi, sulfo, hidroxi, amino, mono- o dialquil (C1-C6) amino, alquilo (C1-C6) , alquil (C1-C6) tio, alcoxi (C1-C6) , Lf y Pz;

A1 representa O o N-Z, en el que Z es H o alquilo (C1-C8) ; y

están presentes de 0 a 1 grupos Lf y de 1 a 2 grupos Pz en los compuestos de fórmula (V) .

14. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

en donde cada uno de Q1 y Q2 se seleccionan independientemente de O, S, N y CRaRb, o -C (=CH2) -, en donde Ra y Rb se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, metilo, etilo y Lf;

los anillos Ax y Ay representan independientemente cada uno anillos de arilo o heteroarilo sustituidos o no sustituidos condensados;

Q es un sistema enlazante conjugado, opcionalmente sustituido con Lf; y

RG y RG’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, heteroalquilo, ácido alquilenosulfónico, ácido alquilenocarboxílico, Lf y Pz; en donde uno o dos grupos Pz y cero a uno grupos Lf están presentes en dicho reactivo.

15. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 14, en donde Q es un sistema enlazante conjugado seleccionado del grupo que consiste en:

en donde R se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo inferior y Lf.

16. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, que tiene la fórmula:

en donde X1, X2, X3 y X4 se seleccionan independientemente cada uno del grupo que consiste en H, halógeno, ciano, CF3, alquilo (C1-C8) , alcoxi (C1-C8) , alquil (C1-C8) tio, alquenilo (C2-C8) , alquinilo (C2-C8) , SO3H, PO3H2, CO2H, Lf y Pz; y opcionalmente, cualesquiera dos X1 a X4 adyacentes están combinados para formar un anillo de cinco o seis miembros no aromático, aromático o heteroaromático que está opcionalmente sustituido además con de uno a cuatro sustituyentes seleccionados de halógeno, ciano, carboxi, sulfo, hidroxi, amino, mono-o dialquil (C1-C6) amino,

alquilo (C1-C6) , alquil (C1-C6) tio, alcoxi (C1-C6) , Lf y Pz; y en donde están presentes de 0 a 1 grupos Lf y de 1 a 2 grupos Pz.

17. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 1, seleccionado de los compuestos 8, 9, 10, 11, 17, 18, 19, 25, 26, 27, 37, 38, 39, 64, 65 y 66:

18. Un reactivo colorante fluorescente que tiene la fórmula:

FI-P1 en donde FI es un componente colorante fluorescente; y P1 es un grupo fosfonato funcionalizado que tiene la fórmula:

en donde la línea ondulada indica la unión directa a un carbono sp2 de dicho componente colorante fluorescente; L1 es un grupo enlazante;

R es un miembro seleccionado del grupo que consiste en H, alquilo C1-C8, arilo, aril-alquilo (C1-C4) , -La-Na, y -La-NRARB;

en donde La es un grupo enlazante alquileno, Na es un grupo iónico de amonio, y cada uno de RA y RB se selecciona independientemente del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C8) y un grupo protector lábil; y

Pa es un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en un resto fosforamidita, un grupo enlazante mono-, di- o trifuncional que tiene al menos un grupo funcional terminal o grupo funcional protegido, un soporte sólido y un grupo reactivo;

y una sal del mismo.

19. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 18, en donde dicho componente colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en cumarinas, benzocumarinas, xantenos, benzo[a]xantenos, benzo[b]xantenos, benzo[c]xantenos, cianinas, acridinas, difluoruros de dipirrometenoboro, fenoxazinas, benzo[a]fenoxazinas, benzo[b]fenoxazinas y benzo[c]fenoxazinas.

20. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 18, en donde dicho componente colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste en colorantes de cumarina, colorantes de resorufina, colorantes de difluoruro de dipirrometenoboro, colorantes de rutenio bipiridilo, colorantes de transferencia de energía, colorantes de naranja de tiazol y colorantes de N-aril-1, 8-naftalimida.

21. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 18, en donde dicho componente colorante fluorescente es un colorante de xanteno o benzoxanteno seleccionado del grupo que consiste en colorantes de fluoresceína, colorantes de rodamina y colorantes de rodol.

22. Un reactivo colorante fluorescente de la reivindicación 21, seleccionado del grupo que consiste en los compuestos 44, 45 y 46 mostrados en el Esquema de Reacción 8; los compuestos 51, 52 y 53 mostrados en el Esquema de Reacción 9; y los compuestos 56, 57 y 58 mostrados en el Esquema de Reacción 10.

23. Un método para preparar un derivado colorante fluorescente de fosfonato, comprendiendo dicho método poner en contacto un sustrato colorante halo-fluorescente que tiene al menos un átomo de halógeno unido a un átomo de carbono de un anillo aromático, con un reactivo de fosfito bajo condiciones suficientes para retirar dicho átomo de halógeno y unir covalentemente un grupo fosfonato a dicho átomo de carbono del anillo aromático para formar dicho derivado colorante fluorescente de fosfonato.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho sustrato colorante halo-fluorescente se selecciona del grupo que consiste en una halocumarina, una halobenzocumarina, una halocianina, un halodifluoruro de dipirrometenoboro, una halofenoxazina, una halobenzo[a]fenoxazina, una halobenzo[b]fenoxazina y una halobenzo[c]fenoxazina.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho reactivo de fosfito es un miembro seleccionado del grupo que consiste en fosfito de difenilo, fosfito de dietilo y fosfito de bis (4- (2, 2, 2-trifluoroacetamido) butilo) .

26. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicho reactivo de fosfito es fosfito de bis (4- (2, 2, 235 trifluoroacetamido) butilo) o el compuesto 41 mostrado en el Esquema de Reacción 7.

27. Un derivado colorante fluorescente de fosfonato preparado según el método de la reivindicación 26.

28. Una sonda de oligonucleótido que tiene un reactivo colorante fluorescente unido, en donde el reactivo colorante fluorescente tiene la fórmula:

en donde FI es un componente colorante fluorescente;

Lf es un grupo enlazante que tiene un miembro unido seleccionado del grupo que consiste en un grupo funcional protegido o no protegido, un grupo reactivo, un resto enlazante polifuncional, un resto de fosforamidita y un soporte sólido;

Pz es un grupo fosfonato de ión dipolar protegido que tiene la fórmula (a) o un grupo fosfonato protegido que tiene la fórmula (b) o (c) :

en donde la línea ondulada indica la unión directa a un carbono sp2 de dicho componente colorante fluorescente; L es un grupo enlazante; Na es un grupo iónico de amonio; cada uno de RA y RB se selecciona independientemente del grupo que consiste en H y un grupo protector lábil; Rc se selecciona del grupo que consiste en H, alquilo (C1-C8) , arilo, aril-alquilo (C1-C4) , un grupo protector lábil o un grupo enlazante alquileno que tiene un grupo hidroxi distal o hidroxi protegido;

el subíndice n es un número entero de 1 a 2;

m es 1;

y una sal del mismo; y

en donde la unión del reactivo colorante fluorescente al oligonucleótido es mediante un grupo funcional presente en Lf

.

29. Una sonda de oligonucleótido según la reivindicación 28, que tiene un inactivador unido.

30. Una sonda de oligonucleótido según la reivindicación 29, que tiene un agente ligante de surco menor unido.

31. Una sonda de oligonucleótido que tiene un reactivo colorante fluorescente unido de la reivindicación 18, en donde la unión del reactivo colorante fluorescente al oligonucleótido es mediante un grupo funcional presente en Pa.

32. Una sonda de oligonucleótido según la reivindicación 31, que tiene un inactivador unido.

33. Una sonda de oligonucleótido según la reivindicación 32, que tiene un agente ligante de surco menor unido.

34. Un compuesto que tiene la fórmula:

en donde L es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un grupo enlazante de alquileno (C1-C20) y heteroalquileno (C1-C20) ;

X es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un grupo funcional y un grupo funcional protegido en donde dicho grupo funcional es hidroxidiol, carboxi, formilo, carbonilo, tio, aminoxi, azida, carbazoílo, hidrazina o amino que tiene la fórmula NRARB;

R es un miembro seleccionado del grupo que consiste en un grupo protector lábil y -L-NRARB;

y cada uno RA y RB se selecciona independientemente de H, alquilo (C1-C8) y un grupo protector lábil y al menos uno de RA y RB es distinto de H o alquilo (C1-C8) .

35. Un compuesto de la reivindicación 34, en donde R es grupo butilo terciario.

36. Un compuesto de la reivindicación 34, en donde R es -L-NRARB y X es -NRARB.

37. Un compuesto de la reivindicación 36, en donde cada RA es H y cada RB es un grupo protector seleccionado del grupo que consiste en -C (O) CF3, C (O) Ot-Bu, FMOC, ftalimida, monometoxitritilo y -C (O) O-bencilo.

38. Un compuesto de la reivindicación 34, en donde X es -O-dimetoxitritilo.

39. Un compuesto de la reivindicación 34, seleccionado del grupo que consiste en