Un método de cultivo in vitro de células de islotes pancreáticos de mamíferos para producir células precursoras endocrinas,

que comprende las etapas:

(A) aislar las células de los islotes pancreáticos de mamíferos a partir de un páncreas extirpado de un donante;

(B) cultivar en serie las células de la etapa (a) en un medio que no contiene suero o extractos de órganos para expandir las células, en donde el medio comprende insulina, transferrina, triyodotironina (T3) , etanolamina y/o ofosforil-etanolamina, factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona, selenio, adenina, cloruro de estroncio, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, inhibidor de tripsina de soja (SBTI) y glucosa; y, (C) continuar con el cultivo de las células para producir células precursoras endocrinas, donde células precursoras endocrinas expresan los marcadores pdx 1 y nestina.

Células cultivadas de islotes pancreáticos Campo de la invención La presente invención pertenece al campo de la diabetes y de los islotes pancreáticos y más particularmente se refiere a un método in vitro de producción de células progenitoras/precursoras endocrinas de células de islotes pancreáticos que tienen el potencial de diferenciarse en células beta productoras de insulina funcionales.

Antecedentes de la invención

La diabetes mellitus es un problema de salud importante, que afecta a aproximadamente 16 millones de personas en los Estados Unidos. La pérdida de suficiente producción de insulina por las células beta de los islotes pancreáticos es una característica tanto de la diabetes del tipo I como de la diabetes tipo II. La reposición de estas células mediante regeneración o trasplante podría ofrecer tratamiento a los diabéticos para toda la vida. Sin embargo, un problema importante en la implementación del tratamiento es la falta de tejido suficiente de células de islotes para trasplante. Se ha informado que en los EE.UU. se dispone solamente de 3.000 donantes humanos de páncreas cada año, sin embargo se diagnostican más de 35.000 nuevos casos de diabetes tipo I cada año. Hay una necesidad continua de un método de tratamiento del paciente diabético mediante el trasplante de células que funcionen de manera similar a las células de los islotes pancreáticos productoras de insulina.

La solicitud internacional de patente WO01/77300 describe el aislamiento de células progenitoras pancreáticas procedentes de páncreas fetal utilizando un medio sin suero. El medio utilizado en WO01/77300 comprende sin embargo un extracto de órgano Compendio de la invención La invención es un método in vitro según la reivindicación 1 para el cultivo de células de los islotes pancreáticos a partir de un páncreas de mamífero, preferentemente de un páncreas humano, y normalmente un páncreas adulto, para producir células precursoras endocrinas que expresan marcadores de progenitores de islotes, pdx1 y nestina. Las células progenitoras / precursoras endocrinas se cultivan en un medio de cultivo definido durante múltiples pases para expandir el número de células. A medida que las células se expanden, se vuelven en más proliferativas y menos diferenciadas. Cuando se obtiene un número suficiente de células, la composición de células producida por el método de la invención que comprende las células progenitoras / precursoras endocrinas, se puede utilizar para hacer implantes de células vivas para el tratamiento de uno o más pacientes con diabetes deficiente en insulina.

Breve descripción de las figuras La Figura 1 muestra la tabla y el gráfico de la duplicación acumulada de la población de células derivadas de islotes humanos H297.

La Figura 2 muestra el análisis de expresión de Pdx1, nestina e insulina por RT-PCR en células derivadas de islotes humanos H297.

Descripción detallada

Una característica de la invención es un método in vitro de cultivo de células de islotes pancreáticos de mamífero para producir células precursoras endocrinas que comprende las etapas de:

(a) aislar células de islotes pancreáticos de mamíferos a partir de un páncreas extirpado de un donante;

(b) cultivar en serie las células de la etapa (a) en un medio que no contenga suero o extractos de órgano para expandir las células, donde el medio comprende insulina, transferrina, triyodotironina (T3) , etanolamina y/o ofosforil-etanolamina, factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona, selenio, adenina, cloruro de estroncio, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, inhibidor de tripsina de soja (SBTI) y glucosa; y,

(c) continuar con el cultivo de las células para producir células precursoras endocrinas, donde los precursores de células endocrinas expresan los marcadores Pdx1 y nestina.

Las células utilizadas para iniciar la composición de células utilizadas en el método de la invención se obtienen a partir de islotes pancreáticos de mamíferos, preferentemente de islotes pancreáticos humanos, y generalmente de células de islotes pancreáticos adultos. Siguiendo los métodos de cultivo descritos en la invención, estas células iniciales de los islotes pancreáticos se cultivan en un medio de cultivo definido y se expanden mediante pases seriados en el medio de cultivo definido, dando como resultado células progenitoras / precursoras endocrinas menos diferenciadas que expresan los marcadores de las células progenitoras de los islotes, PDX-1 y nestina. Las células progenitoras / precursoras endocrinas tienen el potencial de diferenciarse en células beta funcionales que producen insulina. Los términos, "células progenitoras / precursoras endocrinas", "células progenitoras endocrinas", y "células precursoras endocrinas " tal y como se utilizan en la presente invención hacen referencia a células obtenidas a partir de islotes pancreáticos de mamíferos que son capaces de ser cultivadas en pases seriados en el medio de cultivo definido, que son menos diferenciadas que las células iniciales antes del cultivo, y que expresan los marcadores Pdx1 y nestina. En la composición de células producida por el método de la invención, las células progenitoras endocrinas se diferencian convirtiéndose en células beta funcionales productoras de insulina cuando se implantan en un paciente para el tratamiento de diabetes por deficiencia de insulina.

El medio utilizado para el cultivo de las células pancreáticas iniciales y los pases seriados para su transformación en células precursoras endocrinas tiene una constitución química definida, en el sentido de que no contiene suero o extractos de órganos. El medio permite cultivar y mantener las células precursoras endocrinas durante varios pases para expandir el número de células de la población. La capacidad de ampliar el número de células es beneficiosa cuando el tejido pancreático humano es limitado. Un beneficio adicional es que se pueden producir varias composiciones de células terapéuticas a partir de un páncreas único.

El medio de cultivo definido se compone de una base de nutrientes que suele completarse además con otros componentes. El experto en la técnica puede determinar la base de nutrientes apropiada según las técnicas de cultivo de células animales, que tenga expectativas razonables de éxito en la producción de la construcción de los tejidos de la invención. Están disponibles en el mercado muchas fuentes de nutrientes útiles para poner en práctica la presente invención. Estas incluyen fuentes de nutrientes disponibles en el mercado que suministran sales inorgánicas, una fuente energía, aminoácidos y vitaminas del grupo B, como son el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) ; el Medio Mínimo Esencial (MEM) ; M199; RPMI 1640; el medio de Dulbecco modificado de Iscove (EDMEM) . El medio mínimo esencial (MEM) y M 199 requieren suplementos adicionales con precursores de los fosfolípidos y aminoácidos no esenciales ácidos. En el mercado están disponibles mezclas ricas en vitaminas que proporcionan aminoácidos adicionales, ácidos nucleicos, cofactores de enzimas, precursores de fosfolípidos, y sales inorgánicas como son F-12 de Ham, F-10 de Ham, NCTC 109, y NCTC 135. Aunque en concentraciones diferentes, todos los medios básicos proporcionan una fuente de nutrientes básica para las células en forma de glucosa, aminoácidos, vitaminas e iones inorgánicos, junto con otros componentes básicos de los medios.

El medio base preferido de la invención comprende una base de nutrientes del medio modificado de Eagle de Dulbecco (DMEM) sin calcio o bajo en calcio, sin glucosa, magnesio, y con L-glutamina 4, 0 mM, sin piruvato de sodio, y con F-12 de Ham (con glucosa 5 mM) en una proporción de 3 a 1. La concentración final de glucosa de la base se ajustó entre 2 mM y 8 mM aproximadamente, más preferiblemente entre 3 mM y 7 mM aproximadamente, y más preferiblemente a aproximadamente 5 mM.

El medio base se complementa con componentes como aminoácidos, factores de crecimiento y hormonas. El medio de cultivo definido para el cultivo de células según el método de la invención se describe en la Patente de Estados Unidos N º 5.712.163 de Parenteau y en la publicación internacional PCT WO 95/31473. En la técnica se conocen otros medios, tales como los descritos por Ham y McKeehan, en Methods in Enzymology, 58:44-93 (1979) , u otros medios adecuados de constitución química definida, descritos por Bottenstein et al., en Methods in Enzymology, 58:94-109 (1979) .

En la realización preferida, el medio base se complementa con los... [Seguir leyendo]

1. Un método de cultivo in vitro de células de islotes pancreáticos de mamíferos para producir células precursoras endocrinas, que comprende las etapas:

(A) aislar las células de los islotes pancreáticos de mamíferos a partir de un páncreas extirpado de un donante;

(B) cultivar en serie las células de la etapa (a) en un medio que no contiene suero o extractos de órganos para expandir las células, en donde el medio comprende insulina, transferrina, triyodotironina (T3) , etanolamina y/o ofosforil-etanolamina, factor de crecimiento epidérmico, hidrocortisona, selenio, adenina, cloruro de estroncio, piruvato de sodio, aminoácidos no esenciales, inhibidor de tripsina de soja (SBTI) y glucosa; y, (C) continuar con el cultivo de las células para producir células precursoras endocrinas, donde células precursoras endocrinas expresan los marcadores pdx 1 y nestina.