BIOSENSOR.

Biosensor para medir la concentración de grasas neutras en base al valor de la corriente que fluye en un sistema de electrodos,

que comprende: un sustrato aislante; un sistema de electrodos que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre dicho sustrato aislante, y una capa de reacción que tiene una lipoproteína lipasa, una glicerol deshidrogenasa del tipo dependiente de coenzima y un mediador de electrones, formada en la parte superior o en la proximidad de dicho sistema de electrones; caracterizado porque dicha coenzima es pirrolo-quinolina quinona o flavín adenín dinucleótido

Biosensor.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un biosensor que es capaz de determinar, rápidamente y con precisión elevada, la cantidad de grasas neutras contenida en una muestra biológica o similar.

Técnica anterior

En general, como método de medición para grasas neutras, existen (1) un método que utiliza ácido cromotrópico, (2) un método con acetilacetona, (3) un método enzimático, y (4) un método que utiliza un nefelómetro, no obstante, cualquiera de estos métodos requiere operaciones de análisis complicadas y un tiempo de análisis largo. Por lo tanto, se ha desarrollado un biosensor como método para determinar, de manera sencilla y rápida, una cantidad de sustancias objetivo sin proceder a la dilución o agitación de una mezcla líquida en la medición de componentes específicos contenidos en la muestra.

Como biosensor del tipo dicho para la medición de grasas neutras, existe un sensor de triglicéridos caracterizado porque se inmoviliza una glicerol éster hidrolasa sobre una membrana polimérica porosa o una membrana polimérica uniforme hidrofílica recubiertas por una película aislante de la puerta de un transistor de efecto campo eléctrico selectivo de iones y sensible al pH (JP-A-59-210356).

Además, también se conoce un sensor de grasas neutras que utiliza una lipoproteína lipasa y una glicerol oxidasa (JP-A-59-228158). Este sensor es un sensor que tiene un primer electrodo y un segundo electrodo y está dotado de una enzima inmovilizada en la proximidad de un electrodo, con el fin de medir las grasas neutras contenidas en una solución a medir, basado en el flujo de corriente entre los electrodos de membrana, y se utilizan una lipoproteína lipasa y una glicerol oxidasa como enzimas inmovilizadas. Sin embargo, este aparato es complicado, ya que está compuesto de un tubo interior de vidrio y un tubo exterior de vidrio, y está dispuesto con un primer electrodo en la base del tubo interior; el líquido interior es cargado entre el tubo interior y el tubo exterior; y un segundo electrodo está dispuesto en este líquido interior, cuyos electrodos están sumergidos en un tanque de agua mantenida a 30ºC, y se carga una muestra a medir en este tanque de agua.

Como aparato más simple y más conveniente, se ha propuesto un sensor para medir la concentración de sustrato de una muestra líquida, mediante la detección electroquímica de un cambio en la concentración de sustancia en una reacción entre una enzima, un mediador de electrones y una muestra líquida por medio de un sistema de electrodos, que tiene, como mínimo, un electrodo de medición y un contraelectrodo formado sobre un sustrato aislante (JP-A-2001-343349). Este sensor es un sensor para la medición de grasas neutras, que tiene una primera capa formada sobre un electrodo de medición, mediante el mantenimiento una lipoproteína lipasa, una glicerol quinasa, una glicerofosfato oxidasa y un tensoactivo, y mediante el montaje de un portador a través del cual puede pasar la muestra líquida; y tiene una segunda capa formada sobre un contraelectrodo, mediante el mantenimiento de un tensoactivo y mediante el montaje de un portador a través de cual puede pasar la muestra líquida.

Analytical Chemistry ("Química analítica"), 1982, 54, pág. 1987-1990 da a conocer un sistema amperométrico de tres electrodos para la determinación de triglicéridos en suero, que utiliza glicerol deshidrogenasa y diaforasa dependientes de NAD⁺ e inmovilizadas sobre una membrana de colágeno.

Descripción de la invención

Sin embargo, un sensor de triglicéridos descrito en el documento anterior JP-A-59-210356, mide los ácidos grasos liberados por una glicerol éster hidrolasa utilizando un transistor de efecto campo eléctrico selectivo de iones y sensible al pH y, dado que el valor de la respuesta es proporcional al logaritmo de la concentración de la muestra, la precisión de la medición es insuficiente. Este sensor también tiene el problema de que el aparato resulta complicado.

Además, un sensor de grasas neutras descrito en el documento anterior JP-A-59-228158 requiere un aparato de calentamiento para mantener la temperatura constante para una medición precisa. Dado que el sensor requiere el suministro de una muestra para su medición desde su exterior, requiere una gran cantidad de muestras, haciendo así que la medición sea difícil utilizando una cantidad pequeña de una muestra.

Además, un sensor descrito en el documento anterior JP-A-2001-343349 está configurado por diferentes capas para una enzima y un mediador de electrones, lo que hace el aparato extremadamente complicado, y requiere el uso de dos tipos de enzimas caros, una glicerol quinasa y una glicerofosfato oxidasa, así como una lipoproteína lipasa.

Recientemente, el número de pacientes de hiperlipemia, que es una enfermedad relacionada con el estilo de vida, ha crecido de manera constante y, por tanto, es una cuestión actual que se desea firmemente el desarrollo de un sensor que es capaz de medir, rápidamente y con una precisión elevada, la concentración de grasas neutras contenidas en una muestra, tal como sangre o similar.

En estas circunstancias, un objetivo de la presente invención es dar a conocer un sensor que es capaz de medir, rápidamente y con una precisión elevada, la concentración de grasas neutras de una muestra, tal como una muestra biológica o similar, sin realizar el pretratamiento de la muestra.

Los presentes inventores han observado que, en un biosensor para medir la concentración de grasas neutras basado en el valor del flujo de corriente en el sistema de electrodos, que tiene: un sustrato aislante; un sistema de electrodos que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre el sustrato aislante; y una capa de reacción formada en la parte superior o en la proximidad del sistema de electrodos; mediante la inclusión de una lipoproteína lipasa, una glicerol deshidrogenasa dependiente de PQQ o FAD y un mediador de electrones en la capa de reacción, se puede medir la concentración de glicerol en una muestra de manera rápida y con una precisión elevada, y habiendo conseguido así la presente invención.

Concretamente, un aspecto de la presente invención se refiere a un biosensor para medir de la concentración de las grasas neutras, basado en el valor del flujo de corriente en el sistema de electrodos, que tiene: un sustrato aislante; un sistema de electrodos que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre el sustrato aislante; y una capa de reacción que tiene una lipoproteína lipasa, una glicerol deshidrogenasa dependiente de PQQ o FAD y un mediador de electrones, formada en la parte superior o en la proximidad del sistema de electrodos.

Adicionalmente, otros objetivos, detalles y características de la presente invención quedarán claros en referencia a las realizaciones preferentes que se indicarán como ejemplos en la explicación siguiente y los dibujos que se acompañan.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una vista en planta que muestra la formación de cada uno de los elementos de la configuración de un biosensor de la presente invención; (a) es una vista en planta que muestra un patrón de formación de una parte de conducción y una parte de conexión sobre un sustrato aislante; (b) es una vista en planta que muestra un patrón de formación de un electrodo de referencia que configura un sistema de electrodos; (c) es una vista en planta que muestra un patrón de formación de un electrodo de trabajo y un contraelectrodo que configuran un sistema de electrodos; (d) es una vista en planta que muestra un patrón de formación de una capa aislante; y (e) es una vista en planta que muestra un patrón de formación de un separador y una capa de reacción.

La figura 2 es una vista en perspectiva que muestra el orden de laminación de cada uno de los elementos de la configuración mostrada en cada uno de los dibujos de la figura 1.

La figura 3 es una vista en planta que muestra un biosensor formado por cada uno de los elementos de la configuración mostrada en cada uno de los dibujos de las figuras 1 y 2.

La figura 4 es un gráfico que muestra el resultado del ejemplo 1-1.

La figura 5 es un gráfico que muestra el resultado del ejemplo 1-2.

La figura 6 es un gráfico que muestra el resultado de los ejemplos 2-1 a 2-3.

Descripción detalla de la realización

A continuación, se proporcionará una explicación sobre una realización preferente para llevar...

1. Biosensor para medir la concentración de grasas neutras en base al valor de la corriente que fluye en un sistema de electrodos, que comprende:

un sustrato aislante;

un sistema de electrodos que tiene un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, formado sobre dicho sustrato aislante, y

una capa de reacción que tiene una lipoproteína lipasa, una glicerol deshidrogenasa del tipo dependiente de coenzima y un mediador de electrones, formada en la parte superior o en la proximidad de dicho sistema de electrones;

caracterizado porque dicha coenzima es pirrolo-quinolina quinona o flavín adenín dinucleótido.

2. Biosensor, según la reivindicación 1, en el que dicho sistema de electrodos comprende además un electrodo de referencia.

3. Biosensor, según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho mediador de electrones es de un tipo o de dos o más tipos seleccionados del grupo que consiste en un ion ferricianuro, p-benzoquinona y un derivado de p-benzoquinona, metosulfato de fenacina y un derivado de metosulfato de fenacina, azul de metileno, tionina, carmín de índigo, galocianina, safranina, ferroceno y un derivado del mismo, a-naftoquinona y un derivado de a-naftoquinona.

4. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha capa de reacción comprende además un tensoactivo y un agente de tamponador del pH.

5. Biosensor, según la reivindicación 4, en el que dicho tensoactivo es un tensoactivo no iónico.

6. Biosensor, según la reivindicación 4 ó 5, en el que el pH de dicho agente tamponador del pH es de 6 a 9.

7. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha capa de reacción comprende además un polímero hidrofílico.

8. Biosensor, según la reivindicación 7, en el que dicho polímero hidrofílico es de un tipo o de dos o más tipos seleccionados del grupo que consiste en ácido tánnico, pectina, caseína, carragenano, furcellarano, pululano, colágeno, quitina, quitosano, condroitín sulfato sódico, ácido lignin sulfónico y derivados de los mismos.

9. Biosensor, según la reivindicación 7 u 8, en el que dicha capa de reacción comprende:

una primera capa de reacción que tiene dicho mediador de electrones y dicho polímero hidrofílico, pero que sustancialmente no tiene dicha glicerol deshidrogenasa; y

una segunda capa de reacción formada sobre la capa superior de dicha primera capa de reacción, y que tiene dicha glicerol deshidrogenasa y dicho polímero hidrofílico, pero que sustancialmente no tiene dicho mediador de electrones.

10. Biosensor, según la reivindicación 9, en el que se forma una tercera capa de reacción que consiste esencialmente en dicho polímero hidrofílico, entre dicha primera capa de reacción y dicha segunda capa de reacción.

11. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se forma una capa aislante que tiene una parte de abertura de forma casi rectangular en la capa superior de dicho sistema de electrodos, caracterizado porque el área expuesta de dicha parte de abertura de dicho contraelectrodo es de 1,2 a 3,0 veces el área expuesta desde dicha parte de abertura de dicho electrodo de trabajo.

12. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una parte de conducción y una parte de conexión para fabricar dicho sistema de electrodos conducido eléctricamente al exterior del biosensor, en el que el material que configura dicho sistema de electrodos es un material de carbono, como componente principal, con un valor de resistividad de la superficie igual o inferior a 100 O/Box, en un grosor de 10 µm, y el material que configura dicha parte de conducción y dicha parte de conexión es un material de metal, como componente principal, con un valor de resistividad de la superficie igual o inferior a 50 O/Box, en un grosor de 10 µm.

13. Biosensor, según la reivindicación 12, en el que dicho metal es de un tipo o dos o más tipos de metales seleccionados del grupo que consiste en plata, oro, platino y paladio.

14. Biosensor, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha glicerol deshidrogenasa es una glicerol deshidrogenasa modificada químicamente modificada con un reactivo de reticulación bivalente, en presencia de un tensoactivo.

15. Biosensor, según la reivindicación 14, en el que dicha glicerol deshidrogenasa deriva de bacterias que pertenecen a Gluconobacter.