Cebadores para detectar Plasmodium.

Procedimiento para detectar o identificar una infección con el género Plasmodium y/o uno o más de entrePlasmodium falciparum,

Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale en una muestra;

comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (a) a (c):

a) extraer ADN de la muestra;

b) amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium utilizando elprocedimiento LAMP haciendo reaccionar el ADN extraído en la etapa (a) en una mezcla de reacción quecontiene una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra y un conjunto de cebadores específicos desecuencia; y

c) detectar o identificar la presencia o ausencia de un producto amplificado del género Plasmodium, amplificadoen la etapa (b), en el que el conjunto de cebadores específicos de secuencia es un conjunto deoligonucleótidos que contiene las secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6 paraamplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium;y opcionalmente detectar o identificar la presencia o ausencia de un producto amplificado de uno o más de entrePlasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale, amplificado en la etapa (b),en el que el conjunto de cebadores específicos de secuencia es un conjunto de oligonucleótidos que contienesecuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6 para amplificar una región particular de unasecuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium y uno o más de un conjunto de cebadores, que comprende unconjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 7 a 12 paraamplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium falciparum, un conjunto decebadores, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleicorepresentadas por SEC ID nº: 13 a 18, SEC ID nº: 31 a 36 o SEC ID nº: 37 a 42 para amplificar una región particularde una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium vivax, un conjunto de cebadores, que comprende unconjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 19 a 24 paraamplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium malariae y un conjunto decebadores, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleicorepresentadas por SEC ID nº: 25 a 30 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18Sde Plasmodium ovale.

Cebadores para detectar Plasmodium.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores que puede detectar/identificar de manera exacta y rápida parásitos de malaria del género Plasmodium en zonas endémicas de malaria, a un procedimiento para detectar e identificar los mismos y a un kit de detección de los mismos.

Antecedentes de la técnica En muchos países en los que son endémicos parásitos de la malaria, el diagnóstico rápido y exacto de parásitos de la malaria presenta desafíos. De las cuatro especies de Plasmodium, P. falciparum, que puede ser mortal, debe identificarse inmediatamente y distinguirse de las otras especies de Plasmodium que producen la enfermedad en seres humanos (Moody, A., Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002) : 66-78) .

Además, en la mayoría de las zonas endémicas de malaria aparecen infecciones que implican dos o más de estas especies; estas infecciones mixtas a menudo discurren sin reconocerse o subestimadas (Zimmerman, P.A., et al., Trends Parasitol. 20 (2004) : 440-447) . No poder detectar una infección mixta podría dar como resultado un tratamiento inadecuado, y puede dar como resultado una enfermedad grave (Mayxay, M., et al., Trends Parasitol. 20 (2004) : 233-240) . Hay, por tanto, una urgente necesidad de desarrollar procedimientos de diagnóstico de la malaria que puedan funcionar en zonas endémicas de manera fácil, rápida, altamente sensible y específica de especie.

Actualmente, el procedimiento de diagnóstico fácil para la malaria es el examen microscópico de frotis de sangre. Dada una alta densidad de parásitos, tal microscopía presenta una sensibilidad y especificidad relativamente altas y proporciona una determinación de la especie y del estadio de desarrollo. Sin embargo, en zonas endémicas en las que la densidad de parásitos es generalmente baja, este procedimiento es laborioso, requiere expertos bien entrenados y puede dar como resultado que se retrase la terapia.

Para mejorar la velocidad y precisión del diagnóstico de la malaria en regiones en las que no está disponible el diagnóstico de laboratorio convencional, los investigadores han desarrollado pruebas de diagnóstico rápidas (RDT) para la malaria basadas en inmunorreacción (Moody, A. Clin. Microbiol. Rev. 15 (2002) : 66-78; Ndao, M., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004) : 2694-2700) . Sin embargo, la sensibilidad varía entre productos (Murray, C. K., et al., Trop. Med. Int. Health. 8 (2003) : 876-883) , y sólo está disponible un producto específico de especie para P. falciparum. Se requieren tiempos de observación muy largos y considerable experiencia para el diagnóstico correcto mediante microscopía en varias circunstancias: cuando la parasitemia es baja, durante una infección mixta, tras tratamiento farmacológico y durante la fase crónica de la infección. Por tanto, esta situación puede conducir a resultados falsos negativos o a un diagnóstico de especie no fiable (Coleman, R., et al., Thailand. Malar. J. 14 (2006) : 121) .

Posteriormente, se desarrollaron procedimientos de biología molecular basados en amplificación del ADN, tales como PCR anidada y PCR cuantitativa en tiempo real, para el diagnóstico de la malaria. En comparación con la microscopía, estos procedimientos han demostrado superior sensibilidad y mayor especificidad para infecciones mixtas (Kimura, K., et al., Parasitol. Int. 46 (1997) : 91-95; Perandin, F., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004) : 12141219; Rougemont, M., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004) : 5636-5643; Singh, B., et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 60 (1999) : 687-692; Singh, B., et al., Lancet. 363 (2004) : 1017-1024; Snounou, G., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 58 (1993) : 283-292; Snounou, G., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 61 (1993) : 315-320) . Sin embargo, el largo tiempo de respuesta, alto coste y disponibilidad sólo en laboratorios bien equipados hacen que esta tecnología de PCR sea inadecuada para el diagnóstico rutinario en laboratorios hospitalarios y en clínicas in situ de zonas endémicas (Hanscheid, T., y Grobusch, M. P., Trends Parasitol. 18 (2002) : 395-398) .

Con respecto a la detección de la malaria, los ejemplos 8 y 10 en el documento de patente 1 dan a conocer un procedimiento de extracción de ácidos nucleicos de muestras de sangre y de realización de PCR anidada para detectar cuatro especies de Plasmodium. El ejemplo 8 da a conocer cada secuencia de cebador directo y cebador inverso, que son diferentes de las secuencias de cebadores de la presente invención (documento de patente 1) .

La publicación de patente de los documentos de patente 2 y 4 da a conocer procedimientos para detectar una o múltiples especies de infección por malaria basándose en un procedimiento de fase sólida o PCR anidada, en el que se utilizan uno o una pluralidad de múltiples tipos de cebadores para detectar clínicamente P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Sin embargo, esos cebadores presentan secuencias de cebadores diferentes a los de la presente invención.

La publicación de patente de los documentos de patente 3 da a conocer un procedimiento para detectar P. falciparum y/o P. vivax, en el que se unen cebadores específicos para P. falciparum y/o P. vivax a un marcador o soportes sólidos. Sin embargo, estas secuencias de cebadores específicos son diferentes de las secuencias oligonucleotídicas de los conjuntos de cebadores de la presente invención.

Machouart et al. describen un procedimiento para detectar el género Plasmodium en muestras de sangre de pacientes mediante amplificación por PCR con el gen de ARNr 18S como diana de amplificación utilizando cebadores específicos del género Plasmodium (véase Machouart M, Bigois-Delemotte L, Ajana F, Brizion M, Biava MF, Collomb J, Fortier B (2006) Development of a PCR Assay Followed by Nonradioactive Hybridization Using Oligonucleotides Covalently Bound to CovaLink NH Microwells for Detection of Four Plasmodium Species in Blood Samples from Humans. J. Clin. Microbiol. 44:3279-3284) .

Das et al. describen los cebadores en 5’ específicos del género Plasmodium AL286 y A1 y los cebadores en 3’ específicos de especie AL290, AL291 y A291 para P. falciparum y AL189 y AL292 para P. vivax que van a utilizarse en la amplificación de secuencias diana de ARNr 18S mediante PCR (véase Das A, Holloway B, Collins WE, Shama VP, Ghosh SK, Sinha S, Hasnain SE, Talwar GP, Lal AA (1995) Species-specific 18S rRNA gene amplification for the detection of P. falciparum and P. vivax malaria parasites. Molecular and Cellular Probes 9:161-165) .

Recientemente, se desarrolló una técnica novedosa, fácil y altamente sensible denominada amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) (Notomi, T., et al., Nucleic Acids Res. 28 (2000) : e63; documento WO 2000/28082) .

LAMP es un procedimiento de amplificación de ácido nucleico que se basa en la síntesis de ADN por desplazamiento de hebra de ciclo automático realizada mediante la ADN polimerasa Bst. Los productos amplificados son estructuras de tallo-bucle con varias secuencias repetidas de la diana, y presentan múltiples bucles.

El principal mérito de este procedimiento es que no se requiere desnaturalización del molde de ADN (Nagamine, K., et al., Clin. Chem. 47 (2001) : 1742-1743) , y por tanto la reacción de LAMP puede realizarse en condiciones isotérmicas (que oscilan entre 60 y 65ºC) . LAMP requiere sólo una enzima y cuatro tipos de cebadores que reconocen seis regiones diana distintas. El procedimiento produce una gran cantidad de producto amplificado, dando como resultado una detección más fácil, tal como detección mediante juicio visual de la turbidez o fluorescencia de la mezcla de reacción (Mori, Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (2001) : 150-154) . Se conocen LAMP en las que se utiliza una sustancia fluorescente tal como fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína (FITC) , Xrodamina (ROX) o similar para medir los valores de polarización de fluorescencia de la mezcla de reacción, y LAMP en las que se utiliza SYBR Green 2, un colorante verde, como intercalador (publicación de patente japonesa no examinada n.º 2002-272475 y documento WO 2002/103053) .

Varios investigadores han notificado procedimientos de LAMP para la identificación rápida de Plasmodium, Tr y panosoma, Babesia, Fusarium, Listeria y Legionella, y han recomendado la utilidad del ensayo de LAMP (Ikadai, H., et al., J. Clin. Microbiol. 42 (2004) : 2465-2469; Kuboki, N., et al., J. Clin. Microbiol. 41 (2003) : 5517-5524; Thekisoe, O., et al., Mol. Biochem. Parasitol. 122 (2002) : 223-236; publicación de patente japonesa no examinada n.º 2005-245257, publicación de patente japonesa no examinada n.º 2007-61061, publicación de patente japonesa no examinada... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para detectar o identificar una infección con el género Plasmodium y/o uno o más de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale en una muestra; comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas (a) a (c) :

a) extraer ADN de la muestra;

b) amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium utilizando el procedimiento LAMP haciendo reaccionar el ADN extraído en la etapa (a) en una mezcla de reacción que contiene una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra y un conjunto de cebadores específicos de secuencia; y

c) detectar o identificar la presencia o ausencia de un producto amplificado del género Plasmodium, amplificado en la etapa (b) , en el que el conjunto de cebadores específicos de secuencia es un conjunto de oligonucleótidos que contiene las secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium;

y opcionalmente detectar o identificar la presencia o ausencia de un producto amplificado de uno o más de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale, amplificado en la etapa (b) , en el que el conjunto de cebadores específicos de secuencia es un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium y uno o más de un conjunto de cebadores, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 7 a 12 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium falciparum, un conjunto de cebadores, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 13 a 18, SEC ID nº: 31 a 36 o SEC ID nº: 37 a 42 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium vivax, un conjunto de cebadores, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 19 a 24 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium malariae y un conjunto de cebadores, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 25 a 30 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium ovale.

2. Procedimiento de detección o identificación según la reivindicación 1, en el que la extracción del ADN de la muestra se lleva a cabo sometiendo a ebullición la muestra que contiene el ADN, y realizando una centrifugación.

3. Procedimiento de detección o identificación según la reivindicación 2, en el que el tiempo de ebullición es de varios minutos a diez y varios minutos.

4. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que, en la etapa

(b) de amplificación de una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium utilizando el procedimiento LAMP, la reacción de amplificación del ADN se realiza a aproximadamente 60ºC durante aproximadamente 1 hora utilizando un baño de agua a temperatura constante o un amplificador especialmente diseñado para LAMP.

5. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que, en la etapa (c) , se detecta o se identifica la presencia o ausencia de un producto de amplificación del género Plasmodium, y/o uno o más de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale utilizando observación visual o un turbidímetro en tiempo real.

6. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se realiza en una zona endémica de malaria.

7. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se detectan

o se identifican infecciones con el género Plasmodium y/o uno o más de entre Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae y Plasmodium ovale simultáneamente o por separado.

8. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se detecta o se identifica una infección con el género Plasmodium utilizando, como conjunto de cebadores específicos de secuencia, un conjunto de cebadores, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene las secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6 para amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium.

9. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se detecta o se identifica una infección con Plasmodium vivax utilizando, como conjunto de cebadores específicos de secuencia,

un conjunto de cebadores para detectar Plasmodium vivax, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 13 a 18, SEC ID nº: 31 a 36 o SEC ID nº: 37 a 42 y que puede amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium vivax.

10. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se detecta o se identifica una infección con Plasmodium malariae utilizando, como conjunto de cebadores específicos de secuencia, un conjunto de cebadores para detectar Plasmodium malariae, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 19 a 24 y que puede amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium malariae.

11. Procedimiento de detección o identificación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se detecta o se identifica una infección con Plasmodium ovale utilizando, como conjunto de cebadores específicos de secuencia, un conjunto de cebadores para Plasmodium ovale, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 25 a 30 y que puede amplificar una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium ovale.

12. Conjunto de cebadores para detectar el género Plasmodium, que comprende un conjunto de oligonucleótidos que contiene las secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6, pudiendo amplificar el conjunto de cebadores una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium.

13. Conjunto de cebadores para detectar el género Plasmodium y/o cualquiera de entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale, que comprende un conjunto de cebadores oligonucleotídicos que contiene las secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 1 a 6, y secuencias de ácido nucleico seleccionadas de entre secuencias de ácido nucleico representadas por SEC ID nº: 7 a 12, SEC ID nº: 13 a 18, SEC ID nº: 31 a 36, SEC ID

nº: 37 a 42, SEC ID nº: 19 a 24 y SEC ID nº: 25 a 30, pudiendo amplificar el conjunto de cebadores regiones particulares de secuencias de genes de ARNr 18S del género Plasmodium y diversas especies de Plasmodium, incluyendo una región particular de una secuencia de gen de ARNr 18S de Plasmodium falciparum.

14. Kit de detección para el género Plasmodium y/o para cualquiera de entre P. falciparum, P. vivax, P. malariae y P.

ovale; que comprende al menos un conjunto de cebadores seleccionado de entre los conjuntos de cebadores definidos en las reivindicaciones 12 y 13, una ADN polimerasa de desplazamiento de hebra, dNTP y un tampón de reacción.

15. Kit de detección según la reivindicación 14, en el que el kit de detección detecta el género Plasmodium y/o P. 35 falciparum, P. vivax, P. malariae y P. ovale, simultáneamente o por separado.