Una célula o un mamífero no humano genéticamente modificado, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de ácido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipéptidos del locus de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas endógenos,

y porque están presentes las secuencias de ácidos nucleicos de una o más regiones variables de IgH endógenas, de uno o más segmentos D de IgH endógenos, y de uno o más segmentos J de IgH endógenos.

Celulas y mamfferos no humanos modificados geneticamente.

La presente invención se refiere a mamfferos no humanos geneticamente modificados, en particular a roedores geneticamente modificados, tales como ratones, que no codifican ningun polipeptido del locus de la región constante 5 de la cadena pesada de inmunoglobulinas end6geno. La invención tambien se refiere a celulas no humanas geneticamente modificadas, en particular celulas precursoras embrionarias, en especial celulas de roedor, tales como celulas de ratón, que no codifican ningun polipeptido del locus de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas end6geno. La invención tambien se refiere a celulas no humanas geneticamente modificadas, en particular celulas precursoras embrionarias, y a los mamfferos no humanos geneticamente modificados producidos a

partir de estas, y a su uso para la producción de celulas y mamfferos no humanos en los que todos los genes de la región constante de la cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos (de Cμ a Cα) se han delecionado del genoma.

La invención se refiere tambien a mamfferos no humanos geneticamente modificados, en particular a roedores geneticamente modificados, tales como ratones, en los que la deleción de los genes de la región constante de la

cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos se ha utilizado para permitir la inserción de otros genes, tales como genes de inmunoglobulinas ex6genas o sus segmentos, para asegurar y permitir la expresión de genes específicos del locus de la cadena pesada de inmunoglobulinas. Ademas, la invención se refiere a la expresión de estos genes producidos por estos mamfferos, y al uso de dichos mamfferos o de sus celulas para la producción de sistemas inmunológicos modificados con especial enfasis en la producción de inmunoglobulinas o anticuerpos.

Ademas, la invención se refiere a mamfferos no humanos sin ningun gen de la región constante end6geno cruzados con mamfferos no humanos compatibles capaces de expresar genes de inmunoglobulinas ex6genos como entidades redispuestas introducidas o entidades en la configuración de la lfnea germinal y sobre fragmentos grandes de cromosomas, tales como BAC, YAC y HAC (cromosomas bacterianos, de levadura y humanos artificiales, respectivamente) . Los transgenes y los transloci puede ser de AON humano.

Antecedentes de la invencian

La estructura basica de un anticuerpo (inmunoglobulina) es una unidad de cuatro polipeptidos, formada por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras que estan unidas mediante enlaces disulfuro intercatenarios. Cada cadena esta formada por una región constante y una región variable; VL y CL son los terminos genericos para estas regiones sobre la cadena ligera, y VH y CH especifican las regiones variable y constante de la cadena pesada. En un

anticuerpo convencional, cada par de cadenas pesadas es identica, al igual que cada par de cadenas ligeras.

Las inmunoglobulinas (Ig) se agrupan en clases o isotipos (haciendo referencia a la región constante) basandose en la estructura de su región constante de cadena pesada (CH) . En seres humanos y ratones existen cinco clases: IgG, IgA, IgM, IgO e IgE. Otras subclases en seres humanos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, y en ratones IgG1, IgG3, IgG2a e IgG2b. El isotipo es definido por los diferentes genes C (μ, δ, γ, ε, α) que son caracterfsticos de cada 35 especie de mamffero concreta y que estan presentes en todos los miembros de esa especie. Sin embargo pueden existir diferencias, habitualmente mutaciones puntuales o pequenos cambios, en los genes de inmunoglobulinas dentro de los miembros de una especie (por ejemplo, ratones BALB/c frente a ratones C57/Bl6) . Estas diferencias definen los determinantes alotípicos. Los determinantes alotípicos se encuentran en las inmunoglobulinas (Ig) de algunos, pero no todos los miembros de una especie concreta (por ejemplo, Mus musculus) . Los determinantes

alotípicos reflejan el polimorfismo genetico de la región constante de cadena pesada de Ig dentro de una especie, y se han utilizado como marcadores geneticos. Se han generado anticuerpos que permiten el reconocimiento de los determinantes isotípicos inyectando inmunoglobulinas de una especie en otra especie (por ejemplo, IgM humana en un ratón) o entre miembros de una especie, que permiten producir anticuerpos antialotípicos (IgMa de BALB/c en C57/Bl6 que forman IgMb) .

45 Las regiones constantes de cadena ligera existen en formas isotípicas conocidas como kappa (κ) y lambda (λ) , y estas cadenas ligeras pueden asociarse potencialmente con todos los isotipos de cadena pesada. Las cadenas ligeras en un anticuerpo concreto son identicas, y así las inmunoglobulinas tienen cadenas ligeras κ o λ, pero no cadenas ligeras mixtas, a menos que el anticuerpo haya sido modificado de modo artificial.

Los determinantes idiotípicos existen como resultado de estructuras exclusivas generadas por las subregiones 50 hipervariables (o regiones determinantes de la complementariedad, COR) en las regiones variables de cadena ligera

(L) y pesada (H) , y se han identificado mediante la variabilidad de secuencia.

Se han desarrollado tecnicas para la producción de anticuerpos monoclonales utilizando celulas derivadas de animales de laboratorio pequenos, tales como ratones (Kohler, G. y Milstein, C., "Continuos cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature, 256, 495-497 (1975) ) , que por primera vez describieron la

55 producción de anticuerpos monoclonales condensando una celula que forma un anticuerpo individual con una celula tumoral de celula B para producir un clon de celulas en constante división (lfnea celular de hibridoma) dedicado a fabricar un anticuerpo concreto (anticuerpo monoclonal) .

Un anticuerpo monoclonal (mAb) tiene la capacidad de reconocer una estructura o una secuencia definida, o de unirse a un epitopo específico. Por tanto, un anticuerpo monoclonal puede utilizarse exclusivamente para identificar las moleculas que portan el epitopo específico, o puede dirigirse, solo o en combinación con otro resto, a un sitio específico para el diagnóstico o la terapia.

El uso de anticuerpos monoclonales como agentes terapeuticos se ha visto restringido por el desarrollo de una respuesta antiinmunoglobulinas en el sujeto tratado. Oebido a que la secuencia de la región constante es específica de la especie a partir de la cual se produce el anticuerpo, la introducción de un anticuerpo extrano (xenogeneico o ex6geno) en el sistema vascular del hospedante puede producir una respuesta inmunológica. Cuando el anticuerpo xenogeneico se introduce varias veces, por ejemplo en el tratamiento de enfermedades crónicas, resulta poco factible administrar el anticuerpo, puesto que se provocara una respuesta inmunológica y esto dara como resultado la eliminación de la eficacia de diana del anticuerpo administrado generando efectos secundarios extremos, tales como un choque anafilactico. Por esta razón se han realizado diversos esfuerzos para "humanizar" anticuerpos de roedores que ya se han utilizado con exito para la intervención terapeutica y, en fechas mas recientes, para establecer ratones transgenicos que produzcan anticuerpos totalmente humanos (BrOggemann, M. y Taussig, M.J. (1997) , Production of human antibody repertoires in transgenic mice, Curr. Opin. Biotechnol., 8, 455-458) .

La producción de animales transgenicos ha sufrido una revolución debido a las tecnicas que permiten cultivar celulas precursoras embrionarias murinas y a la introducción de modificaciones geneticas en estas celuals que pueden ser transmitidas a la lfnea germinal de ratón. Los genes end6genos pueden modificarse, y pueden introducirse genes extranos (ex6genos) , tales como genes humanos, en un hospedante para proporcionar cepas animales capaces de producir nuevos productos, tales como protefnas de unión xenogeneicas (extranas) , en particular inmunoglobulinas.

Como alternativa al uso de bancos artificiales, es posible crear animales transgenicos que porten loci de inmunoglobulinas humanas, en la configuración de la lfnea germinal, en un entorno genetico en el que los loci de Ig end6genos son defectuosos. Se ha realizado la silenciación de genes de inmunoglobulinas mediante la inserción de genes y la eliminación de genes utilizando la introducción de construcciones dirigidas a genes en celulas precursoras embrionarias (Bot,... [Seguir leyendo]

REIvINDICACIoNES

1. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos.

2. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos del locus de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes todas las secuencias de acidos nucleicos de la región variable y del segmento O y J de IgH end6genas.

3. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que se caracteriza porque no comprende una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas (C de IgH) .

4. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que se caracteriza porque todas las secuencias de genes de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas estan ausentes o parcialmente ausentes del genoma.

5. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque puede obtenerse o se obtiene mediante la deleción dirigida de todas o fundamentalmente todas las secuencias del gen C de IgH end6genas.

6. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque puede obtenerse o se obtiene mediante una recombinación Cre-llxP.

7. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque al menos parte de al menos una secuencia potenciadora del gen C de IgH esta presente.

8. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena esta presente dentro del genoma.

9. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque tiene una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena cadena abajo o dentro del ultimo gen del locus C de IgH.

10. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicación 9, que se caracteriza porque tiene otra secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen del locus C de IgH.

11. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque uno o mas marcadores seleccionables estan presentes dentro del genoma.

12. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicación 9, que se caracteriza porque al menos un marcador seleccionable esta presente cadena arriba o cadena abajo de la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena.

13. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun la reivindicación 10, que se caracteriza porque al menos un marcador seleccionable esta integrado dentro del genoma cadena arriba y/o cadena abajo de al menos una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena.

14. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, que se caracteriza porque el marcador o marcadores seleccionables son uno o mas de los marcadores seleccionables seleccionados del grupo que comprende un gen de resistencia a la neomicina, un gen de resistencia a la puromicina, y un gen de resistencia a la higromicina.

15. Una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, que se caracteriza porque la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena es un sitio llxP.

16. Un mamffero no humano geneticamente modificado segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se caracteriza porque es un ratón.

17. Una celula no humana geneticamente modificada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, que se caracteriza porque es una celula de ratón.

18. Un ratón geneticamente modificado segun la reivindicación 16, o una celula de ratón geneticamente modificada

segun la reivindicación 17, que se caracteriza porque los ocho genes C de IgH end6genos, μ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε y α estan ausentes o parcialmente ausentes.

19. Una celula no humana geneticamente modificada segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o las reivindicaciones 17 o 18, que se caracteriza porque es una celula precursora embrionaria.

20. Un metodo para producir una celula no humana geneticamente modificada, que comprende:

(a) (i) transfectar una celula no humana con una construcción de transporte dirigido para la integración cadena arriba

o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcción de transporte dirigido una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integración de la secuencia de recombinación, y

(ii) transfectar una celula producida en (a) (i) con una construcción de transporte dirigido para la integración cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcción de transporte dirigido un marcador seleccionable y una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integración de la secuencia de recombinación; o

(b) (i) transfectar una celula no humana con una construcción de transporte dirigido para la integración cadena abajo

o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcción de transporte dirigido una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integración de la secuencia de recombinación, y

(ii) transfectar una celula producida en (b) (i) con una construcción de transporte dirigido para la integración cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo dicha construcción de transporte dirigido una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena y un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador seleccionable esta presente, y evaluar dicha celula para la integración de la secuencia de recombinación; o

(c) cotransfectar una celula no humana con una construcción de transporte dirigido para la integración cadena arriba

o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, y con una construcción de transporte dirigido para la integración cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, comprendiendo cada una de dichas construcciones de transporte dirigido una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena y teniendo cada una un marcador seleccionable, seleccionar una celula en la que el marcador o marcadores seleccionables estan presentes, y evaluar dicha celula para la integración de la secuencia de recombinación; y opcionalmente,

(d) proporcionar a una celula obtenida en (a) (ii) , (b) (ii) o (c) una recombinasa activa en la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena, y opcionalmente evaluar para acontecimientos de deleción.

21. Un metodo segun la reivindicación 20, que se caracteriza porque la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena es un sitio llxP.

22. Un metodo segun la reivindicación 21, que se caracteriza porque, en la etapa opcional (d) , la recombinasa es una recombinasa Cre.

23. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, que se caracteriza porque la recombinasa se proporciona mediante un vector de expresión.

24. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, que se caracteriza porque la celula no humana geneticamente modificada es una celula de ratón.

25. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, que se caracteriza porque la celula no humana geneticamente modificada es una celula precursora embrionaria.

26. El uso de una celula precursora embrionaria de la reivindicación 19 para la producción de un mamffero no humano geneticamente modificado.

27. Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado, que se caracteriza porque una celula precursora embrionaria de la reivindicación 19 se introduce en un blastocito hospedante y se desarrolla en un animal quimerico.

28. Un metodo segun la reivindicación 27, que se caracteriza por:

(a) introducir una celula precursora embrionaria de mamffero no humano segun la reivindicación 19 en un blastocito de mamffero no humano compatible; y

(b) transplantar el blastocito obtenido en (a) a una madre de acogida que es un mamffero no humano compatible para obtener un mamffero no humano quimerico, y opcionalmente seleccionar el marcador o marcadores seleccionables y/o la secuencia o secuencias de recombinación específica de sitio no end6genas y/o la deleción de fundamentalmente todas las secuencias del gen C de IgH end6genas.

29. Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza por realizar un metodo de la reivindicación 27 o 28 para obtener un mamffero no humano quimerico, y cruzar dicho mamffero no humano quimerico para obtener una progenie heterocig6tica.

30. Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza por realizar un metodo de la reivindicación 29 para obtener una progenie heterocig6tica, y cruzar entre sí dicha progenia heterocig6tica para obtener una progenie homocig6tica.

31. Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado que se caracteriza por realizar un metodo de la reivindicación 30 para obtener un mamffero no humano geneticamente modificado homocig6tico para la integración de una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, y cruzar dicho mamffero no humano geneticamente modificado homocig6tico para la integración de una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena cadena arriba o dentro del primer gen C de IgH del locus C de IgH, con un mamffero no humano geneticamente modificado compatible homocig6tico para la integración de una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena cadena abajo o dentro del ultimo gen C de IgH del locus C de IgH, para obtener una progenie heterocig6tica, y opcionalmente cruzar entre sí la progenie heterocig6tica para obtener una progenie homocig6tica para ambas integraciones.

32. Un metodo segun la reivindicación 31, que se caracteriza porque comprende ademas cruzar la progenie homocig6tica para ambas integraciones con un mamffero no humano compatible capaz de expresar una recombinasa activa en la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena para obtener una progenie; y opcionalmente seleccionar la progenie obtenida para la deleción del gen C de IgH.

33. Un metodo segun la reivindicación 31 o la reivindicación 32, que se caracteriza porque la secuencia o secuencias de recombinación específica de sitio no end6genas son sitios llxP.

34. Un metodo segun la reivindicación 33, que se caracteriza porque la recombinasa es una recombinasa Cre.

35. Un metodo segun la reivindicación 33, que se caracteriza porque comprende ademas cruzar la progenie heterocig6tica u homocig6tica para llxP en ambos loci con un mamffero no humano compatible capaz de expresar la recombinasa Cre para obtener una progenie de mamfferos no humanos que no comprenda una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la región constante de cadena pesada de Ig end6genos en uno o ambos alelos.

36. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 35, que se caracteriza porque las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos estan presentes en la progenie.

37. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, que se caracteriza porque todas las secuencias de acidos nucleicos de la región variable y del segmento O y J de IgH end6genas estan presentes en la progenie.

38. Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza por realizar un metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 para obtener un mamffero no humano geneticamente modificado segun las reivindicaciones 1 a 7, o las reivindicaciones 10 a 16, o la reivindicación 18, que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y cruzar dicho mamffero no humano geneticamente modificado segun las reivindicaciones 1 a 7, o las reivindicaciones 10 a 16, o la reivindicación 18, con un mamffero no humano compatible que codifica y es capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, para obtener una progenie heterocig6tica para dicho uno o mas genes ex6genos, y opcionalmente cruzar entre sí la progenie heterocig6tica para producir una progenie homocig6tica para dicho uno o mas genes ex6genos.

39. Un metodo para producir una celula o un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza porque comprende la introducción de uno o mas genes ex6genos en una celula de mamffero no humano segun las reivindicaciones 1 a 7, o las reivindicaciones 10 a 15, o las reivindicaciones 17 o 18, que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos.

40. Un metodo segun la reivindicación 39, que se caracteriza porque la celula de mamffero no humana es una celula precursora embrionaria.

41. Un metodo segun la reivindicación 40, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos se

introducen mediante transfección.

42. Un metodo segun la reivindicación 39, que se caracteriza porque la celula de mamffero no humana es un oocito (celula huevo) .

43. Un metodo segun la reivindicación 42, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos se introducen mediante microinyección de AON.

44. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos se insertan en el genoma de la celula o del mamffero no humano.

45. Un metodo segun la reivindicación 44, que se caracteriza porque dicho uno o mas genes ex6genos se insertan en una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena.

46. Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza por realizar un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 para obtener un mamffero no humano que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes las secuencias de acidos nucleicos de una o mas regiones variables de IgH end6genas, de uno o mas segmentos O de IgH end6genos, y de uno o mas segmentos J de IgH end6genos, y cruzar dicho mamffero no humano obtenido de este modo con un mamffero transgenico no humano que tiene uno o mas genes ex6genos asociados o flanqueados por una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena y que tiene una recombinasa activa en la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena, para obtener una progenie, y opcionalmente seleccionar la progenie para la inserción de dicho uno o mas genes ex6genos.

47. Un metodo para producir un mamffero no humano geneticamente modificado capaz de expresar uno o mas genes ex6genos, que se caracteriza por realizar un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37 para obtener un mamffero no humano que no comprende una secuencia de acido nucleico que en sí misma codifique cualquiera de los polipeptidos de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulinas end6genos, y porque estan presentes todas las secuencias de acidos nucleicos de la región variable, los segmentos O y J de IgH end6genas, y cruzar dicho mamffero no humano obtenido de este modo con un mamffero transgenico no humano que tiene uno o mas genes ex6genos asociados o flanqueados por una secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena y que tiene una recombinasa activa en la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena, para obtener una progenie, y opcionalmente seleccionar la progenie para la inserción de dicho uno o mas genes ex6genos.

48. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, que se caracteriza porque la secuencia de recombinación específica de sitio no end6gena es una secuencia llxP, y la inserción es mediante integración de Cre-llxP.

49. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 38 a 48, que se caracteriza porque el mamffero no humano geneticamente modificado es un ratón.

50. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 38 a 49, que se caracteriza porque el gen o genes ex6genos son un gen de IgH o genes de IgH.

51. Un metodo segun la reivindicación 50, que se caracteriza porque el gen o genes de IgH son un gen C de IgH o genes C de IgH.

52. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 38 a 51, que se caracteriza porque el gen o genes ex6genos son un gen humano o genes humanos.

53. Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 52, que se caracteriza porque los genes ex6genos son un locus de cadena pesada de Ig humano que tiene regiones V, O, J y/o C.

54. Un metodo segun la reivindicación 53, en el que las regiones V, O, J y/o C del locus de cadena pesada de Ig humano estan en la configuración de la lfnea germinal.

55. Un metodo segun la reivindicación 53, en el que las regiones V, O, J y/o C del locus de cadena pesada de Ig humano estan productivamente dispuestas.

56. Un metodo para la producción de inmunoglobulinas ex6genas que comprende un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 55.

57. Un metodo para la producción de inmunoglobulinas humanas que comprende un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 38 a 55.

58. Un metodo segun la reivindicación 56 o 57, en el que el mamffero no humano es un roedor.

59. Un metodo segun la reivindicación 56 o 57, en el que el mamffero no humano es un ratón.

60. Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 56 o 57, en el que la celula no humana es una celula de roedor. 61. Un metodo segun la reivindicación 56 o 57, en el que la celula no humana es una celula de ratón. 62. Un metodo para la producción de un medicamento que comprende un metodo segun una cualquiera de las

reivindicaciones 56 a 61.