Células anucleadas diferenciadas y método para preparar las mismas.

Método de preparación de una pluralidad de células anucleadas que comprende: cultivar células madre inmortalizadas condicionalmente en presencia de un agente para inducir la diferenciación a eritrocitos; en el que el agente es IL-3 y EPO;

en el que las células madre inmortalizadas condicionalmente se generaron mediante:

a. transfección de una pluralidad de células madre con un primer vector que comprende: una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de MYC;

b. transfección de las células madre con un segundo vector retroviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para Bcl-2

, Bcl-X, o una combinación de los mismos; y

c. cultivo de las células madre con IL-3, IL-6, factor de células madre, trombopoyetina, ligando de Flt3, o una combinación de los mismos;

y en el que la actividad de la molécula de MYC se ha suprimido antes de la diferenciación.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/051242.

Solicitante: Taiga Biotechnologies, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 12635 East Montview Boulevard Aurora, CO 80045-7336 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: REFAELI, YOSEF, TURNER,Brian Curtis.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N5/00 (Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00))

PDF original: ES-2525411_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Células anucleadas diferenciadas y método para preparar las mismas Antecedentes de la invención

Las células anucleadas incluyen, pero no se limitan a, eritrocitos y trombocitos. Los eritrocitos y trombocitos se derivan de la diferenciación de células madre hematopoyéticas.

Sumario de la invención

En el presente documento, en determinadas realizaciones, se da a conocer un método de preparación de una pluralidad de células anucleadas que comprende: cultivar células madre inmortalizadas condicionalmente en presencia de al menos una citocina que dirige la diferenciación hacia una célula anucleada; en el que las células madre inmortalizadas condicionalmente se generan mediante: (a) transfección de una pluralidad de células madre con un primer vector que comprende: una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de MYC; (b) transfección de las células madre con un segundo vector retroviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para Bcl-2, Bcl-X, o una combinación de los mismos; y (c) cultivo de las células madre con IL-3, IL-6, factor de células madre, trombopoyetina, ligando de Flt3, o una combinación de los mismos; y en el que la actividad de la molécula de Myc se ha suprimido antes de la diferenciación. En algunas realizaciones, la citocina que dirige la diferenciación hacia una célula anucleada es IL-3, EPO, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la molécula de MYC es c-Myc, 1-Myc, n-Myc, s-Myc, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el primer vector comprende además el dominio de unión a hormonas del receptor de estrógenos humano. En algunas realizaciones, el método comprende además inducir la traslocación de la molécula de Myc a un núcleo. En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la pluralidad de células madre con: estradiol (E2), 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT), o ambos. En algunas realizaciones, el primer vector, el segundo vector, o tanto el primer vector como el segundo vector son el virus de células madre murinas (MSCV), o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el primer vector, el segundo vector, o tanto el primer vector como el segundo vector son MSCV-(IRES)-GFP, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el primer vector, el segundo vector, o tanto el primer vector como el segundo vector son MSCV-(IRES)-GFP, y comprende además el elemento regulador de ARN del virus de la hepatitis B de la marmota (WRE).

En el presente documento, en determinadas realizaciones, se da a conocer un método de producción de una pluralidad de células anucleadas, que comprende: cultivar células madre inmortalizadas condicionalmente en presencia de al menos una citocina que dirige la diferenciación hacia una célula anucleada; en el que las células madre inmortalizadas condicionalmente se generan mediante: (a) puesta en contacto de una pluralidad de células madre con un primer péptido sintetizado de manera exógena que comprende: una molécula de MYC que se trasloca a un núcleo; (b) puesta en contacto de las células madre con un segundo péptido sintetizado de manera exógena que comprende: Bcl-2, BCL-X, o una combinación de los mismos; y (c) cultivo de las células madre con IL-3, IL-6, factor de células madre, trombopoyetina, ligando de Flt3, o una combinación de los mismos; y en el que el primer péptido se elimina del contacto con las células madre inmortalizadas condicionalmente antes de la diferenciación. En algunas realizaciones, el primer péptido comprende además el dominio de unión a hormonas del receptor de estrógenos humano. En algunas realizaciones, el primer péptido, el segundo péptido, o tanto el primer péptido como el segundo péptido comprenden una secuencia transportadora. En algunas realizaciones, la primera proteína, la segunda proteína, o tanto la primera proteína como la segunda proteína comprenden una secuencia TAT. En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la pluralidad de células madre con: estradiol (E2), 4-hidroxitamoxifeno (4-OFIT), o ambos.

En el presente documento, en determinadas realizaciones, se da a conocer un método de preparación de una pluralidad de células anucleadas, que comprende: (a) transfectar una pluralidad de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) con un primer vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de MYC; (b) transfectar la pluralidad de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) con un segundo vector gamma-retroviral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para Bcl-2, Bcl-X, o una combinación de los mismos; (c) cultivar la pluralidad de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) con IL-3, IL- 6, factor de células madre, trombopoyetina, ligando de Flt3, o una combinación de los mismos; (d) suprimir la actividad de la molécula de Myc; y (c) cultivar las células madre inmortalizadas condicionalmente (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) en presencia de al menos una citocina que dirige la diferenciación hacia una célula anucleada. En algunas realizaciones, la citocina que dirige la diferenciación hacia una célula anucleada es IL-3, EPO, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la molécula de MYC es c-Myc, 1-Myc, n-Myc, s-Myc, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, el primer vector comprende además el dominio de unión a hormonas del receptor de estrógenos humano. En algunas realizaciones, el método comprende además inducir la traslocación de la molécula de Myc a un núcleo. En algunas realizaciones, el método comprende además poner en contacto la pluralidad de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) con: estradiol (E2), 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT), o ambos. En algunas realizaciones, el primer vector, el segundo vector, o tanto el primer vector como el segundo vector son el virus de células madre murinas (MSCV), o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el primer vector, el segundo vector, o tanto el primer vector como el segundo vector son MSCV-(IRES)-GFP, o un derivado del mismo.

En algunas realizaciones, el primer vector, el segundo vector, o tanto el primer vector como el segundo vector son MSCV-(IRES)-GFP, y comprenden además el elemento regulador de ARN del virus de la hepatitis B de la marmota (WRE).

En el presente documento, en determinadas realizaciones, se da a conocer un método de producción de una pluralidad de células anucleadas (por ejemplo, células madre hematopoyétlcas), que comprende: (a) poner en contacto una pluralidad de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) con: (i) un primer péptido sintetizado de manera exógena que comprende: una molécula de MYC que se trasloca a un núcleo; y (¡i) un segundo péptido sintetizado de manera exógena que comprende: Bcl-2, BCL-X, o una combinación de los mismos; (b) cultivar la pluralidad de células madre (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) con IL-3, IL-6, factor de células madre, trombopoyetina, ligando de Flt3, o una combinación de los mismos; (c) eliminar el primer péptido; y (d) cultivar las células madre inmortalizadas condicionalmente (por ejemplo, células madre hematopoyéticas) en presencia de al menos una citocina que dirige la diferenciación hacia una célula anucleada. En algunas realizaciones, el primer péptido comprende además el dominio de unión a hormonas del receptor de estrógenos humano. En algunas realizaciones, el primer péptido, el segundo péptido, o tanto el primer péptido como el segundo péptido comprenden una secuencia transportadora. En algunas realizaciones, la primera proteína, la segunda proteína, o tanto la primera proteína como la segunda proteína comprenden una secuencia TAT.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

Método de preparación de una pluralidad de células anucleadas que comprende: cultivar células madre Inmortalizadas condicionalmente en presencia de un agente para Inducir la diferenciación a eritrocitos; en el que el agente es IL-3 y EPO;

en el que las células madre inmortalizadas condicionalmente se generaron mediante:

a. transfecclón de una pluralidad de células madre con un primer vector que comprende: una secuencia de ácido nucleico que codifica para una molécula de MYC;

b. transfecclón de las células madre con un segundo vector retrovlral que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para Bcl-2, Bcl-X, o una combinación de los mismos; y

c. cultivo de las células madre con IL-3, IL-6, factor de células madre, trombopoyetlna, ligando de Flt3, o una combinación de los mismos;

y en el que la actividad de la molécula de MYC se ha suprimido antes de la diferenciación.

Método según la reivindicación 1, en el que el primer vector comprende además el dominio de unión a hormonas del receptor de estrógenos humano.

Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además inducir la traslocación de la molécula de Myc a un núcleo.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el primer vector, el segundo vector, o tanto el primer vector como el segundo vector son el virus de células madre murinas (MSCV), o un derivado del mismo; opcionalmente MSCV-(IRES)-GFP o un derivado del mismo; opcionalmente MSCV-(IRES)-GFP que comprende además el elemento regulador de ARN del virus de la hepatitis B de la marmota (WRE).

Método de producción de una pluralidad de células anucleadas, que comprende: cultivar células madre inmortalizadas condicionalmente en presencia de un agente para inducir la diferenciación a eritrocitos; en el que el agente es IL-3 y EPO;

en el que las células madre inmortalizadas condicionalmente se generaron mediante:

a. puesta en contacto de una pluralidad de células madre con un primer péptldo sintetizado de manera exógena que comprende: una molécula de MYC que se trasloca a un núcleo;

b. puesta en contacto de las células madre con un segundo péptido sintetizado de manera exógena que comprende: Bcl-2, BCL-X, o una combinación de los mismos; y

c. cultivo de las células madre con IL-3, IL-6, factor de células madre, trombopoyetlna, ligando de Flt3, o una combinación de los mismos;

y en el que el primer péptido se elimina del contacto con las células madre inmortalizadas condlclonalmente antes de la diferenciación.

Método según la reivindicación 5, en el que el primer péptido, el segundo péptido, o tanto el primer péptido como el segundo péptido comprenden una secuencia transportadora.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en el que la primera proteína, la segunda proteína, o tanto la primera proteína como la segunda proteína comprenden una secuencia TAT o una secuencia VPR.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la molécula de MYC es c-Myc, l-Myc, n-Myc, s-Myc, v-Myc o una combinación de los mismos.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además poner en contacto la pluralidad de células madre con: estradiol (E2), 4-hidroxltamoxifeno (4-OHT), o ambos.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que las células madre Inmortalizadas condicionalmente comprenden además uno o más polipéptidos de Interés.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-1, en el que la molécula de MYC es MYC-ER.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-1, en el que la molécula de MYC es TAT-MYC.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-12, en el que la molécula de Bcl-2 es TAT-Bcl-2.

Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el segundo vector retrovlral comprende una

secuencia de ácido nucleico que codifica para Bcl-2.