BIOSENSOR PARA LA DETECCIÓN DE ÁCIDO FOSFATÍDICO EN MEMBRANAS CELULARES.

Biosensor para la detección de ácido fosfatídico en membranas celulares.

La presente invención se refiere a proteínas de fusión que comprenden un fragmento de la proteína Spo20

, la proteína fluorescente ECFP y la proteína fluorescente Venus o una variante de ésta. También se refiere a la secuencia nucleotídica que las comprende. Además, también se refiere a su uso para la detección y/o cuantificación in vitro de ácido fosfatídico en membranas celulares, por ejemplo, membrana plasmática o membrana mitocondrial. Además, también se refiere a un método de cribado utilizando las proteínas de fusión de la invención.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201331377.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE CASTILLA-LA MANCHA.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: LLOPIS BORRÁS,Juan Francisco, FERRAZ NOGUEIRA,Jose Pedro.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/53 (Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto)

PDF original: ES-2534574_A1.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

la presente invención se refiere a una proteína de fusión que comprende un fragmento de la proteína Sp020 de levadura, la proteína fluorescente ECFP y la proteína fluorescente Venus o una variante de la misma, cuya expresión celular se dirige a membranas y que presenta un cambio del espectro de emisión fluorescente cuando une el ácido fosfatídico. la proteína de fusión de la invención es útil para la

cuantificación de los niveles de ácido fosfatídico. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la Biomedicina.

ESTADD DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El ácido fosfatídico (AF) es un fosfolípido en forma de cono que estabiliza la curvatura negativa de las membranas, lo que ayuda en la formación de vesículas del aparato de Golgi o membrana plasmática y lleva a cabo la fusión y la fisión de orgánulos tales como las mitocondrias. Además, el AF es un mediador lipídico. las notables propiedades de su grupo fosfomonoéster, situado más cerca del interior hidrofóbico de la bicapa lipídica que en otros fosfolípidos, proporcionan un ambiente especial para el anclaje de proteínas de unión a AF. Estas proteínas parecen utilizar residuos básicos debidamente espaciados en lugar de una secuencia de aminoácidos precisa para su unión a AF. la lista de efectores conocidos que unen AF se está expandiendo rápidamente. Cambios en los niveles de AF se han asociado con el reclutamiento y/o activación de una amplia gama de proteínas que participan en diferentes actividades celulares, tales como la remodelación del citoesqueleto de actina, el tráfico de vesículas, el crecimiento celular, la difusión, la proliferación y la supervivencia celular (revisado en Stace Cl y Ktistakis NT Biochim Biophys Acta 2006;1761 (8) :913-926) .

El AF también juega un papel en la biosíntesis de otros lípidos de señalización. Se piensa que la principal fuente de AF en células es la enzima fosfolipasa O (PlD, isoformas 1 y 2) , que utiliza fosfatidilcolina como sustrato. El AF puede ser convertido a diacilglicerol (DAG) por fosfatasas del AF, que comprenden las lipinas y las fosfatasas de fosfato de lípidos. A su vez, el DAG puede ser reconvertido en AF por

las DAG quinasas (DGKs) . A partir de AF también se puede generar ácido lisofosfatídico por la fosfolipasa A, mientras que la reacción inversa es catalizada por las acil transferasas de ácido lisofosfatídico. Esta compleja red de reacciones enzimáticas se regula por diversos bucles de retroalimentación.

El creciente interés en las moléculas de señalización lipídicas ha fomentado el desarrollo de herramientas para analizar mejor su dinámica espacio-temporal. Además de los métodos tradicionales para la determinación de los cambios en los niveles de lípidos, se han descrito biosensores construidos con dominios de unión a lípidos unidos a proteínas fluorescentes pero que sin embargo no proporcionan información cuantitativa del AF en las membranas celulares ni información sobre la disminución del mismo. Por ejemplo, se ha descrito un biosensor para AF, que consiste en la fusión molecular de un dominio de unión a AF (un fragmento de Spo20) y la proteína fluorescente GFP (Nakanishi H et al. Mol Biol CeU 2004;15 (4) :1802-1815) . En células de mamífero, este biosensor se transloca del citoplasma y núcleo a la membrana plasmática en respuesta al aumento de AF en la misma. Sin embargo, la fluorescencia de esta proteína quimérica se ve afectada también por factores como el fotoapagamiento de GFP, la concentración del indicador o el grosor de la célula en una u otra localización y por lo tanto, sólo proporciona información cualitativa del AF.

Otro indicador fluorescente de AF que se ha descrito está basado en transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) . En este caso el biosensor tiene como dominio de unión a AF un fragmento de la proteína DOCK2, y posee dos proteínas fluorescentes. Sin embargo, el cambio de señal que se obtiene con este biosensor es de pequeña magnitud y no muestra disminuciones de AF, sino sólo aumentos del fosfolipido (Nishioka T et al. J Biol Chem 2010; 285 (46) :35979-35987) .

Por lo tanto, se hace necesario obtener biosensores más robustos, con mayor cambio de la señal fluorescente por la unión del AF que proporcionen información cuantitativa tanto del aumento como de la disminución del AF. De esta manera se avanzaría en la caracterización de las funciones del AF en las células y se posibilitaría el cribado farmacológico de ligandos que modifican su concentración.

DESCRIPCION DE LA INVENCiÓN El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar una proteína de fusión fluorescente más sensible al ácido fosfatídico (AF) que las descritas en el estado del arte y que proporciona información sobre la detección y cuantificación del AF en las membranas celulares, incluidas las membranas mitocondriales.

El sensor fluorescente (o biosensor) de ácido fosfatídico (AF) de la presente invención está formado por la prote ína de levadura Sp020 como dominio sensible a AF (los residuos 51 a 91 de esta proteína) , y las proteínas fluorescentes ECFP (proteína fluorescente cian) y Venus (proteína fluorescente amarilla) como donador y aceptar de 10 transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) , respectivamente. La expresión de las proteínas quiméricas (o quimeras) en diferentes membranas celulares se obtuvo utilizando secuencias de direccionamiento apropiadas. Los autores de la presente invención han utilizado varias configuraciones del espaciador entre las proteínas fluorescentes y el fragmento de Sp020 para maximizar el cambio de la transferencia de energía con la variación de los niveles de AF en membranas celulares. Los biosensores de la invención son sensibles tanto al aumento como a la disminución del AF en las membranas celulares.

Los biosensores de la presente invención son útiles para la detección dinámica de AF

en las membranas celulares. Se ha demostrado la invención en las membranas plasmática y mitocondrial externa. Los biosensores de la invención cambian su color de emisión fluorescente en respuesta a los estímulos que aumentan o disminuyen los niveles de AF en estas membranas, validando así su utilidad. Con esta herramienta se pueden obtener nuevos datos relativos a la dinámica de formación de AF y su relación con actividades enzimáticas de las membranas, así como las variaciones de niveles de AF durante actividades como la migración celular, la emisión de procesos de membrana y la autofagia. Además, se pueden construir líneas celulares con expresión estable del biosensor fluorescente para utilizarlas en el cribado farmacológico de las enzimas implicadas en la formación y degradación del AF. Además, es posible utilizar

los biosensores para ensayos in vivo de la bioquímica del AF en las diferentes membranas.

La proteína fluorescente cian (ECFP) utilizada en la presente invención se refiere a una variante de la proteína fluorescente verde (GFP) que se obtiene a partir del 35 organismo Aequorea victoria y cuya secuencia de ácido nucleico se refieren a la SEO

ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos se refiere a la SEa ID NO: 2. La SEa ID NO: 1 es idéntica a la secuencia nucleotídica en la base de datos GenBank EU422995.1. La SEa ID NO: 2 es idéntica a la secuencia de proteína ACB12919.1 en GenBank. También se puede referir a cualquier variante de ECFP que guarde al menos un 70% de identidad con la misma.

La proteína Venus utilizada en la presente invención se refiere a una variante de la proteína fluorescente verde (GFP) que se obtiene a partir del organismo Aequorea victoria y cuya secuencia de ácido nucleico se refieren a la SEO ID NO: 5 y la secuencia... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Proteína de fusión fluorescente que comprende:

a. una subunidad (a) que comprende una proteína con al menos un 70% de 5 identidad con la secuencia SEO ID NO: 2 o un fragmento de la misma;

b. una subunidad (b) unida al extremo carboxilo terminal de la subunidad (a) que comprende una proteína que se une al ácido fosfatídico con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 4; o un fragmento de la misma;

c. y una subunidad (c) unida al extremo carboxilo terminal de la subunidad (b) que comprende una proteína con al menos un 70% de identidad con la secuencia SEO ID NO: 6 o una permutación circular de la misma o un fragmento de la misma;

donde las subunidades se unen entre sí sin espaciador o con un polipéptido 15 espaciador.

2. Proteína según la reivindicación 1 donde la sub unidad (a) consiste en la SEO ID NO: 2.

3. Proteína según la reivindicación 1 donde la sub unidad (b) consiste en la SEO ID NO: 4.

. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO:6.

5. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (a) consiste en la SEO ID NO: 2, la subunidad (b) consiste en la SEO ID NO: 4 y la subunidad (e) consiste en la SEO ID NO: 6.

6. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 8.

7. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID NO: 10.

8. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEa ID NO: 12.

9. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEO ID 5 NO: 14.

10. Proteína según la reivindicación 1 donde la subunidad (c) consiste en la SEa ID NO: 16.

11. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además comprende la secuencia SEa ID NO: 18 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a) .

12. Proteína según la reivindicación 1 donde la proteína de fusión consiste en la proteína de secuencia SEO ID NO: 20.

13. Proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además comprende la secuencia SEa ID NO: 22 unida al extremo amino terminal de la subunidad (a) .

14. Proteína según la reivindicación 1 donde la proteína de fusión consiste en la 20 proteína de secuencia SEO ID NO: 24.

15. Secuencia nucleotídica que comprende la secuencia que codifica una proteina de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.

16. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 15 donde dicha secuencia consiste en la SEa ID NO: 19.

17. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 15 donde dicha secuencia consiste en la SEa ID NO: 23.

18. Célula que comprende la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17.

19. Uso de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o de 35 la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 para la detección y/o cuantificación in vitre del ácido fosfatídico en una célula o en un tejido.

20. Uso según la reivindicación 19 donde el ácido fosfatídico se localiza en la 5 membrana plasmática.

21. Uso según la reivindicación 19 donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana mitocondrial.

22. Kit que comprende la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 o la célula según la reivindicación 18.

23. Uso del kit según la reivindicación 22 para la detección y/o cuantificación in vitro 15 del ácido fosfatídico en una célula o en un tejido o en un extracto celular.

24. Uso según la reivindicación 23 donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana plasmática.

25. Uso según la reivindicación 23 donde el ácido fosfatídico se localiza en la membrana mitocondrial.

26. Procedimiento de obtención de la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 que comprende cultivar una célula según la reivindicación 25 18 en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas.

27. Método para el análisis cuantitativo de los niveles de ácido fosfatídico que comprende:

a. poner en contacto una célula o tejido o extracto celular con la proteína de fusión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o con la secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17;

b. anclaje de la proteína de fusión a una membrana celular;

c. detectar y cuantificar la fluorescencia emitida, proporcional a la presencia de ácido fosfatídico.

28. Método según la reivindicación 27 que además comprende, para el cribado de ligandos de receptores de membrana o de enzimas, entre el paso (b) y el paso (c) estimular la célula o el tejido con una sustancia, donde la célula o el tejido expresa un receptor de membrana acoplado a la liberación o metabolización de ácido fosfatídico, o una enzima que sintetiza o degrada el ácido fosfatídico.