Bolsillo de unión del inhibidor de la polimerasa NS5B del virus de la hepatitis C.

Un método de identificar un compuesto que se une a NS5B del VHC, que comprende las etapas de

a) aplicar un algoritmo de modelo molecular tridimensional a las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS5B del VHC definido por las coordenadas estructurales de al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503, y opcionalmente uno de los residuos aminoácidos 37 y 496 de una NS5B del VHC nativa

(SEC ID Nº: 1), para determinar las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC, en donde las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS5B del VHC son las coordenadas estructurales de

(iii) Figura 4 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1, y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1 dentro de 5 Å del complejo proporcionado en la Figura 4, o

(iv) Figura 5 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1, y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 y 503 de SEC ID Nº: 1 dentro de 5 Å del complejo proporcionado en la Figura 5;

b) rastrear electrónicamente las coordenadas espaciales almacenadas del compuesto frente a las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC para determinar si el compuesto se une con el bolsillo de unión de NS5B del VHC.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CA2004/000676.

Solicitante: BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BINGER STRASSE 173 55216 INGELHEIM AM RHEIN ALEMANIA.

Inventor/es: POUPART, MARC-ANDRE, BEAULIEU, PIERRE LOUIS, KUKOLJ,GEORGE, JOLICOEUR,ERIC, LAPLANTE,Steven, COULOMBE,RENÉ.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/12 (transfieren grupos que contienen fósforo, p. ej. Quinasas (2.7))
  • C12N5/08
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/18 (Togaviridae, p. ej. Flavivirus, virus de la peste, virus de la fiebre amarilla, virus de la hepatitis C, virus de la encefalitis japonesa)

PDF original: ES-2456702_T3.pdf

 

google+ twitter facebook

Fragmento de la descripción:

Bolsillo de unión del inhibidor de la polimerasa NS58 del virus de la hepatitis C

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a la polimerasa NS5B del Virus de la Hepatitis C (NS58 del VHC) y, en particular, a un nuevo bolsillo de unión del inhibidor de NS58 del VHC. Se proporciona la estructura cristalina de la NS58 del VHC que incluye las coordenadas que definen el nuevo bolsillo de unión del inhibidor y modelos tridimensionales para el uso en el rastreo de inhibidores. También se proporcionan métodos de diseño y rastreo de inhibidores de NS58 utilizando la estructura cristalina y la información de unión del inhibidor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

El virus de la hepatitis C (VHC) es el principal agente etiológico de la post-transfusión y hepatitis no A y no-B adquirida en la comunidad en todo el mundo. Se estima que más de 200 millones de personas en todo el mundo están infectadas por el virus. Un alto porcentaje de portadores se vuelven crónicamente infectados y muchos progresan a una enfermedad crónica del higado, la denominada hepatitis C crónica. A su vez, este grupo está en alto riesgo de padecer una enfermedad grave del higado tal como cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular y la enfermedad hepática terminal que conducen a la muerte.

El mecanismo por el cual el VHC establece la persistencia viral y causa una alta tasa de enfermedad hepática crónica no se ha elucidado a fondo. No se sabe cómo el VHC interactúa con y se evade del sistema inmune del huésped. Además, los papeles de las respuestas inmunes celular y humoral en la protección contra la infección por el VHC y la enfermedad todavia no se han establecido.

El VHC es un virus de ARN de cadena positiva con envoltura de la familia Flaviviridae. El genoma del ARN del VHC de cadena sencilla es de polaridad positiva y comprende un marco de lectura abierto (ORF -siglas en inglés) de aproximadamente 9600 nucleótidos de longitud, que codifica una poliproteina lineal de aprox. 3010 aminoácidos. En las células infectadas, esta poliproteina es escindida en múltiples sitios por proteasas celulares y virales para producir proteinas estructurales y no estructurales (NS) . Las proteinas estructurales (C, E1, E2 Y E2-p7) comprenden polipéptidos que constituyen la particula del virus. Las proteinas no estructurales (NS2, NS3, NS4A, NS48, NS5A, NS58) codifican enzimas o factores accesorios que catalizan y regulan la replicación del genoma de ARN del VHC. El procesamiento de las proteinas estructurales es catalizado por proteasas de la célula huésped. La generación de las proteinas no estructurales maduras es catalizada por dos proteasas codificadas por el virus. La primera es la metaloproteasa NS2/3 zinc-dependiente, la cual auto-cataliza la liberación de la proteina NS3 de la poliproteina. La proteina NS3 liberada contiene un dominio serina proteasa N-terminal y cataliza las escisiones restantes de la poliproteina. La proteina NS4A liberada tiene al menos dos papeles. El primer papel es la formación de un complejo estable con la proteina NS3 y la ayuda en la localización en la membrana del complejo NS3/NS4A; el segundo es actuando como un cofactor para la actividad de proteasa NS3. Este complejo asociado a membrana cataliza a su vez la escisión de los sitios restantes en la poliproteina, efectuando asi la liberación de NS4B, NS5A y NS58. El segmento C-terminal de la proteina NS3 también alberga actividad nucleósido trifosfatasa y ARN helicasa. La función de la proteina NS4B es desconocida. NS5A es una proteina altamente fosforilada que parece ser la responsable de la resistencia al intenerón de diversos genotipos del VHC. NS5B es una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) que está implicada en la replicación del VHC.

El marco de lectura abierto del genoma de ARN del VHC está flanqueado en su extremo 5' por una región no traducida (NTR) de aprox. 340 nucleótidos que funciona como el sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) , y en su extremo 3' por una NTR de aproximadamente 230 nucleótidos. Tanto las NTRs 5' como 3' son importantes para la replicación del genoma de ARN. La secuencia de variación genómica no está uniformemente distribuida por el genoma y la NTR 5' Y partes de la NTR 3' son las porciones más altamente conservadas.

Las secuencias parciales y completas clonadas y caracterizadas del genoma del VHC han sido analizadas en relación con los objetivos apropiados para una terapia antiviral prospectiva. Las siguientes cuatro actividades enzimáticas virales proporcionan posibles objetivos: (1) la proteasa NS2/3; (2) el complejo de proteasas NS3f4A, (3) la helicasa NS3 y (4) la ARN polimerasa dependiente de ARN de NS5B (RdRp de NS58) . También se ha cristalizado la ARN polimerasa dependiente de ARN de NS58 para revelar una estructura reminiscente de otras polimerasas de ácidos nucleicos (Ago et al. 1999; 8ressanelli et al. 1999; Lesburg et al. 1999) con un sitio activo cerrado.

Funciones especificas para virus, esenciales para la replicación, son los objetivos más atractivos para el desarrollo de fármacos. La ausencia de ARN polimerasas ARN dependientes en mamiferos, y el hecho de que esta enzima parece ser esencial para la replicación viral, sugieren que la polimerasa NS58 del VHC es una diana ideal para la terapéutica anti-VHC. Recientemente se ha demostrado que mutaciones que destruyen la actividad de NS5B suprimen la infectividad del ARN del VHC en un modelo de chimpancé (Kolykhalov, A.A. et al. 2000) . La etapa inicial de la replicación del ARN viral es el reconocimiento del extremo 3' del molde de ARN por parte de NS5B (RdRp) , que puede ocurrir directa o indirectamente con la ayuda de proteinas celulares (Lai, 1998; Strauss et al. ,

1999) . La polimerasa del VHC procede entonces a alargar este molde y a formar un producto de ARN complementa rio.

Varios grupos han descrito la estructura cristalina de la polimerasa NS5B del VHC (Ago et al. 1999 supra; Bressanelli el al. 1999 supra; Lesburg el al. 1999 supra) . Se asemeja a una esfera achatada con unas dimensiones aproximadas de 70 A x 60 A x 40 A. La cadena de polipéptido rodea el sitio activo, formando una cavidad en el centro de la molécula, y dando como resultado una apariencia que es muy diferente de otras polimerasas en forma de U. La organización de los dominios de NS5B es consistente con otras polimerasas, debido a que se subdivide en dominios de dedo, palma y pulgar en que se conserva el dominio de palma, es decir, los residuos 188-225 y 287

370. En contraposición con otras polimerasas, los contactos del dominio de pulgar y dedo extensivos resultan en una polimerasa del VHC de forma globular. Estos contactos están mediados, en parte, por los bucles que se extienden desde el dominio de dedo a pulgar. El conocimiento de la estructura cristalina de NS5B es útil para el diseño de fármacos basado en la estructura y, de hecho, se han reseñado recientemente las estructuras de los complejos de polimerasa I inhibidores de NS5B (Wang el al. 2003; Lave et al., 2003; documento EP 1 256628) . Se encontró que inhibidores de análogos no nucleósidos se unian de una manera similar a una cuña a un bolsillo de unión hidrofóbico situado cerca de la región C-terminal del dominio pulgar de la polimerasa. En este estudio, se determinó que la enzima sólo sufría cambios conformacionales de menor importancia en el complejo enzimafinhibidor. Al menos dos sitios de unión de NTP se han caracterizado en NS5B, uno en el sitio activo en la palma y un segundo sitio potencial alostérico en el pulgar (Q'Farrell et al., 2003; Bressanelli el al. 2002) .

Curiosamente, Labonté el al. 2002 han informado que una mutación de Leu30 en el bucle de dedo N-terminal de la NS58 afecta a su actividad de polimerasa y especulan que una alteración local en... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método de identificar un compuesto que se une a NS5B del VHC, que comprende las etapas de a) aplicar un algoritmo de modelo molecular tridimensional a las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS58 del VHC definido por las coordenadas estructurales de al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503, Y opcionalmente uno de los residuos aminoácidos 37 y 496 de una NS58 del VHC nativa (SEC ID N°: 1) , para determinar las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC, en donde las coordenadas estructurales de un bolsillo de unión de NS58 del VHC son las coordenadas estructurales de (¡ji) Figura 4 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1, Y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1 dentro de 5 A del complejo proporcionado en la Figura 4, o (iv) Figura 5 para el bolsillo de unión de NS5B del VHC formado por al menos los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1, Y en donde esta etapa implica utilizar coordenadas estructurales correspondientes a cada uno de los átomos de los residuos aminoácidos 392, 393, 395, 396, 399, 424, 425, 428, 429, 492, 493, 494, 495, 500 Y 503 de SEC ID N°: 1 dentro de 5 A del complejo proporcionado en la Figura 5;

b) rastrear electrónicamente las coordenadas espaciales almacenadas del compuesto frente a las coordenadas espaciales del bolsillo de unión de NS5B del VHC para determinar si el compuesto se une con el bolsillo de unión de NS58 del VHC.