Caspasa-8 e inflamación, infección y curación de heridas.

El uso de al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) caspasa 8 o una muteina, isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa,derivado circularmente permutado o una sal de los mismos;

(ii) un agente capaz de regular por aumento el nivel y/o la actividad de caspasa-8; y

(iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o actividad de caspasa-8 en la producción de unmedicamento para prevenir y/o tratar la inflamación del hígado, en el que la inflamación sedesarrolla después del daño del hígado.

Caspasa-8 e inflamación, infección y curación de heridas.

Campo de la Invención La presente invención se refiere al papel regulador de la caspasa-8 en la infección por patógeno intracelular, inflamación y curación de heridas.

Antecedentes de la Invención La familia de la caspasa de las cisteína proteasas principalmente se conoce por su papel crucial en la inducción de la apoptosis en células animales (Shi et al., 2002) . Algunas de las caspasas, caracterizadas por una región “prodominio” localizada en dirección 5’ (“upstream”) del resto proteolítico, cumplen un papel de iniciación en la apoptosis. Llegan a estar activas tras la unión de sus prodominios a los receptores que inducen la muerte o a proteínas adaptadoras asociadas con tales receptores, y una vez activadas escinden otros miembros de la familia de la caspasa, de ese modo activándolos. La caspasa-8 (previamente conocida como MACH/FLICE/Mch4) es una caspasa iniciadora activada dentro de los complejos de señalización de los receptores de la familia TNF/NGF, a la cual es reclutada mediante la unión de su prodominio a una proteína adaptadora denominada dominio de muerte asociado a Fas (FADD, del Inglés “Fas-Associated Death Domain”; también denominada MORT1) (Boldin et al., 1996, Muzio et al., 1996, y Wallach et al., 1999) . La activación de la caspasa-8 constituye un evento de iniciación crucial en el mecanismo de muerte apoptótica inducido por estos receptores (la ruta de muerte celular extrínseca) (Varfolomeev et al., 1998) . Tanto la caspasa-8 como la FADD también contribuyen, mediante mecanismos hasta ahora desconocidos, a diversos procesos celulares no apoptóticos (por ejemplo, véase Varfolomeev et al., 1998, Zhag et al., 1998, Walsh et al., 1998, Newton et al., 1998, Alam et al., 1999, Kennedy et al., 1999, Chun et al., 2002, Sakamaki et al., 2002, Salmena et al., 2003, Kang et al., 2004, Su et al., 2005 y Beisner et al., 2005)

Aunque el funcionamiento in vivo de la caspasa-8 ha sido explorado usando un número de modelos de ratón transgénico (Varfolomeev et al., 1998, Salmena et al., 2003, Kang et al., 2004, y Beisner et al., 2005) , aún se conoce muy poco sobre la significancia fisiológica o patofisiológica de la enzima.

En un aspecto, la invención se refiere al uso de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa, derivado circularmente permutado o una sal de los mismos; (ii) un agente capaz de regular por aumento el nivel y/o la actividad de caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o la actividad de caspasa-8, en la producción de un medicamento para prevenir y/o tratar la inflamación del hígado de acuerdo con las reivindicaciones.

La inflamación se desarrolló después del daño del hígado, lo cual puede estar causada por resección de dicho tejido u órgano.

En otra realización adicional el nivel y/o la actividad de caspasa-8 se regula/regulan por disminución en hepatocitos.

En un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de al menos un agente seleccionado entre: (i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa, derivado circularmente permutado o una sal de los mismos; (ii) un agente capaz de regular por aumento el nivel y/o la actividad de caspasa-8; y (iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o la actividad de caspasa-8, en la producción de un medicamento para tratar una infección causada por un patógeno intracelular tal como lo reivindicado.

El patógeno intracelular se selecciona entre: Mycobacteria, Listeria, Leishmania, Legionella y Salmonella.

En una realización adicional de la invención la infección se desarrolla en el hígado que comprende células en las cuales el nivel y/o la actividad de caspasa-8 están regulados por disminución.

La infección se desarrolla en el hígado.

En una realización aún más adicional de la invención las células en las cuales el nivel y/o la actividad de caspasa-8 son hepatocitos están reguladas por disminución.

En una realización aún más adicional de la invención la infección está causada por Listeria, por ejemplo, por Listeria monocytogenes.

En ciertas realizaciones de la invención, el inhibidor de caspasa-8 incluye, pero no se limita a, un ARNm antisentido, ARN de interferencia pequeño, un anticuerpo específico a caspasa-8 y una molécula pequeña inhibidora.

En una realización adicional de la invención, la molécula inhibidora es una pequeña molécula que tiene un peso molecular de 100 a 5.000 daltons, tal como Z-IETD-FMK.

En una realización de la invención, el daño se desarrolla después de la resección del hígado.

En una realización adicional de la invención, se sometió a resección 1/3 del hígado.

En otra realización adicional de la invención, se sometió a resección 2/3 del hígado.

En otra realización adicional de la invención, el inhibidor de caspasa-8 se selecciona entre un ARNm antisentido específico a caspasa-8, ARN de interferencia pequeño específico a caspasa-8, anticuerpo anti caspasa-8 y una molécula pequeña inhibidora de capasa-8.

En otra realización adicional de la invención, la molécula pequeña inhibidora tiene un peso molecular de 100 a 5.000 daltons.

En otra realización adicional de la invención, la molécula pequeña inhibidora es Z-IETD-FMK.

En otra realización adicional de la invención, el inhibidor de la inflamación es un agente capaz de inhibir células inmunes, tales como macrófagos, por ejemplo, células de Kupffer.

En otra realización adicional de la invención, el inhibidor de la inflamación se administra después del inhibidor de caspasa-8.

En otra realización adicional de la invención, el inhibidor de la inflamación se administra en los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 días después de la resección del hígado.

En otra realización adicional de la invención, el inhibidor de la inflamación comprende cloruro de gadolinio.

Breve descripción de las figuras Figs. 1A-1I muestran el efecto de la deficiencia de caspasa-8 en hepatocitos sobre la infección con Listeria monocytogenes. En todas las figuras, las barras negras representan ratones Casp8F/+: Alb-Cre (con hepatocitos normales) y las barras vacías representan ratones Casp8F/-: Alb-Cre (con hepatocitos deficientes en caspasa-8) . (A-C) Organismos de Listeria viables recuperados a partir de bazos e hígados después de la infección subletal a 24 horas (A) , 6 días (B) y 14 días (C) después de la infección. Cada grupo de ratones F/+ o F/- a cada punto de tiempo comprendió al menos cinco ratones. (D-I) Análisis histológico de secciones de hígado de ratones Casp8F/-: Alb-Cre y Casp8F/+: Alb-Cre 6 y 14 días después de la infección con Listeria. (D, E) Tinción con H&E de hígados 6 días después de la infección, demostrando la acumulación de leucocitos en los hígados de ratones Casp8F/-: Alb-Cre (flechas) . (F, G) A 14 días después de la infección los hígados de ratones Casp8F/-: Alb-Cre (G) presentan grandes lesiones necróticas, mientras que los hígados control parecen normales. (F) Aumento (x200) de D a G. (H, I) Inmunotinción con anti-Ki67 de hígados 14 días después de la infección, demostrando grandes números de proliferación de hepatocitos en hígados de Casp8F/-: Alb-Cre pero no en Casp8F/+: Alb-Cre (I; núcleos teñidos de marrón) . Aumento: x100.

Figs. 2A-2E muestran el efecto de la deficiencia de caspasa-8 en hepatocitos sobre la recuperación de PHx: un descenso en la repuesta de crecimiento temprana. (A) Inmunotinción con anti-Ki67 (núcleos teñidos de marrón) del hígado en fases tempranas (día 2) y tardías (día 14) después de PHx. Aumento: x100. (B, C) Proliferación de hepatocito en diversos puntos de tiempo después de 1/3 (B) y 2/3 de PHx (C) , cuantificada al determinar el número de hepatocitos teñidos con anticuerpos frente a Ki67 (o BrdU; recuadro) , tal como se muestra en A, contado en 10 campos de gran aumento. *P<0, 05, **P<0, 01. Al menos se ensayaron ochos ratones a cada punto de tiempo en cuatro experimentos independientes. (D) Cantidades de diversas proteínas asociadas a la transición G1/S (ciclina A, ciclina E, proteína de retinoblastoma fosforilatada) en el hígado a diferentes puntos de tiempo después de 1/3 de PHx (panel izquierdo) , 2/3 de PHx (panel derecho) . Se muestran los resultados representativos de los ensayos llevados a cabo en al menos cuatro ratones a cada punto de tiempo. (E) Panel superior, inmunotinción con anticiclina D1 2 días después de 1/3 de PHx. Aumento: x400. Panel... [Seguir leyendo]

1. El uso de al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) caspasa 8 o una muteina, isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa, derivado circularmente permutado o una sal de los mismos;

(ii) un agente capaz de regular por aumento el nivel y/o la actividad de caspasa-8; y

(iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o actividad de caspasa-8 en la producción de un medicamento para prevenir y/o tratar la inflamación del hígado, en el que la inflamación se desarrolla después del daño del hígado.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el daño está causada por la resección del hígado.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 3, en la que el órgano es el hígado y el nivel y/o la actividad de caspasa-8 está regulado por disminución en hepatocitos.

4. Al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa, derivado circularmente permutado o una sal de los mismos;

(ii) un agente capaz de regular por aumento el nivel y/o actividad de caspasa-8; y

(iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o la actividad de la caspasa-8 para usarse en la prevención y/o el tratamiento de la inflamación del hígado, en el que la inflamación se desarrolla después del daño del hígado.

5. El agente para usarse de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el daño está causada por la resección del hígado.

6. El agente para usarse de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, en la que el órgano es el hígado y el nivel y/o actividad de caspasa-8 está regulada por disminución en hepatocitos.

7. El uso de al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa, derivado circularmente permutado o una sal de los mismos;

(ii) un agente capaz de regular por aumento el nivel y/o actividad de caspasa-8; y

(iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o la actividad de caspasa-8 en la producción de un medicamento para tratar una infección causada por un patógeno intracelular, en el que el patógeno intracelular se selecciona entre Mycobacteria, Listeria, Leishmania, Legionella y Salmonella y en el que la infección se desarrolla en el hígado.

8. Al menos un agente seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) caspasa-8 o una muteina, isoforma, proteína fusionada, derivado funcional, fracción activa, derivado circularmente permutado o una sal de los mismos;

(ii) un agente capaz de regular por aumento el nivel y/o actividad de la caspasa-8; y

(iii) un inhibidor de un inhibidor natural del nivel y/o la actividad de caspasa-8 para usarse en el tratamiento de una infección causada por un patógeno intracelular, en el que el patógeno intracelular se selecciona entre Mycobacteria, Listeria, Leishmania, Legionella y Salmonella y en el que la infección se desarrolla en el hígado.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la infección está causada por Listeria.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la Listeria es Listeria monocytogenes.

11. El agente para usarse de acuerdo con la reivindicación 8, en la que la infección está causada por Listeria.

12. El agente para usarse de acuerdo con la reivindicación 11, en la que la Listeria es Listeria monocytogenes.