Una colección combinatoria de proteínas que comprende una pluralidad de especies proteicas,

compren- diendo cada especie de proteína una cadena A de una proteína tóxica ABx que comprende un bucle sensible a proteasa en el cual se ha introducido un inserto, en donde el inserto es un polipéptido de secuencia de aminoácidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoácidos, y en donde cuando la pluralidad de especies proteicas se ponen en contacto con al menos una diana/receptor candidato, una especie proteica que comprende un inserto se une a una diana/un receptor específico, identificando de este modo el inserto como un ligando de la diana/el receptor específicos.

Colección de mutantes de toxinas y metodos para su uso.

Antecedentes de la invención

Esta solicitud se refiere a colecciones de mutantes de toxinas y a metodos para usar las mismas en el desarrollo de 5 agentes terapeuticos dirigidos contra tipos celulares específicos.

Las toxinas vegetales y bacterianas tienen una organización estructural con dos o mas dominios o subunidades polipeptfdicas responsables de distintas funciones, denominadas A y B. Las toxinas pueden denominarse toxinas ABx, en donde x representa el numero de subunidades B identicas u hom6logas en la toxina. Esta familia de toxinas relacionadas con el armazón, incluye ejemplos tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, las enterotoxinas termo

sensibles de E. coli, la toxina del c6lera, la toxina difterica, la toxina pertussis, la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (0lsnes, S. y Sandvik, K. (1988) en Immunotoxins pp. 39-73, Kluwer Academic, Boston; Sandvik, K., Oubinina, E., Garred, 0. y col. (1992) Biochem. Soc. Trans. 20:724) así como toxinas vegetales tales como ricina y abrina. En algunos casos las toxinas son heter6meras, porque las cadenas B son en realidad entidades separadas que se conectan con la cadena t6xica A mediante un enlace no covalente. En otros casos, la toxina es monómera, puesto

que la cadena B forma parte de la misma protefna cuando la toxina se produce en la naturaleza.

Basandose en su capacidad para bloquear la sfntesis de protefnas, protefnas tales como las toxinas Shiga y de tipo Shiga, así como la ricina, abrina, gelonina, crotina, protefna antivfrica de fitolaca americana, saporina, momordina, modecina, sarcina, toxina difterica y exotoxina A, se han denominado protefnas inactivadoras de ribosomas (RIP, del ingles "ribosome-inactivating proteins") . La potencia de las RIPs es extremadamente alta, habiendose demostrado

que una molecula de la cadena A de la toxina difterica (Yamaizumi y col. (1978) Cell 15:245-250) o de la cadena A de la ricina (Eiklid y col. (1980) Exp. Cell Res. 126:321-326) es suficiente para destruir una celula eucariótica.

El documento de Publicación de Patente Internacional nQ W099/40185 describe colecciones de toxinas mutantes en las que se introducen las mutaciones en el dominio de unión para alterar el tipo de celulas al que se suministran las especies t6xicas. Las nuevas protefnas se obtienen mutando una subunidad de unión de la protefna citot6xica hete

r6mera de tipo silvestre, para crear una colección de clones de microorganismos que producen protefnas mutantes que, a continuación, se someten a un escrutinio para estudiar su capacidad para unirse y destruir específicamente un tipo de celula diana.

El documento de Patente de los EE.UU. nQ 5.552.144 describe una variante de la toxina II de tipo Shigella en la que se introduce una mutación en la cadena A en la posición 167, para cambiar el aminoacido en esta posición por uno

con diferente carga. Esto dio como resultado una toxina con menor actividad enzimatica asociada con la toxicidad.

El documento de Patente de los EE.UU. nQ 6.593.132 describe protefnas t6xicas recombinantes que son t6xicas específicamente para celulas enfermas, pero que no dependen para su especificidad de la acción de un componente específico de la unión a la celula. Las protefnas recombinantes de la patente '132 tienen una cadena A de una toxina de tipo ricina enlazada a una cadena B mediante una secuencia enlazadora sintetica que puede ser escindida espe

cíficamente por una proteasa localizada en las celulas o tejidos afectados por una enfermedad específica, para liberar la cadena t6xica A, inhibiendo o destruyendo así selectivamente las celulas o los tejidos enfermos.

El documento de Patente de los EE.UU. nQ 6.649.742 describe protefnas inactivadoras de ribosomas (RIPs) de Tipo I y analogos de RIPs que tienen una cistefna disponible para formar un puente disulfuro con moleculas diana. Las RIPs y los analogos de RIPs se usan como componentes de agentes terapeuticos citot6xicos para eliminar selecti

vamente cualquier tipo celular al que se dirija el componente RIP, mediante la capacidad de unión específica del segundo componente del agente.

Sumario de la invención

La presente proporciona colecciones combinatorias de protefnas que comprenden una pluralidad de especies proteicas, en las que cada especie proteica comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que se ha

45 introducido un inserto. Segun la invención, el inserto es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo, de 3 a 200 residuos de aminoacido; y el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El resultado de la introducción del inserto crea un dominio de unión artificial dentro de la cadena A, de tal forma que la cadena A desarrolla una especificidad t6xica que es independiente y diferente de la especificidad normal asociada con los dominios de unión de las

50 cadenas B. El escrutinio de la colección permite la selección e identificación de toxinas mutantes que son específicas de tipos celulares diferentes, incluyendo los tipos de celulas cancerosas. En una realización de la invención, la colección combinatoria comprende especies proteicas que se forman introduciendo el inserto en la cadena A de una toxina I de tipo Shiga, por ejemplo, en la región entre los aminoacidos 242 y 261, tal y como se define con referencia a SEQ IO N0: 1.

55 La invención proporciona tambien una colección combinatoria de expresión que comprende una pluralidad de espe

cies de sistemas de expresión, expresando cada especie una especie proteica que comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que se ha introducido el inserto tal y como se ha descrito anteriormente. La expresión de protefnas a partir de la colección combinatoria de expresión da como resultado la formación de una colección combinatoria de protefnas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición para tratar melanomas y metodos para usar tal composición. La composición comprende una especie proteica que comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera, en la que un polipeptido que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo de 3 a 200 residuos de aminoacido, se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El inserto se selecciona de tal forma que la especie proteica tenga actividad t6xica frente a celulas de melanoma. La especie proteica se usa en el tratamiento de melanomas, administrandola a un paciente diagnosticado con melanoma en una cantidad suficiente para producir la reducción del numero de celulas de melanoma vivas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición para tratar otros tipos de cancer. La composición comprende una especie proteica que comprende una cadena A de una protefna t6xica heter6mera en la que un polipeptido que tiene una longitud de 2 o mas residuos de aminoacido, por ejemplo de 3 a 200 residuos de aminoacido, se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A. El inserto se selecciona de tal forma que la especie proteica tenga actividad t6xica frente a las celulas cancerosas. En una realización específica, el inserto se selecciona para que se una a receptores MUC-1. La especie proteica se usa en el tratamiento del melanoma, administrandola a un paciente diagnosticado con melanoma en una cantidad suficiente para que se produzca una reducción del numero de celulas de melanoma vivas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un metodo para identificar ligandos que se unen a dianas/receptores específicos, tales como marcadores tumorales que se sabe que existen en las celulas cancerosas. En este metodo, la toxina de la colección combinatoria actua como informadora, y una colección combinatoria de protefnas segun la invención, se somete a escrutinio en busca de celulas conocidas por poseer la diana/el receptor. Las protefnas que presentan toxicidad frente a las celulas, se evaluan para determinar la secuencia de la región insertada. Los peptidos con esta secuencia pueden usarse seguidamente, en combinación con una toxina u otras moleculas, para dirigir compuestos a celulas que poseen la diana/el receptor.

En aun otro aspecto adicional de la invención,... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIONES

1. Una colección combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies proteicas, comprendiendo cada especie de protefna una cadena A de una protefna t6xica ABx que comprende un bucle sensible a proteasa en el cual se ha introducido un inserto, en donde el inserto es un polipeptido de secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoacidos, y en donde cuando la pluralidad de especies proteicas se ponen en contacto con al menos una diana/receptor candidato, una especie proteica que comprende un inserto se une a una diana/un receptor específico, identificando de este modo el inserto como un ligando de la diana/el receptor específicos.

2. Una colección combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies proteicas, comprendiendo cada especie de protefna una cadena A de una protefna t6xica ABx que comprende un bucle sensible a proteasa en el cual se ha introducido un inserto, en donde el inserto es un polipeptido de secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoacidos, y en donde cuando la pluralidad de las especies proteicas se ponen en contacto con al menos una diana/un receptor candidato, localizado en la superficie de una celula una especie proteica que comprende un inserto, se une a una diana/un receptor específico y es t6xico para la celula, identificando de este modo un inserto que comprende un ligando de la diana/el receptor.

3. La colección combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la diana/el receptor se localiza en la superficie de una celula.

4. La colección combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la colección comprende al menos 100 especies proteicas.

5. La colección combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las especies proteicas se forman introduciendo el inserto en una cadena A de una toxina I de tipo Shiga, que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ IO N0: 1.

6. La colección combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la especie proteica se forma introduciendo el inserto entre los aminoacidos 242 y 261, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.

7. La colección combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la especie proteica se forma introduciendo el inserto entre los aminoacidos 245 y 246, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.

8. La colección combinatoria de protefnas de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la especie proteica se forma introduciendo el inserto antes o despues de los aminoacidos 1-239 de la cadena A de la toxina I de tipo Shiga, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.

9. La colección combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el inserto tiene una longitud de 7 aminoacidos.

10. Una colección combinatoria de protefnas que comprende una pluralidad de especies de sistemas de expresión, expresando cada especie una especie proteica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. Una protefna mutante que comprende una cadena A de una protefna t6xica ABx en la que se ha introducido un inserto, en donde

(a) el inserto es un polipeptido con una secuencia de aminoacidos variable que tiene una longitud de 2-7 residuos de aminoacidos; y

(b) el inserto se introduce en el bucle sensible a proteasa de la secuencia de la cadena A.

12. La protefna mutante de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la cadena A de la protefna t6xica ABx es una cadena A de la toxina I de tipo Shiga.

13. La protefna mutante de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el inserto se introduce entre los aminoacidos 242 y 261, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.

14. La protefna mutante de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el inserto se introduce entre los aminoacidos 245 y 246, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.

15. La protefna mutante de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el inserto comprende la secuencia IYSNKLM (SEQ IO N0: 6) .

16. La protefna mutante de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el inserto comprende la secuencia AA-FAOLI (SEQ IO N0: 7) .

17. La protefna mutante de acuerdo con la reivindicación 12, en donde el inserto se introduce antes o despues de los aminoacidos 1-239 de la cadena A de la toxina I de tipo Shiga, tal y como se define haciendo referencia a SEQ IO N0: 1.

18. La protefna mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-17, en donde el inserto tiene una longitud de 7 aminoacidos.

19. Un metodo para identificar un ligando que se une a una diana/un receptor específico, que comprende las etapas de:

(a) exponer las celulas que se sabe que tienen la diana/el receptor a miembros de una colección combinatoria de protefnas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(b) seleccionar miembros de la colección de protefnas que se observan que son t6xicos para las celulas.

20. El metodo de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende adicionalmente la etapa de evaluar los miembros seleccionados de la colección proteica para determinar la secuencia de la región insertada, identificandose de ese modo un peptido de la secuencia de la región insertada como posible ligando de una diana/un receptor sobre la celula.

21. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-20, que comprende adicionalmente la etapa de someter a ensayo adicionalmente los miembros seleccionados de la colección proteica para confirmar que son ligandos de la diana/el receptor específico.

22. Un metodo para aislar una toxina específica de una diana/un receptor que comprende las etapas de:

(a) exponer la diana/el receptor a una colección combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9;y

(b) aislar al menos una especie proteica de la colección de protefnas capturada por la unión a la diana/el receptor.

23. El metodo de acuerdo con la reivindicación 22, que comprende adicionalmente la etapa de escrutar la protefna aislada frente a celulas que expresan la diana/el receptor para confirmar su toxicidad para celulas que expresan la diana/el receptor.

24. El metodo de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la diana/el receptor es una diana/el receptor purificado y se inmoviliza sobre un soporte sólido.

25. El metodo de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la diana/el receptor esta en la superficie de las celulas.

26. El metodo de acuerdo con la reivindicación 25, en donde las celulas se inmovilizan sobre un soporte sólido.

27. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 26, en donde la toxina sirve como informadora y la muerte de las celulas es indicativa de la unión al receptor.

28. Un metodo para identificar una toxina para una celula que expresa una diana/un receptor específico, que comprende las etapas de:

(a) exponer las celulas que se sabe que tienen la diana/el receptor a miembros de una colección combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(b) seleccionar miembros de la colección de protefnas que se observan que son t6xicos para las celulas,

en donde los miembros de la colección proteica que se observan que son t6xicos para las celulas, son toxinas para las celulas que expresan la diana/el receptor específico.

29. El metodo de acuerdo con la reivindicación 28, que comprende adicionalmente la etapa deidentificar un ligando que se une a una diana/un receptor específico, que comprende las etapas de:

(a) exponer las celulas que se sabe que tienen la diana/el receptor a miembros de una colección combinatoria de protefnas de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(b) seleccionar los miembros de la colección de protefnas que se observan que son t6xicos para las celulas,

en donde los miembros de la colección proteica que se observan que son t6xicos para las celulas, son ligandos que se unen a la diana/el receptor específico.

30. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 29, que comprende adicionalmente una etapa o etapas de mutación de un inserto para incrementar adicionalmente la toxicidad de la especie proteica en

comparación con la especie proteica que comprende el inserto original.

31. Un metodo para incrementar la toxicidad de una especie proteica de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende las etapas de:

(a) mutar un inserto conocido que posee toxicidad para las celulas que expresan una diana/un receptor específico; y

(b) comparar la toxicidad de la especie proteica que comprende el inserto mutado con la especie proteica que comprende el inserto original.

32. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 31, que comprende adicionalmente una etapa de evaluación de los miembros seleccionados de la colección proteica para determinar la secuencia de la región insertada.

33. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicacione.

2. 32, que comprende adicionalmente una etapa de someter a ensayo adicionalmente los miembros seleccionados de la colección proteica para confirmar que son t6xicos para una celula que expresa una diana/un receptor específico.

34. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 19-21, 23 .

2. 33, en donde las celulas son celulas cancerosas.

35. El metodo de acuerdo con la reivindicación 34, en donde las celulas cancerosas se seleccionan entre el grupo consistente en celulas de melanoma, celulas de cancer de cuello uterino o celulas de cancer cerebral.

36. El metodo de acuerdo con la reivindicación 35, en donde las celulas cancerosas son celulas de melanoma.

37. El metodo de acuerdo con la reivindicación 35, en donde las celulas cancerosas son celulas de cancer de cuello uterino.

38. El metodo de acuerdo con la reivindicación 35, en donde las celulas cancerosas son celulas de cancer cerebral.