Células de fucosilación deficiente.

Una célula que es capaz de fucosilar una glicoproteína, donde la célula comprende un gen de la GDP-4-ceto-6- desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa

(FX) modificada que tiene una modificación que codifica una proteína FX que es al menos un 90 % idéntica a la SEC ID Nº 1 y que comprende una serina en la posición 289, y donde no más del 10 % de la glicoproteína está fucosilada cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 ºC en ausencia de una fuente de fucosa externa.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/036914.

Solicitante: REGENERON PHARMACEUTICALS, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 777 OLD SAW MILL RIVER ROAD TARRYTOWN, NY 10591 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: FANDL, JAMES, P., CHEN,GANG, BURAKOV,DARYA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K16/00 (Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/53 (Oxidorreductasas (1))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > C12P21/00 (Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/04 (actúan sobre grupos CHOH como dadores, p. ej. glucosa oxidasa de glucosa, deshidrogenasa láctica (1.1))

PDF original: ES-2527173_T3.pdf

 

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Células de fucosilación deficiente.

Fragmento de la descripción:

Células de fucosilación deficiente Campo

La invención se refiere a una enzima de mamíferos modificada en la ruta de fucosilación, donde las células portadoras de la enzima de mamíferos modificada exhiben una capacidad reducida para fucosilar una proteína y a células que comprenden una modificación genética que tiene como resultado una capacidad reducida para fucosilar una proteína. La invención incluye una línea de células de mamífero (p. ej., líneas CHO) que expresa proteínas, incluidos anticuerpos, con una fucosilación reducida en comparación con las líneas celulares salvajes. La invención también se refiere a un control condicional de la fucosilación de proteínas.

Antecedentes

En la técnica se conocen líneas celulares que son incapaces de fucosilar proteínas. Se conocen numerosos mutantes de pérdida de función que son incapaces de fucosilar proteínas, quizá las más importantes determinadas mutantes de células de ovario de hámster chino (CHO) seleccionadas por la resistencia a determinadas lecitinas. Dichas líneas celulares se aíslan mediante selección repetida de la incapacidad para unirse a una lectina concentrada, por ejemplo la lectina Lens culinaris, en presencia de un mutágeno. Se conocen otras líneas celulares supuestamente incapaces de fucosilar proteínas, por ejemplo anticuerpos, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. 7.425.466 y la patente de EE.UU. 7.214.775 (a1, 6-fucosiltransferasa, es decir la muíante FUT8). El documento EP- A1-1.331.266 (Kyowa Hakko Kogyo KK) se refiere a células productoras de composiciones de anticuerpos. Sigue existiendo la necesidad en la técnica de líneas celulares con menor capacidad para fucosilar proteínas, en particular de células con menor capacidad de fucosilación en ausencia de un defectivo y de células que fucosilan de forma condicional proteínas.

Resumen

La proteína GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX) modificada usada comprende una modificación 289S y es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1. En una realización, la proteína FX comprende una modificación 289S y al menos una modificación seleccionada del grupo que consiste en 79S, 9K, 136L, 211R, y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína FX, donde la proteína FX comprende una serina en la posición 289 y donde la proteína FX es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1. En una realización específica, el ácido nucleico es a.C. En una realización, se proporciona un vector de expresión o un vector dirigido que comprende el ácido nucleico. En una realización, el ácido nucleico del vector dirigido comprende un intrón. En una realización, el ácido nucleico del vector dirigido comprende un ADNc que codifica la proteína FX modificada. En una realización específica, el vector dirigido comprende una secuencia dirigida que dirige al vector hacia un locus en un genoma humano, de primate no humano, de hámster, de ratón o de rata.

En un aspecto, se proporciona una célula que es capaz de fucosilar una glicoproteína, donde la célula comprende un gen de la GDP-4-ceto-6-desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX) modificada que tiene una modificación que codifica una proteína FX que es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1 y que comprende una serina en la posición 289, y donde no más del 1 % de la glicoproteína está fucosilada cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente de fucosa externa. En una realización, la célula no expresa o no expresa sustancialmente una proteína FC salvaje. En una realización específica, la célula exhibe no más del 1 %, no más del 5 %, no más del 2 % o no más del 1 % de la proteína FX salvaje en comparación con una célula que carece de la modificación.

En una realización, la célula que comprende la proteína FX modificada o el ácido nucleico expresa una glicoproteína que contiene Fe, donde la célula fucosila no más del 9 %, no más del 95 %, no más del 96 %, no más del 97 %, no más del 98 % o no más del 99 % de la glicoproteína en comparación con una célula que carece de la modificación.

En un aspecto, la célula proporcionada comprende una modificación en un ácido nucleico que codifica una proteína FX o que expresa una proteína FX con una modificación, donde la célula carece o carece sustancialmente de la capacidad para fucosilar una glicoproteína a una primera temperatura, pero no carece o no carece sustancialmente de la capacidad para fucosilar la glicoproteína a una segunda temperatura.

En una realización, la primera temperatura es de aproximadamente 37 °C. En una realización, la segunda temperatura es de aproximadamente 34 °C.

En una realización, la capacidad para fucosilar la glicoproteína a la primera temperatura es de aproximadamente 1 % a aproximadamente 1 % de la capacidad para fucosilar la glicoproteína exhibida por una célula que carece de la

modificación. En una realización, la capacidad para fucosilar la glicoproteína a la segunda temperatura es de aproximadamente 7 %, 8 %, 9 % o más en comparación con la capacidad para fucosilar la glicoproteína por una célula que carece de la modificación.

La modificación de la proteína FX usada comprende una sustitución de aminoácido que es 289S y que puede proporcionarse en combinación con cualquiera de las siguientes sustituciones de aminoácidos: 9K, 211R, 136L, 79S.

En una realización, la proteína FX procede de un primate no humano (p. ej., Macaca mulatta), un ser humano, un ratón (p. ej., Mus musculus), una rata (p. ej., Rattus norvegicus) o un hámster (p. ej., hámster chino o Cricetulus griseus). En una realización específica, la proteína FX comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 1, SEC ID N° 3, SEC ID N° 4, SEC ID N° 5 o SEC ID N° 6, y porta una o más modificaciones (p. ej., sustituciones de aminoácidos) como se describe en el presente documento. La proteína FX tiene una identidad de secuencia de al menos un 9 % con la SEC ID N° 1.

El ácido nucleico codifica una proteína FX que es al menos un 9 % o al menos un 95 % idéntica a la secuencia de la SEC ID N° 1 y comprende 289S y también puede comprender uno o más de los siguientes aminoácidos en una o más de las siguientes posiciones: 79S, 9K, 136L, 211R y 289S, los siguientes aminoácidos en una o más de las posiciones siguientes: 79S, 9K, 136L y 211R.

En una realización, el ácido nucleico codifica una FX que es al menos un 95 % idéntica a la FX de la SEC ID N° 2. En una realización específica, la FX tiene la secuencia de aminoácidos de la SE ID N°2.

[Eliminado]

En una realización, la célula expresa una enzima de la ruta de fucosilación salvaje seleccionado del grupo que consiste en GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD), una GDP-(3-L-fucosa pirofosforilasa (GFPP) salvaje, una a-1,6- fucolisiltransferasa (FUT8) salvaje y una combinación de los mismos.

En un aspecto, la célula es una célula de mamífero capaz de fucosilar una proteína, donde la célula comprende una modificación en un gen FX, donde la modificación tiene como resultado una reducción de al menos un 9 % en la capacidad de la célula para fucosilar una proteína en comparación con una célula que carece de la mutación o alteración.

En una realización, la reducción es de aproximadamente 9 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % en comparación con una célula de mamífero que no contiene la modificación.

En una realización, la comparación de una célula modificada de acuerdo con la invención y una célula que no comprende la modificación se realiza en las mismas condiciones o esencialmente en las mismas condiciones... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una célula que es capaz de fucosilar una glicoprotefna, donde la célula comprende un gen de la GDP-4-ceto-6- desoxi-manosa-3,5-epimerasa-4-reductasa (FX) modificada que tiene una modificación que codifica una proteína FX que es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1 y que comprende una serina en la posición 289, y donde no más del 1 % de la glicoproteína está fucosilada cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente de fucosa externa.

2. La célula de la reivindicación 1, donde el gen de FX comprende además una modificación que codifica una proteína FX que tiene un aminoácido en una posición específica seleccionada del grupo que consiste en una serina en la posición 79, una lisina en la posición 9, una leucina en la posición 136, una arginina en la posición 211 y una combinación de los mismos.

3. La célula de la reivindicación 1, donde:

(a) la proteína FX es al menos un 95 % idéntica a la SEC ID N° 1 y comprenden una serina en la posición 289;

(b) la célula es una célula de ovario de hámster chino (CHO); o

(c) la proteína FX es una proteína de hámster, ratón, rata, mono o ser humano.

4. La célula de la reivindicación 1, donde la célula expresa una glicoproteína que comprende una región CH2 de ¡nmunoglobulina y una región CH3 de ¡nmunoglobulina.

5. La célula de la reivindicación 4, donde la glicoproteína es un anticuerpo.

6. La célula de la reivindicación 4, donde la no más del 6 % de la glicoproteína está fucosilado cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa.

7. La célula de la reivindicación 6, donde la no más del 2 % de la glicoproteína está fucosilado cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa.

8. La célula de la reivindicación 1, donde la célula fucosila:

(a) al menos un 7 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 34 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa; o

(b) al menos un 9 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 34 °C en ausencia de una fuente externa de fucosa.

9. La célula de la reivindicación 1, donde la célula fucosila:

(a) al menos un 7 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en presencia de una fuente externa de fucosa; o

(b) al menos un 9 % de la glicoproteína cuando la célula se cultiva a una temperatura de 37 °C en presencia de una fuente externa de fucosa.

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína FX, donde la proteína FX comprende una serina en la posición 289 y donde la proteína FX es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1.

11. La molécula de ácido nucleico aislada de la reivindicación 1, donde:

(a) la proteína FX codificada por la secuencia de nucleótidos que comprende además una serina en la posición 79 o una lisina en la posición 9 o una leucina en la posición 136 o una arginina en la posición 211 o una combinación de los mismos; o

(b) la proteína FX codificada por la secuencia de nucleótidos es al menos un 95 % idéntica a la SEC ID N° 1.

12. La célula de la reivindicación 1, que además comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un gen de ¡nmunoglobulina.

13. Un método para producir una glicoproteína con fucosilación reducida, que comprende:

cultivar una célula de mamífero que comprende un gen de FC que codifica una proteína FX con una serina en la posición 289 y donde la proteína FX es al menos un 9 % idéntica a la SEC ID N° 1, a una temperatura de 37 °C y en ausencia de una fuente de fucosa externa, donde la célula expresa una glicoproteína que comprende una región CH2 de ¡nmunoglobulina y una región CH3 de ¡nmunoglobulina, y asilar la glicoproteína del cultivo.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el gen de FX codifica una proteína FX que tiene un aminoácido en una posición específica seleccionada de una serina en la posición 79, una lisina en la posición 9,

una leucina en la posición 136, una arginina en la posición 211 y una combinación de los mismos.

15. El método de la reivindicación 13, SEC ID N° la glicoproteína es un anticuerpo.