Caracterización de la función génica usando inhibición por ARN bicatenario.

Un método para introducir ARNbc o ADN capaz de producir ARNbc en un organismo no humano

, comprendiendo dicho método suministrar a dicho organismo un microorganismo adecuado que comprende un vector de expresión que comprende un promotor o promotores orientados en relación con una secuencia de ADN de manera que sean capaces de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores o suministrar a dicho organismo directamente dicho vector de expresión.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E01129274.

Solicitante: DEVGEN NV.

Nacionalidad solicitante: Bélgica.

Dirección: TECHNOLOGIEPARK 30 9052 GENT-ZWIJNAARDE BELGICA.

Inventor/es: PLAETINCK,GEERT, BOGAERT,THIERRY, PLATTEEUW,CHRIST, MORTIER,KATHERINE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/63 (Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión)

PDF original: ES-2320527_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Caracterización de la función génica usando inhibición por ARN bicatenario.

La presente invención se refiere a la caracterización o identificación de la función de genes usando la inhibición por ARN bicatenario (ARNibc) y métodos de identificación del ADN responsable de la inducción de un fenotipo específico en una célula y un método de asignación de la función a secuencias de genes conocidas.

Se ha descrito recientemente en Nature Vol 391, págs. 806-811, Febrero 1998, que la introducción de ARN bicatenario en una célula da como resultado una interferencia potente y específica con la expresión de genes endógenos en la célula y siendo la interferencia sustancialmente más eficaz que proporcionar individualmente cualquier cadena de ARN como se propone en la tecnología antisentido. Se descubrió que esta reducción específica de la actividad del gen también sucedía en el helminto nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) cuando se introducía el ARN en el genoma o en la cavidad corporal del helminto.

Los presentes inventores han utilizado esta técnica y la han aplicado adicionalmente para encontrar nuevos e ingeniosos métodos de asignación de funciones a genes o fragmentos de ADN que se han secuenciado en diversos proyectos, tales como, por ejemplo, el proyecto genoma humano, y a los que todavía hay que dar una función particular, y para usar en la identificación del ADN responsable de conferir un fenotipo particular.

El documento WO 90/14090 describe un método para producir ARN bicatenario in vitro por transcripción de cadenas molde clonadas en vectores pGEM. Se preparan dos cadenas sencillas de ARN separadas en reacciones de transcripción in vitro separadas y posteriormente se hibridaron para producir un ARN bicatenario.

De acuerdo con la invención, se proporciona un método de introducción de ARNbc o ADN capaz de producir ARNbc en un organismo no humano, comprendiendo el método suministrar a dicho organismo un microorganismo adecuado que comprende un vector de expresión que comprende un promotor o promotores orientados en relación con una secuencia de ADN de manera que son capaces de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores o suministrar a dicho organismo directamente dicho vector de expresión.

Un método de identificación del ADN responsable de conferir un fenotipo en una célula puede comprender a) construir una genoteca de ADNc o genómico del ADN de dicha célula en una orientación en relación con el promotor (o promotores) capaz de promover la transcripción de dicho ADNc o ADN en ARN bicatenario (bc) tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor (o promotores) , b) introducir dicha genoteca en una o más de dichas células que comprenden dicho factor de transcripción y c) identificar y aislar un fenotipo deseado de dicha célula que comprende dicha genoteca e identificar el fragmento de ADN o ADNc de dicha genoteca responsable de conferir dicho fenotipo.

La genoteca puede organizarse en combinaciones jerárquicas como se describe con más detalle en los ejemplos proporcionados, antes de la etapa b) tal como para incluir, por ejemplo, familias de genes.

Un método de asignación de función a una secuencia de ADN conocida puede comprender a) identificar un homólogo (u homólogos) de dicho ADN en una célula, b) aislar el ADN homólogo (u homólogos) pertinente o un fragmento del mismo de dicha célula, c) clonar dicho homólogo o fragmento en un vector apropiado en una orientación con relación a un promotor (o promotores) capaz de promover la transcripción de ARNbc tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores, d) introducir dicho vector en dicha célula de la etapa a) que comprende dicho factor de transcripción, y e) identificar el fenotipo de dicha célula en comparación con el tipo silvestre.

En la invención, la secuencia de nucleótidos o de ADN puede proporcionarse tanto en una orientación con sentido como antisentido con relación a un solo promotor que tiene las propiedades definidas anteriormente, o como alternativa puede proporcionarse entre dos promotores idénticos. En ambos métodos descritos anteriormente el ARNbc se proporciona a partir de la transcripción iniciada a partir del promotor tras la unión de su factor de transcripción apropiado.

La célula de acuerdo con dicho método puede proceder de o estar contenida en un organismo. Cuando la célula está contenida en un organismo, el organismo puede adaptarse para expresar el factor de transcripción apropiado. El organismo puede ser cualquiera de una planta, animal, hongo o levadura pero preferiblemente puede ser el helminto nematodo C. elegans, que puede ser cualquiera de un tipo silvestre, un mutante nuc-1 o pha-ts de C. elegans o una combinación de dichas mutaciones. En una realización alternativa, la genoteca de ADN o ADNc o el ADN homólogo o fragmento del mismo puede transfectarse o transformarse ventajosamente en un microorganismo, tal como una célula bacteriana o de levadura, que puede suministrarse al organismo, que es preferiblemente el helminto nematodo C. elegans. En esta realización de la invención, el microorganismo puede adaptarse para expresar el factor de transcripción apropiado. Preferiblemente, el microorganismo es E. coli.

En cada aspecto de los métodos descritos, la genoteca de ADN, homólogo de ADN o fragmento de ADN puede construirse en un vector de ADN adecuado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicho factor de transcripción. Como alternativa, dicho factor de transcripción está codificado por un vector adicional. En una alternativa adicional más, la célula u organismo puede expresarse o adaptarse para expresar dicho factor de transcripción. Preferiblemente, cualquiera de los vectores usados en el método de acuerdo con la invención comprende un marcador de selección que puede ser, por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica sup-35 o un fragmento del mismo. La secuencia de nucleótidos puede orientarse en relación con un promotor de manera que la unión de un factor de transcripción al promotor inicia la transcripción del ADN en ARN bicatenario. La Figura 10 ilustra los vectores y la orientación de la secuencia de ADN que permite la producción de ARN bicatenario en C. elegans. De esta manera, en una realización el ADN se localiza entre dos promotores en un vector capaz de expresar ARNbc después de la unión de un factor de transcripción apropiado a dichos promotores. Como alternativa, el vector comprende dos copias de la secuencia de ADN organizada en una orientación sentido y antisentido con relación al promotor y cuyo marcador es de selección cuando está contenido en un C. elegans mutante pha-1. Preferiblemente, los promotores son cualquiera de los promotores T7, T3 o SP6 y el factor de transcripción comprende la polimerasa apropiada.

Preferiblemente el marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos capaz de inhibir o impedir la expresión de un gen en dicha célula y siendo dicho gen responsable de conferir un fenotipo conocido. Esta secuencia de nucleótidos puede ser parte de o idéntica a dicho gen que confiere dicho fenotipo, y estando dicha propia secuencia de nucleótidos orientada en relación con un promotor (o promotores) adecuado capaz de iniciar la transcripción de ARN bicatenario tras la unión de un factor de trascripción apropiado a dicho promotor (o promotores) . Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede ser una parte de o idéntica a dicha secuencia génica que confiere dicho fenotipo, y siendo dicha secuencia de nucleótidos tal que permite la... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para introducir ARNbc o ADN capaz de producir ARNbc en un organismo no humano, comprendiendo dicho método suministrar a dicho organismo un microorganismo adecuado que comprende un vector de expresión que comprende un promotor o promotores orientados en relación con una secuencia de ADN de manera que sean capaces de iniciar la transcripción de dicha secuencia de ADN en ARN bicatenario tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores o suministrar a dicho organismo directamente dicho vector de expresión.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vector de expresión comprende dos promotores idénticos que flanquean la secuencia de ADN.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vector de expresión comprende la secuencia de ADN en una orientación sentido y antisentido en relación con dicho promotor.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el vector de expresión comprende además una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador de selección.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica dicho marcador de selección está orientada en relación con el promotor o promotores de manera que la transcripción de la secuencia de nucleótidos en ARN bicatenario se produce tras la unión de un factor de transcripción apropiado a dicho promotor o promotores.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de selección se proporciona entre los promotores idénticos capaces de iniciar la transcripción de la secuencia de nucleótidos en ARNbc tras la unión del factor de transcripción a los promotores.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicha secuencia de nucleótidos que codifica el marcador de selección se proporciona en una orientación sentido y antisentido en relación con el promotor de manera que se produzca la transcripción de la secuencia de nucleótidos en ARNbc tras la unión del factor de transcripción a dicho promotor.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 en el que dicho marcador de selección comprende una secuencia de nucleótidos que codifica sup-35, para la introducción en C. elegans que tiene una mutación pha-1.

9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho microorganismo o dicho organismo están adaptados para expresar dicho factor de transcripción.

10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho microorganismo o dicho organismo comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica dicho factor de transcripción unido operativamente a secuencias de control de la expresión adecuadas.

11. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que dicho organismo es C. elegans y dicho microorganismo es E. coli.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 en el que dicha cepa de E. coli es una cepa ARNasa III negativa.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho organismo es un mutante nuc-1de C. elegans.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho factor de transcripción es ARN polimerasa T7, T3 o SP6.