Cepas mutantes de Lactobacillus bulgaricus desprovistas de actividad beta-galactosidasa.

Cepa mutante de L. bulgaricus desprovista de actividad â-galactosidasa,

caracterizada porque porta una mutación sin sentido en la secuencia que codifica la â- galactosidasa.

Cepas mutantes de Lactobacillus bulgaricus desprovistas de actividad β-galactosidasa.

Estas cepas y fermentos pueden utilizarse para la obtención de productos lácteos fermentados a partir de leche con adición de glucosa.

La presente invención se refiere a nuevas variantes de bulgaricus y a su uso para la preparación de productos lácteos fermentados.

Los yogures se obtienen tradicionalmente mediante fermentación de la leche con una asociación de Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus. En el transcurso de la fermentación, que se efectúa a una temperatura de aproximadamente 40 a 45ºC, estas bacterias utilizan principalmente la lactosa como sustrato energético, y producen ácido láctico que provoca la coagulación de la leche; cuando el pH alcanza un valor de aproximadamente 4,8 a 4,5, se pone fin a esta etapa de fermentación (igualmente denominada acidificación) enfriando el producto. Éste se mantiene a continuación en frío durante el transcurso del proceso de fabricación y acondicionamiento, y hasta su consumo.

Sin embargo, el enfriamiento no detiene completamente la fermentación láctica; incluso cuando el producto se mantiene a 4ºC, se observa un aumento progresivo de su acidez con el transcurso del tiempo.

Este fenómeno, conocido con el nombre de post-acidificación, es responsable de la degradación de las calidades organolépticas del producto durante su conservación.

La post-acidificación es esencialmente el resultado de la utilización por las bacterias, y principalmente por L. bulgaricus, de la lactosa restante en el producto al término de la etapa de acidificación controlada. Para evitarla, se ha propuesto utilizar cepas de L. bulgaricus que no fermentan, o muy poco, la lactosa.

Una de las enzimas esenciales para la fermentación de la lactosa es la β-galactosidasa, que hidroliza la lactosa en glucosa y galactosa. Por tanto, se ha propuesto, para obtener cepas no postacidificantes de L. bulgaricus, producir mutantes artificiales, o seleccionar mutantes naturales en los que la actividad de esta enzima estuviera afectada.

Por ejemplo, la patente EP 402450 a nombre de GENENCOR describe la obtención, mediante mutagénesis localizada del gen de la β-galactosidasa, de mutantes condicionales de L. bulgaricus en los que la β-galactosidasa, que es activa en la fermentación a 40ºC, pierde su actividad a la temperatura o al pH correspondiente a las condiciones de conservación de los productos lácteos fermentados.

La solicitud JP 90053437 describe la obtención de un mutante artificial de L. bulgaricus que ha perdido completamente la capacidad de fermentar la lactosa, y la selección de un mutante natural con capacidad reducida de fermentación de la lactosa; estos mutantes son, sin embargo, capaces, tanto uno como el otro, de desarrollarse y acidificar normalmente en presencia de S. thermophilus, a condición de que el medio se complemente con glucosa. Los subcultivos de estos mutantes conservan sus características de acidificación, en leche desprovista de glucosa, después de 10 replicaciones.

La patente EP 0518096, a nombre de SOCIÉTÉ DES PRODUITS NESTLÉ, propone utilizar para la fabricación de yogur mutantes débilmente postacidificantes de Lactobacillus bulgaricus previamente seleccionados por el criterio de la deleción de un fragmento del gen de la β-galactosidasa. El cribado y la caracterización de estos mutantes se facilitan por el hecho de que la presencia de esta deleción puede verificarse fácilmente mediante perfiles de restricción. Además, las deleciones son conocidas por ser mutaciones irreversibles, lo que permite obtener fácilmente cepas mutantes estables a partir de la cepa madre. La patente EP 0518096 describe dos tipos de mutantes débilmente postacidificantes seleccionados de este modo. Los primeros tienen una deleción que afecta únicamente al gen de la β-galactosidasa; cuando se asocian a S. thermophilus y se cultivan en leche, presentan, incluso en ausencia de adición de glucosa, propiedades de crecimiento y acidificación comparables a las de la cepa salvaje de la que proceden. Los segundos presentan una deleción más importante, que se extiende por al menos 1 kb cadena arriba del gen de la β-galactosidasa; cuando se asocian a S. thermophilus, crecen más lentamente y acidifican mucho menos que la cepa salvaje de la que proceden; la adición de glucosa al medio de cultivo sólo tiene poca influencia sobre sus propiedades de acidificación y de post-acidificación.

Los mutantes naturales en los que la β-galactosidasa está inactiva son mucho más difíciles de seleccionar y mantener en cultivos puros en el caso de mutaciones puntuales que en el caso de mutantes de deleción; esto se explica por la menor probabilidad de que una mutación puntual produzca una proteína inactiva, por la mayor probabilidad para localizar y caracterizar las mutaciones puntuales mediante perfiles de restricción y por una proporción de reversión muy importante.

La solicitante ha encontrado ahora otros mutantes naturales de L. bulgaricus que no portan deleción en el gen que codifica la β-galactosidasa, y que presentan características tecnológicas ventajosas. En el marco de la presente invención, se ha aislado un mutante sin sentido, incapaz de asimilar la lactosa, a partir de un cultivo de L. bulgaricus salvaje. Asociado a S. thermophilus, en cultivo en leche, crece y acidifica mucho más lentamente que la cepa salvaje de la que procede. En contraposición, su crecimiento y su acidificación son casi normales cuando la leche se complementa con glucosa.

La presente invención tiene como objeto una cepa mutante de L. bulgaricus desprovista de actividad β-galactosidasa, caracterizada porque porta una mutación que introduce un codón sin sentido en la secuencia que codifica la β-galactosidasa.

Se ha depositado una cepa de L. bulgaricus según la invención según el Tratado de Budapest el 14 de enero de 1998 en la CNCM (Collection National de Cultures de Microorganismes) regida por el Instituto Pasteur; 25 rue du Docteur Roux, París, con el número I-1968.

Esta cepa presenta las características morfológicas y bioquímicas siguientes:

Los inventores han secuenciado el operón lactosa en el mutante I-1968. La secuencia correspondiente se representa en la lista de secuencias del anexo con el número SEC Nº ID 1. Las secuencias de los productos de traducción (permeasa y β-galactosidasa) se representan respectivamente con los números SEC Nº ID 2 y SEC Nº ID 3.

El análisis de esta secuencia hace aparecer dos mutaciones puntuales: una al nivel del gen de la permeasa (posición 122 de la secuencia SEC Nº ID 1), induce un cambio de aminoácido (Lys rightarrow Asn); la otra, al nivel del gen de la β-galactosidasa (posición 4519 de la secuencia SEC Nº ID 1), introduce un codón de terminación. Aunque conserva sus sitios activos (posiciones 464 y 531), la β-galactosidasa producida por este mutante es inactiva. Los inventores han constatado además que esta mutación permanecía estable después de varias series de replicaciones en un medio de cultivo que contenía glucosa. En contraposición, en un medio de cultivo en ausencia de glucosa, esta mutación sin sentido revierte muy rápidamente a una proporción de aproximadamente 10^-6.

La presente invención abarca igualmente cepas mutantes incapaces de asimilar la lactosa, derivadas de la cepa I-1968. Dichas cepas pueden obtenerse, por ejemplo, induciendo mediante mutagénesis dirigida otras mutaciones en el operón lactosa de la cepa I-1968.

La presente invención tiene igualmente como objeto un fermento láctico, particularmente un fermento de yogur, caracterizado porque comprende al menos una cepa de L. bulgaricus según la invención tal como se define anteriormente, preferiblemente asociada al menos a una cepa de S. thermophilus.

Para la obtención de un fermento...

1. Cepa mutante de L. bulgaricus desprovista de actividad β-galactosidasa, caracterizada porque porta una mutación sin sentido en la secuencia que codifica la β-galactosidasa.

2. Cepa mutante de L. bulgaricus según la reivindicación 1, depositada el 14 de enero de 1998 en la CNCM con el número I-1968.

3. Fermento láctico, caracterizado porque comprende al menos una cepa de L. bulgaricus según la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. Fermento láctico según la reivindicación 3, caracterizado porque dicha cepa de L. bulgaricus está asociada al menos a una cepa de S. thermophilus.

5. Procedimiento de preparación de un producto lácteo fermentado, caracterizado porque comprende una etapa en el transcurso de la cual se fermenta leche con ayuda de un fermento láctico que comprende al menos una cepa de L. bulgaricus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en presencia de al menos un azúcar asimilable por dicha cepa.

6. Procedimiento según l reivindicación 5, caracterizado porque dicho azúcar asimilable es la glucosa.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque la detención de la fermentación se efectúa sin enfriamiento de dicho producto lácteo.

8. Producto lácteo fermentado susceptible de obtenerse mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Producto lácteo fermentado según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho producto es un yogur.