Un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo dicho procedimiento:

amplificar el ácido nucleico usando un cebador oligonucleotídico modificado, en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado comprende un grupo de modificación en uno o más enlaces internucleotídicos; en el que dicho grupo de modificación puede disociarse térmicamente de forma no reversible; y en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado tiene la estructura I siguiente en la que: Nuc es un nucleósido dentro de la secuencia del cebador; U y Z son, de forma independiente, O, S, Se, NR 9 , o CR 9 R 10 ; R 9 y R 10 son cada uno de forma independiente hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, en el que cada uno puede incluir independientemente al menos un sustituyente seleccionado de halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido o un marcador detectable; Y es O, S o Se; W es O, S, S(O), S(O)2, Se, C(O), C(S), C(O)NH, NH o NR 9 ; y Q es un grupo de modificación que comprende uno o más grupos térmicamente escindibles

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para amplificar ácidos nucleicos. En aspectos concretos, la invención proporciona procedimientos para amplificación de ácido nucleico de inicio en caliente.

Antecedentes de la invención

Se proporciona la descripción siguiente para ayudar a los conocimientos del lector. Ninguna información proporcionada

o referencias citadas se admite que sea técnica anterior en la presente invención.

Es probable que la PCR sea el procedimiento más usado en la biología molecular y la biotecnología moderna y se está aplicando rápidamente a las pruebas genéticas, diagnósticas, forenses y de biodefensa. Kolmodin, L.A., y col., Nucleic Acid Protocols, 569-580 (2000); Budowle, B., y col., 301 Science, 1852-53 (2003); Y. Sato, y col., 5 (Suppl. 1) Legal Medicine, S191-5193 (2003); Saldanha, J., y col., 43 J. Medical Virol., 72-76 (1994); Dahiya, R., y col., 44 Biochemistry and Molecular Biology International, 407-15 (1998); y Elnifro, E.M., y col., 13 Clin. Microbiol. Rev., 559-70 (2000). La PCR se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.683.195 y 4.683.202. En cada ciclo del procedimiento de amplificación por PCR hay varias etapas típicas. En primer lugar, la secuencia diana de ADN bicatenario se desnaturaliza térmicamente a temperaturas elevadas (∼95ºC). La primera aparición de desnaturalización se denomina en el presente documento “etapa de desnaturalización inicial.” A esto le sigue la hibridación de un cebador oligonucleotídico sintético a cada hebra a temperaturas menores (∼ 60ºC). A continuación, cada uno de estos cebadores de oligonucleótidos orientados directos e inversos se extiende desde su extremo 3' a una temperatura elevada (∼70ºC) mediante una ADN polimerasa térmicamente estable dependiente de iones de magnesio que incorpora 5'-desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP) y genera pirofosfato (PPi), como se representa en la porción superior de la Figura 1 para el cebador oligonucleotídico directo.

La utilidad del PCR se debe a su capacidad para proporcionar rápidamente amplificaciones diana de ∼106 veces, así como una especificidad elevada, que depende, en parte, de la especificidad de la hibridación del cebador oligonucleotídico. Por tanto, las secuencias de cebadores oligonucleotídicos y su longitud se diseñan para hibridar con únicamente la secuencia diana prevista, a las temperaturas usadas para la hibridación. No obstante, las reacciones de amplificación por PCR normalmente se preparan durante un periodo de minutos u horas a temperaturas ambientales que están muy por debajo del intervalo de temperatura necesario para asegurar la especificidad de la hibridación del cebador oligonucleotídico. En estas condiciones de preparación de muestras menos rigurosas, los cebadores oligonucleotídicos pueden unirse de forma inespecífica a otras secuencias sustancialmente no complementarias e inician potencialmente la síntesis de productos de extensión no deseados, Que se pueden amplificar junto con la secuencia diana. Como ha sido tratado por Chou, Q., y col., la amplificación de secuencias inespecíficas mediante este “cebado incorrecto” puede competir con la amplificación de las secuencias diana deseadas y, por tanto, pueden disminuir significativamente la eficiencia de la amplificación de la secuencia deseada, especialmente para dianas con un número bajo de copias. Chou, Q., y col., 20 Nucleic Acids Res., 1717-23 (1992).

La formación de un “dímero cebador” es otra forma problemática de hibridación inespecífica que, de acuerdo con Chou, Q., y col., es el resultado de la extensión amplificada de dos cebadores de oligonucleótidos a lo largo de otra secuencia sin una secuencia de interferencia significativa. Estos investigadores además han indicado que los dímeros cebadores pueden sufrir una oligomerización amplificada durante la PCR para crear una compleja mezcla de artefactos del cebador oligonucleotídico, cuya calidad a menudo varía de forma inversa con el rendimiento del producto específico de la PCR en amplificaciones con un número bajo de copias.

Aunque los problemas mencionados anteriormente por cebado incorrecto y formación de dímeros cebadores pueden encontrarse en todas las aplicaciones de PCR, estos problemas pueden suponer un reto concreto en los esquemas de PCR analítica de alta sensibilidad, tales como los usados para la detección de agentes infecciosos de transmisión por sangre (Saldanha, J., y col. and Elnifro, E.M., y col.), microbios biopeligrosos (Budowle, B., et al.), genes defectivos o cancerosos ((Dahiya, R., y col.) y ciencias forenses (Budowle, B., y col. And Y. Sato, y col.). Además, hay muchas más probabilidades de que se formen productos de amplificación falsos en la PCR multiplex. Markoulatos, P., y col., 16 J. of Clin. Laboratory Analysis, 47-51 (2002). En la PCR-transcriptasa inversa (RT-PCR), el medio más sensible para la detección de una secuencia de ARN diana es usar un cebador oligonucleotídico específico del gen en la etapa de RT. Zhang, J., y col., 337 Biochem. J., 231-41 (1999); Lekanne Deprez, R.H., y col., 307 Analytical Biochem., 63-69 (2002); y Bustin, SA, y col., J. of Biomolecular Techniques, 155-66 (2004). A la luz de la importancia de estas aplicaciones de alta sensibilidad que requieren una elevada especificidad para evitar consecuencias adversas graves de “falsos negativos” y “falsos positivos”, es crucial disponer de reactivos y protocolos que proporcionen ensayos que estén funcionalmente libres de artefactos debido a cebado incorrecto y formación de dímeros de cebadores.

Se ha investigador una serie de estrategias generales para reducir la amplificación inespecífica por PCR basada en el procedimiento denominado "inicio en caliente” cuyo objetivo es alterar la amplificación indeseada debido al cebado incorrecto y a la formación de dímeros de cebadores oligonucleotídicos en condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente durante la preparación de la muestra. Posteriormente, la amplificación por PCR comienza cuando la mezcla para la reacción de amplificación alcanza una alta rigurosidad, temperaturas “calientes” para “iniciar” la extensión mediada por la polimerasas de los cebadores oligonucleotídicos hibridados únicamente a secuencias diana. Por tanto, la temperatura se usa para desencadenar la extensión enzimática de los cebadores oligonucleotídicos únicamente a temperaturas elevadas cuando la rigurosidad de las condiciones de hibridación del cebador/diana es óptima para especificidad.

Estas estrategias generales para el “inicio en caliente” incluyen el uso de (1) materiales sensibles a la temperatura, tales como ceras como barreras o secuestrantes para controlar la mezcla de los reactivos (Q. Chou, y col. y Tanzer, L.R., y col., 273 Anal. Biochem., 307-310 (1999)); (2) aptámeros oligonucleotídicos (Dang, C., y co., 264 J. Mol. BioI., 268-78 (1996)) o anticuerpos (Eastlund, E., y coI., 2 LifeScience Quarterly, 2-5 (2001) y Mizuguchi, H., y coI., 126 J. Biochem (Tokyo), 762-68 (1999)) que inhiben la función de las ADN polimerasas; (3) el uso de una segunda enzima termoestable, tal como pirofosfatasa (Clark, D.R., y col.., Solicitud de Patente Internacional nº WO 2002088387) para eliminar la supresión mediante adición de pirofosfato (PPi); (4) polimerasas químicamente modificadas con reactivos hidrolíticamente reversibles tales como lisina modificada con ácido citracónico (Birch, D.E., y col., patente de EE.UU. nº 5.773.258) en AmpliTaq Gold (Moretti, T., y coI., BioTechniques, 716-722 (1998) y Saldanha, J., y col.) y (5) constructos de secuencias del cebador oligonucleotídico que no favorecen el cebado incorrecto a temperatura baja, tal como secuencias competidoras (Puskas, L.G., y col., Genome Research, 309-311 (1995) o "cebadores oligonucleotídicos de tipo touch-up and loop-incorporated" (TULlPS-PCR) (Ailenberg, M., y coI., 29(5) BioTechniques, 1018-23 (2000)).

Sumario de la invención

La presente invención proporciona procedimientos para amplificar ácidos nucleicos. Estos procedimientos implican el uso de cebadores oligonucleotídicos y nucleósidos en reacciones de amplificación de ácido nucleico dependientes de la temperatura. En ciertos aspectos, los procedimientos se consiguen mediante el uso de ciertos cebadores oligonucleotídicos modificados que proporcionan utilidad en la amplificación de ácido nucleico. En formas de realización preferidas, los cebadores oligonucleotídicos se modifican con ciertos grupos químicos tales como ésteres.

1. Un procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo dicho procedimiento:

amplificar el ácido nucleico usando un cebador oligonucleotídico modificado,

en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado comprende un grupo de modificación en uno o más enlaces

internucleotídicos; en el que dicho grupo de modificación puede disociarse térmicamente de forma no reversible; y en el que dicho cebador oligonucleotídico modificado tiene la estructura I siguiente

**(Ver fórmula)**

en la que:

Nuc es un nucleósido dentro de la secuencia del cebador;

U y Z son, de forma independiente, O, S, Se, NR9, o CR9R10;

R9 y R10 son cada uno de forma independiente hidrógeno o un grupo hidrocarbilo lineal o ramificado 15 opcionalmente sustituido que tiene de 1-20 átomos de carbono, en el que cada uno puede incluir

independientemente al menos un sustituyente seleccionado de halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido

o un marcador detectable; Y es O, S o Se; W es O, S, S(O), S(O)2, Se, C(O), C(S), C(O)NH, NH o NR9; y Q es un grupo de modificación que comprende uno o más grupos térmicamente escindibles. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que:

(1) dicho grupo de modificación, Q, comprende uno o más grupos de modificación seleccionados del grupo que consiste en -L-X-R1 (Fórmula I) 25 en la que: L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono;

X es O, S(O), S(O)2, C(O), C(S) o C(O)NH; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo,

30 alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

**(Ver fórmula)**

(Fórmula Ia)

en la que

L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y

R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden

incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo,

alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; L-S(O)k-R1 (Fórmula Ib)

en la que: k es un número entero de 0-2; L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden

incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

**(Ver fórmula)**

10 (Fórmula Ic)

en la que:

L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y

cada R1 es, de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 15 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

**(Ver fórmula)**

(Fórmula Id)

20 en la que: L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden

incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; 25 -L-R2 (Fórmula II) en la que:

L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R2 es hidrógeno, ciano o un carbociclo, heterociclo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que tiene entre 5 y 10 átomos;

30 -La-A-Lb-B (Fórmula III) en la que:

La y Lb se seleccionan cada uno de forma independiente de un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono; A es O, S, S(O), S(O)2, Se, CR3R4, NR3, C(O), C(S) o CNR3;

35 B es C(O)R3, C(S)R3, C(O)NR3R4, OR3 o SR3; y

R3 y R4 son, cada uno de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene

40

1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; y

- La-D-Lb-E-Lc (Fórmula IV)

en la que:

La, Lb y Lc se seleccionan cada uno de forma independiente de un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono;

D es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR5;

E es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR6;

F es hidrógeno, C(O)R7, C(S)R7, C(O)NR7R8, OR7 y SR7;

R5 y R6 pueden ser, cada uno de forma independiente, hidrógeno, arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi

o amino, o R5 y R6 pueden cooperar para formar un anillo mono o bicíclico que consiste en 5-10 átomos de carbono e incluye D, R5, R6, E y Lb, a condición de que cuando R5 y R6 cooperan para formar un anillo, n es de 0-2; y R7 y R8 se seleccionan cada uno de forma independiente, del grupo que consiste en arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, ariloxi opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido.

(2) dicho grupo de modificación, Q comprende:

- L-X-R1 (Fórmula I)

en la que:

L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono;

X es 0, S, S(O), S(O)2, C(O), C(S) o C(O)NH; y

R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

(3) dicho grupo de modificación, Q comprende:

**(Ver fórmula)**

(Fórmula Ia)

en la que:

L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y

R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

(4) dicho grupo de modificación, Q comprende: L-S(O)k-R1 (Fórmula Ib)

en la que: k es un número entero de 0-2; L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden

incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

(5) dicho grupo de modificación, Q comprende:

**(Ver fórmula)**

5 (Fórmula Ic)

en la que:

L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y

cada R1 es, de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20

átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que 10 consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

(6) dicho grupo de modificación, Q comprende:

**(Ver fórmula)**

(Fórmula Id)

15 en la que:

L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y

R1 es hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene 1-20 átomos de carbono que pueden

incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo que consiste en halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo; 20 (7) dicho grupo de modificación, Q comprende: -L-R2 (Fórmula II) en la que: L es un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 10 átomos de carbono; y R2 es hidrógeno, ciano o un carbociclo, heterociclo, arilo o heteroarilo opcionalmente sustituido que tiene entre 5 25 y 10 átomos;

(8) dicho grupo de modificación, Q comprende: -La-A-Lb-B (Fórmula III) en la que: La y Lb son cada uno de forma independiente un enlace o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene

30 entre 1 y 8 átomos de carbono; A es O, S, S(O), S(O)2, Se, CR3R4, NR3, C(O), C(S) o CNR3;

B es C(O)R3, C(S)R3, C(O)NR3R4, OR3 o SR3; y

R3 y R4 son, cada uno de forma independiente, hidrógeno o un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene

1-20 átomos de carbono que pueden incluir, opcionalmente, al menos un sustituyente seleccionado del grupo 35 que consiste en hidrógeno, arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, amino, amido, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo, ariloxi y heteroarilo;

(9) dicho grupo de modificación, Q comprende: -La-O-Lb-E-Lc-F (Fórmula IV) en la que:

La, Lb y Lc se seleccionan cada uno de forma independiente de un grupo hidrocarbileno lineal o ramificado que tiene entre 1 y 8 átomos de carbono; D es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR5;

E es O, S, S(O), S(O)2, CR5R6, y NR6;

F es hidrógeno, C(O)R7, C(S)R7, C(O)NR7R8, OR7 y SR7;

R5 y R6 pueden ser, cada uno de forma independiente, hidrógeno, arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi

o amino, o R5 y R6 pueden cooperar para formar un anillo mono o bicíclico que consiste en 5-10 átomos de carbono e incluye D, R5, R6, E y Lb, a condición de que cuando R5 y R6 cooperan para formar un anillo, n es de 0-2; y R7 y R8 se seleccionan cada uno de forma independiente, del grupo que consiste en hidrógeno arilo, alquilo, halo, oxo, hidroxilo, alcoxi, ariloxi, amino, amido, cicloalquilo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, ariloxi opcionalmente sustituido o heteroarilo opcionalmente sustituido.

(10) dicho grupo de modificación, Q, comprende uno o más restos químicos seleccionados del grupo que consiste en 4-oxo-1-hexilo, 4-oxo-1-pentilo, 5-oxo-1-hexilo, 6-oxo-1-heptilo, 1-metil-4-oxo-pentilo, 4-metiltio-1butilo, 5-metil-4-oxohexilo, 1-etil-4-oxo-pentilo, N-(2-hidroxietil)ftalimido, 2-(N-acetil-N-metil)aminoetilo, 2-(Nformil-N-metil)aminoetilo, 2-metil-5-oxo-hexilo, 1,1-dimetil-4-oxo-pentilo, 4-oxo-1-octilo, 4-oxo-1-tetradecilo, 4ºxo-1-eicosamilo y 3-(N-terc-butilcarboxamido)-1-propilo;

(11) dicho cebador oligonucleótido modificado comprende un enlace internucleotídico fosfotriéster;

(12) dicho cebador oligonucleótido modificado comprende dos o más grupos de modificación en la posición n, n-1, n-2, n-3, n-4, n-5 o n-6; en el que n es el enlace internucleotídico 3' terminal;

(13) dicho cebador oligonucleótido modificado comprende dos o más grupos de modificación;

(14) dicha amplificación de ácido nucleico comprende una polimerasa de inicio en caliente;

(15) dicho cebador oligonucleótido modificado es al menos un 90% quiralmente puro; o

(16) dicho cebador oligonucleótido modificado comprende un marcador detectable;

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación comprende la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicha PCR comprende PCR multiplex. 5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que:

(1) una primera diana se amplifica usando cebadores no modificados y una segunda diana se amplifica usando cebadores no modificados; o

(2) una primera diana se amplifica usando uno o más cebadores modificados con un primer grupo de modificación y una segunda diana se amplifica usando uno o más cebadores modificados con un segundo grupo de modificación, en el que dicho primero y segundo grupo de modificación son diferentes.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación comprende transcriptasa inversa (RT).

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha amplificación comprende posteriores reacciones enzimáticas en un único tubo.

8. el procedimiento de la reivindicación 7, en el que dichas posteriores reacciones enzimáticas comprenden la transcriptasa inversa (RT) como primera reacción enzimática y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como segunda reacción enzimática.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha reacción RT comprende amplificar con uno o más cebadores no modificados y dicha reacción PCR comprende amplificar con uno o más cebadores modificados.

10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que dicha reacción RT comprende amplificar con uno o más de un primer cebador modificado y dicha reacción PCR comprende amplificar con uno o más de un segundo cebador modificado.