Clados de virus adeno-asociados (AAV), secuencias, vectores que los contienen, y usos de los mismos.
Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una cápside de AAV de serotipo 9,
en el que la cápside de AAV9 es al menos un 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos 203 a 736 de SEQ ID Núm. 123, y en el que el AAV comprende además un minigén que tiene repeticiones terminales de AAV invertidas y un gen heterólogo enlazado operativamente a secuencias regulatorias que dirigen su expresión en una célula anfitrión.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2004/028817.
Solicitante: THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 3160 CHESTNUT STREET, SUITE 200 PHILADELPHIA, PA 19104 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.
Inventor/es: GAO, GUANGPING, WILSON, JAMES M., ALVIRA,MAURICIO R, VANDENBERGHE,LUC H.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K48/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen material genético que se introduce en las células del cuerpo vivo para tratar enfermedades genéticas; Terapia génica.
- C07K14/015 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Parvoviridae, p. ej. virus de la panleucopenia felina, parvovirus humano.
- C12N15/864 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores parvovirales.
PDF original: ES-2411479_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Clados de virus adeno-asociados (AAV) , secuencias, vectores que los contienen, y usos de los mismos.
Declaracion relacionada con la investigacion o el desarrollo patrocinados por el gobierno federal
Esta solicitud contiene un trabajo soportado por subvenciones N100K P30 0K47757 y HLB1 P01 HL59407 del 1nstituto Nacional de Salud (N1H) . El gobierno de U.S. puede tener ciertos derechos en la presente invención.
Antecedentes de la invencion El virus adeno-asociado (AAV) , un miembro de la familia de los Parvovirus, es un virus pequeno icosaedrico, sin envoltura, con genomas de A0N lineales de cadena recta de 4, 7 kilobases (kb) a 6 kb. El AAV se asigna al genero Oependovirus, puesto que el virus fue descubierto como un contaminante en poblaciones purificadas de adenovirus. El ciclo de vida del AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, tras la infección, son integrados especificamente en el sitio en cromosomas anfitrión, y una fase infecciosa en la que, a continuación de la infección ya sea por adenovirus o ya sea por virus de herpes simplex, los genomas integrados son posteriormente rescatados, replicados y empaquetados en virus infecciosos. Las propiedades de no-patogenicidad, la amplia gama de infectividad del anfitrión, incluyendo las celulas que no se dividen, y la integración cromos6mica potencial especifica del sitio, hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para transferencia de gen.
Los recientes estudios sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehiculo preferido para el suministro de genes. Hasta la fecha, han existido varios AAVs diferentes bien caracterizados, aislados a partir de humanos o de primates no humanos (NHP) .
Se ha encontrado que los AAVs de diferentes serotipos presentan diferentes eficacias de transfección, y presentan tambien tropismo para diferentes celulas o tejidos. Sin embargo, la relación entre estos diferentes serotipos no ha sido explorada con anterioridad.
Lo que resulta deseable son construcciones basadas en AAV para el suministro de moleculas heterogeneas.
Sumario de la invencion La presente invención incluye "superfamilias" o "Clados" de AAV de secuencias relacionadas filogeneticamente. Estos Clados de AAV proporcionan una fuente de secuencias de AAV utiles para objetivar y/o suministrar moleculas a celulas o tejidos objetivo deseados.
En un aspecto, la invención proporciona virus adeno-asociados (AAV) que comprenden una capside de AAV de serotipo 9 en el que la capside de AAV9 es al menos un 95% identica a la secuencia de aminoacidos 203 a 736 de SEQ 10 Num. 123, y en el que el AAV comprende ademas un minigen que tiene repeticiones terminales invertidas de AAV y un gen heter6logo enlazado operativamente a secuencias regulatorias que implica directamente su expresión en la celula anfitrión.
La invención proporciona tambien una proteina de capside aislada que comprende un virus adeno-asociado de proteina de capside de serotipo 9 (AAV9) elegido en el grupo consistente en: proteina de capside vp1, aminoacidos (aa) 1 a 736, SEQ 10 Num. 123; proteina de capside vp2, aa 138 a 736, SEQ 10 Num. 123; y proteina de capside vp3, aa 203 a 736, SEQ 10 Num. 123, asi como virus adeno-asociados (AAV) recombinantes que comprenden tales proteinas de capside.
Adicionalmente, la invención se extiende a moleculas de acido de nucleico que codifican tales proteinas de capside, incluyendo nt 1 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 (vp1) , nt 411 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 (vp2) , y nt 609 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 (vp3) . Tales moleculas de acido nucleico pueden comprender adicionalmente una secuencia de AAV que codifica una proteina rep funcional de AAV.
Segun otro aspecto, la invención proporciona un metodo de generación de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una capside de AAV, que comprende las etapas de cultivar una celula anfitrión que contiene: (a) moleculas que codifican una proteina de capside de AAV; (b) un gen rep funcional; (c) un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas de AAV (1TRs) y un transgen; y (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigen en la proteina de capside de AAV, en el que dicha celula anfitrión comprende una molecula de acido nucleico conforme a la invención.
Los vectores construidos con este huAAV9 han mostrado eficacias de transferencia de gen similares al AAV8 en el higado, superiores al AAV1 en el musculo, y 200 veces mas altas que el AAV5 en el pulmón. Ademas, este novedoso serotipo de AAV humano comparte menos de un 85% de identidad de secuencia con los AAV1 a AAV8 descritos con anterioridad, y no es susceptible de neutralización cruzada por parte de cualquiera de estos AAVs.
La presente invención proporciona tambien composiciones que contienen estas secuencias, y hace uso de las mismas. Ventajosamente, estas composiciones son particularmente adecuadas para su uso en composiciones que requieren la readministración de vectores de AAV con fines terapeuticos o profilacticos.
Estos y otros aspectos de la invención resultaran facilmente evidentes a partir de la descripción detallada que sigue de la invención.
Breve descripcion de los dibujos La Figura 1 es un arbol que muestra la relación filogenica construida con la utilización de Neighbor-Joining heuristica con medición de distancia de corrección de Poisson. La relación fue determinada en base a la proteina de capside vp1 de AAV aislado, con el AAV aislado agrupado en clados. Los grupos de clones de capside individuales se clasifican en clados en base a su ascendencia comun. La nomenclatura del clado va desde A a F; los subtipos estan representados por la letra del clado seguida de un numero;
Las Figuras 2A-2E son un alineamiento de las secuencias de aminoacido de proteinas de capside vp1 de AAV con la numeración de las secuencias individuales informadas, y publicadas previamente: AAV1 [SEQ 10 Num. 219]; AAV2 [SEQ 10 Num. 221]; AAV3-3 [SEQ 10 Num. 217]; AAV4-4 [SEQ 10 Num. 218]; AAV5 [SEQ 10 Num. 216]; AAV6 [SEQ 10 Num. 220]; AAV7 [SEQ 10 Num. 222]; AAV8 [SEQ 10 Num. 223]; y, rh. 25/42; 29.3/bb.1; cy.2; 29.5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24, rh.14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (denominado anteriormente 41.10) ; rh.25 (denominado anteriormente 41.15) ; rh.2; rh.31; cy.3; cy.5; rh.13; cy.4; cy.6; rh.22; rh.19; rh.35; rh.37; rh.36; rh.23; rh.8, y ch.5 [Solicitud de Patente US publicada num. 2003/0138772 A1 (24 de Julio de 2003) ]. Las secuencias incluyen hu.14/AAV9 [SEQ 10 Num. 123]; hu.17 [SEQ 10 Num. 83], hu.8 [SEQ 10 Num. 84], hu.42 [SEQ 10 Num. 85], rh.38 [SEQ 10 Num. 86], hu.40 [SEQ 10 Num. 87], hu.37 [SEQ 10 Num. 88], rh.40 [SEQ 10 Num. 92], rh.52 [SEQ 10 Num. 96]; rh.53 [SEQ 10 Num. 97]; rh.49 [SEQ 10 Num. 103]; rh.51 [SEQ 10 Num. 104]; rh.57 [SEQ 10 Num. 105]; rh.58 [SEQ 10 Num. 106], rh.61 [SEQ 10 Num. 107]; rh.50 [SEQ 10 Num. 108]; rh.43 [SEQ 10 Num. 163]; rh.62 [SEQ 10 Num. 114]; rh.48 [SEQ 10 Num. 115]; 4-9/rh.54 (SEQ 10 Num. 116) ; y 4-19/rh.55 (SEQ 10 Num. 117) ; hu.31 [SEQ 10 Num. 121]; hu.32 [SEQ 10 Num. 122]; hu.34 [SEQ 10 Num. 125]; hu.45 [SEQ 10 Num. 127]; hu.47 [SEQ 10 Num. 128]; hu.13 [SEQ 10 Num. 129]; hu.28 [SEQ 10 Num. 130]; hu.29 [SEQ 10 Num. 132]; hu.19 [SEQ 10 Num. 133]; hu.20 [SEQ 10 Num. 134]; hu.21 [SEQ 10 Num. 135]; hu.23.2 [SEQ 10 Num. 137]; hu.22 [SEQ 10 Num. 138]; hu.27 [SEQ 10 Num. 140]; hu.4 [SEQ 10 Num. 141]; hu.2 [SEQ 10 Num. 143]; hu.1 [SEQ 10 Num. 144]; hu.3 [SEQ 10 Num. 145]; hu.25 [SEQ 10 Num. 145]; hu.11 [SEQ 10 Num. 153]; hu.9 [SEQ 10 Num. 155]; hu.10 [SEQ 10 Num. 156]; hu.48 [SEQ 10 Num. 157]; hu.44 [SEQ 10 Num. 158]; hu.46 [SEQ 10 Num. 159]; hu.43 [SEQ 10 Num. 160]; hu.35 [SEQ 10 Num. 164]; hu.24 [SEQ 10 Num. 136]; rh.64 [SEQ 10 Num. 99]; hu.41 [SEQ 10 Num. 91]; hu.39 [SEQ 10 Num. 102]; hu.67 [SEQ 10 Num. 198]; hu.66 [SEQ 10 Num. 197]; hu.51 [S·Q 10 Num. 190]; hu.52 [SEQ 10 Num. 191]; hu.49 [SEQ 10 Num. 189]; hu.56 [SEQ 10 Num. 192]; hu.57 [SEQ 10 Num. 193]; hu.58 [SEQ 10 Num. 194]; hu.63 [SEQ 10 Num. 195]; hu.64 [SEQ 10 Num. 196]; hu.60 [SEQ 10 Num. 184]; hu.61 [SEQ 10 Num. 185]; hu.53 [SEQ 10 Num. 186]; hu.55 [SEQ 10 Num. 187]; hu.54 [SEQ 10 Num. 188]; hu.6 [SEQ 10 Num. 84]; y rh.56 [SEQ 10 Num. 152]. Estas secuencias de capside estan reproducidas tambien en el Listado de Secuencias que se acompana.
Las Figuras 3A-3CN son un alineamiento de secuencias de acido nucleico de proteinas de capside vp1 de AAV, con la numeración de las secuencias individuales informadas, y previamente publicadas AAV5 (SEQ 10 Num. 199) ; AAV3-3 (SEQ 10 Num. 200) ; AAV4-4 (SEQ 10 Num. 201) ; AAV1 (SEQ 10 Num. 202) ; AAV6 (SEQ 10 Num. 203) ; AAV2 (SEQ 10 Num. 211) ; AAV7 (SEQ 10 Num. 213) y AAV8 (SEQ 10 Num. 214) ; rh.25/42-15; 29.3/bb.1; cy.2; 29, 5/bb.2; rh.32, rh.33, rh.34, rh.10; rh.24; rh.14, rh.16, rh.17, rh.12, rh.18, rh.21 (denominada... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un virus adeno-asociado (AAV) que comprende una capside de AAV de serotipo 9, en el que la capside de AAV9 es al menos un 95% identica a la secuencia de aminoacidos 203 a 736 de SEQ 10 Num. 123, y en el que el AAV comprende ademas un minigen que tiene repeticiones terminales de AAV invertidas y un gen heter6logo enlazado operativamente a secuencias regulatorias que dirigen su expresión en una celula anfitrión.
2. Un AAV de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha capside esta codificada por la secuencia de acido nucleico de SEQ 10 Num. 3
3. Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que comprende los aminoacidos 138 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
4. Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que comprende los aminoacidos 1 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
5. Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que comprende los aminoacidos 203 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
6. Un virus adeno-asociado (AAV) de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la capside de AAV tiene una secuencia de aminoacido que es al menos un 97% identica a 1 a 736 de SEQ 10 Num. 123.
7. Una proteina de capside aislada que comprende un virus adeno-asociado de proteina de capside de serotipo 9 (AAV9) seleccionada en el grupo consistente en:
proteina de capside vp1, aminoacidos (aa) 1 a 736, SEQ 10 Num. 123; proteina de capside vp2, aa 138 a 736, SEQ 10 Num. 123; y, proteina de capside vp3, aa 203 a 736, SEQ 10 Num. 123.
8. Un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una proteina de capside conforme a la reivindicación 7.
9. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica una proteina conforme a la reivindicación 7.
10. Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en la que dicha secuencia de acido nucleico se selecciona en el grupo consistente en:
nt 1 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 [vp1];
nt 411 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 [vp2], y
nt 609 a 2211 de SEQ 10 Num. 3 [vp3].
11. Una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, que comprende ademas una secuencia de AAV que codifica una proteina rep funcional de AAV.
12. Una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que dicha molecula es un plasmido.
13. Un metodo de generación de un virus adeno-asociado (AAV) recombinante que comprende una capside de AAV, que comprende las etapas de cultivar una celula anfitrión que contiene:
(a) una molecula que codifica una proteina de capside de AAV; (b) un gen rep funcional; (c) un minigen que comprende repeticiones terminales invertidas (1TRs) de AAV y un transgen; y, (d) funciones auxiliares suficientes para permitir el empaquetamiento del minigen en la proteina de capside de AAV, en el que dicha celula anfitrión comprende una molecula de acido nucleico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
14. Una celula anfitrión transfectada in vitro con un virus adeno-asociado conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
15. Una celula anfitrión in vitro transfectada con una molecula de acido nucleico conforme a cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.
16. Una composición que comprende un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador fisiológicamente compatible.
17. Una composición que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y un portador fisiológicamente compatible.
18. Uso de un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para la preparación de un medicamento para el suministro de una molecula a una celula.
19. Un AAV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para su uso en el suministro de una molecula a una celula.
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