Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

BIOMATERIALES INTERFACIALES (IFBM) PARA PROMOVER LA ADHESION ESPECIFICA DE SUBSTANCIAS A ANALIZAR.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen:

Un biomaterial interfacial para recubrir una superficie de un implante, comprendiendo el biomaterial:

(a) al menos un módulo de unión que se une a la superficie de un implante, comprendiendo el módulo de unión un péptido que se une específicamente a un material de la superficie de un implante;

(b) al menos un módulo de unión que se une a un factor de crecimiento, en el que un módulo de unión comprende un péptido que tiene una secuencia Trp-X-X-Phe-X-X-Leu (SEC ID Nº: 73) o (Leu o Val)-X-Phe-Pro-Leu-(Lys o Arg)-Gly (SEC ID Nº: 28) en el que el al menos un módulo de unión que se une a la superficie de un implante y el al menos un módulo de unión que se une a un factor de crecimiento están unidos por un enlazador.

Solicitante: AFFINERGY, INC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: P.O. BOX 14650,RESEARCH TRIANGLE PARK, NC 277.

Inventor/es: GRINSTAFF, MARK W., KENAN,DANIEL,J, HAMILTON,PAUL,T, CHRISTENSEN,DALE,J, BEYER,WAYNE,FL.,JR, HYDE-DERUYSCHER,ROBIN, BENSON,RAY,EDWARD.

Fecha de Publicación de la Concesión: 8 de Julio de 2010.

Fecha Concesión Europea: 31 de Marzo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes: A61L27/34 (..Materiales macromoleculares [7]), C07K7/08A, C07K14/00B, A61L27/22R.

Clasificación PCT: G01N33/543 (....con un soporte insoluble para la inmovilización de compuestos inmunoquímicos [4]), A61L27/22 (..Polipéptidos o sus derivados [7]), A61L27/34 (..Materiales macromoleculares [7]).

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Descripción:

Biomateriales interfaciales (IFBM) para promover la adhesión específica de substancias a analizar.

Campo de la invención

La presente invención proporciona materiales y métodos para recubrir superficies de dispositivos médicos con biomateriales interfaciales que promueven el reconocimiento específico y la adhesión del analito a la superficie del dispositivo.

Antecedentes de la invención

Los implantes ortopédicos se usan para una diversidad de reemplazos articulares y para promover la reparación ósea en seres humanos y en animales. De acuerdo con analistas de la industria médica, en la actualidad existen más de 800.000 reemplazos articulares de cadera y de rodilla realizados en pacientes humanos cada año en los Estados Unidos. Además, cientos de miles de pacientes humanos se someten a procedimientos quirúrgicos en los que se usan implantes ortopédicos, por ejemplo, para tratar diversos tipos de fracturas óseas o para aliviar la dorsalgia lumbar grave.

Con todos estos procedimientos, hay una necesidad para una curación controlada dirigida y rápida. Los individuos que se someten a reemplazo articular a menudo experimentan curación y restauración de la función sin complicaciones. Por desgracia, existe una elevada tasa de complicaciones, incluyendo "fallos finales". La tasa de cirugía de revisión para el reemplazo articular total en seres humanos varía entre el 10 al 20% (Malchau et al. (2002) "Prognosis of total hip replacement: Update of results and risk-ratio analysis for revision and re-revision from the Swedish National Hip Arthroplasty Registry, 1979-2000", scientific exhibition at the 69th Annual Meeting of the American Academy of Orthopaedic Surgeons, Dallas, Texas, February 13-17, 2002; Fitzpatrick et al. (1998) Health Technol. Assess. 2:1-64; Mahomed et al. (2003) J. Bone Joint Surg. Am. 85-A: 27-32)). La mayoría de estas cirugías de revisión se hicieron necesarias por fallos en la interfaz entre implante y hueso.

Los implantes ortopédicos están fabricados de materiales que son relativamente inertes (materiales "aloplásticos"), típicamente materiales metálicos, de cerámica o de plástico. Las estrategias anteriores para mejorar los resultados de las cirugías de implantes ortopédicos se han centrado principalmente en cambios físicos para la superficie del implante que dan como resultado la formación aumentada. Estas estrategias incluyen el uso de implantes con superficies metálicas porosas para promover el crecimiento interno óseo y los implantes de pulverización con plasma de hidroxiapatita. Las estrategias que usan implantes dentales también han incluido el uso de superficies de titanio topográficamente reforzadas en las que se imparte rugosidad en la superficie mediante un método tal como pulido con chorro de arena, ataque ácido u oxidación. Aunque estas técnicas han mejorado los resultados de las cirugías de implantes ortopédicos, aún hay margen de considerable mejora adicional.

Se sabe que la respuesta de los tejidos en relación a un material aloplástico está influenciada por la adhesión celular a la superficie del material, y se ha dedicado mucha investigación para mejorar la adhesión celular a los materiales aloplásticos. Se sabe que la adhesión celular entre células in vivo se controla principalmente por la unión de dominios cortos de proteína expuestos en la matriz extracelular a los receptores de la superficie celular (LeBaron y Athanasiou (2000) Tissue Eng. 6: 85-103; Yamada (1997) Matrix Biol. 16: 137-141). En particular, una clase de receptores conocidos como integrinas se han implicado en la adhesión celular a las superficies de los implantes. Se ha demostrado que las integrinas y sus ligandos diana estimulan la adhesión y proliferación de osteoblastos así como la formación ósea (véase, por ejemplo, Kantlehner et al. (2000) Chem Bio Chem 1: 107-114; Sarmento et al. (2004) J. Biomed. Mater. Res. 69A: 351-358; Hayashibara et al. (2004) J. Bone Mineral Res. 19: 455-462. Las integrinas pueden ser útiles dirigiendo la adhesión celular a los implantes y de esta manera pueden mejorar la integración de los implantes en el hueso adyacente.

Otras investigaciones han demostrado que la expresión local de factores de crecimiento y citocinas puede potenciar las reacciones de los tejidos en las superficies de implantes aloplásticos. Por ejemplo, Cole et. al. ((1997) Clin. Orthop. 345: 219-228) han demostrado que los factores de crecimiento pueden promover la integración de un implante en el hueso adyacente ("osteointegración") así como aumentar la tasa de formación ósea próxima a la superficie del implante. Véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.344.654. Los factores de crecimiento que estimulan la producción de hueso nuevo ("proteínas osteoinductoras") incluyen, pero sin limitación, al factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de crecimiento 1 y 2 similares a insulina (IGF-1 e IGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento transformante (TGF-ß), proteínas morfogénicas óseas (BMP), y miembros de la familia asociados.

Las proteínas osteoinductoras más eficaces son las proteínas morfogenéticas óseas (BMP). Las BMP son miembros de la superfamilia de TGF-ß que comparten una serie de restos cisteína conservados y un alto nivel de identidad de secuencia global. Se ha identificado más de 15 BMP diferentes y la mayoría de las BMP estimulan la cascada de eventos que conducen a la formación de nuevo hueso (véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 5.013.649, 5.635.373, 5.652.118 y 5.714.589; también revisadas por Reddi y Cunningham (1993) J. Bone Miner. Res. 8 Supl. 2: S499-S502; Issack y DiCesare (2003) Am. J. Orthop. 32: 429-436, y Sykaras y Opperman (2003) J. Oral Sci. 45: 57-73). Esta cascada de eventos que conduce a la formación de hueso nuevo incluye la migración de células madre mesenquimales, la deposición de matriz osteoconductora, la proliferación de células osteoprogenitoras y la diferenciación de células progenitoras en células productoras de hueso. Se han dedicado mucha investigación al uso de las BMP en o cerca de implantes con objeto de promover la osteointegración de los implantes (véase, por ejemplo: Friedlander et al. (2001) J. Bone Joint Surg. Am. 83-A Supl. 1 (Pt. 2): S151-58; Einhorn (2003) J. Bone Joint Surg Am. 85-A Supl.3: 82-88; Burkus et al. (2002) J. Spinal Disord Tech. 15(5): 337-49). Sin embargo, una de las cuestiones críticas que permanece sin resolver es el método de injertar o inmovilizar una BMP activa en otra biomolécula activa sobre la superficie de un implante.

Se ha demostrado que la presentación de las BMP es crítica para producir la formación de hueso deseada cerca de un dispositivo de implante. Se han diseñado estrategias para mejorar implantes en vista del proceso natural de la formación del hueso. En el hueso humano, el colágeno sirve como un armazón para la formación del hueso y como un vehículo natural para las BMP. El hueso desmineralizado se ha usado con éxito como un material de injerto óseo; los principales componentes del hueso desmineralizado son el colágeno y las BMP (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.236.456). Se han desarrollado muchos sistemas de matriz diseñados para fomentar la formación ósea por liberación constante de factores de crecimiento y otras moléculas bioactivas a medida que se degrada la matriz. La eficacia de la liberación de la BMP de las matrices poliméricas depende de características de la matriz tales como la afinidad de la BMP por la matriz, velocidad de reabsorción, densidad y tamaño del poro. Los materiales usados en dichos sistemas de la matriz incluyen polímeros orgánicos que se hidrolizan fácilmente en el cuerpo dentro de monómeros inertes. Dichos polímeros orgánicos incluyen polilácticos, poliglicólicos, polianhídridos, y poliortoésteres (véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.563.489, 5.629.009 y 4.526.909). Otros materiales descritos como siendo útiles en matrices que contienen BMP incluyen copolímeros del ácido poliláctico y poliglicólico, alginato, poli(etilenglicol), óxido de polioxietileno y polímero de carboxivinilo y poli(vinil alcohol) (véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.597.897). También se han usado proteínas naturales de la matriz para suministrar las BMP a áreas óseas, estas proteínas naturales incluyen colágeno, glucosaminoglucanos y ácido hialurónico, que se digieren enzimáticamente en el cuerpo (véase las Patentes de Estados Unidos Nº. 4.394.320, 4.472.840, 5.366.509, 5.606.019, 5.645.591 y 5.683.459).

Incluso con el uso de una matriz polimérica para conservar la BMP en el sitio de reparación, se ha observado que se necesitan niveles suprafisiológicos de BMP para promover la curación debido a la rápida difusión de los factores de crecimiento fuera de la matriz. Por ejemplo, con un sistema de suministro de esponja de colágeno, tan solo se conserva el 50% de la BMP añadida a la esponja después de dos días (Geiger et al. (2003) Adv. Drug Del. Rev. 55: 1613-1629). La elevada dosis inicial de las BMP necesaria para mantener niveles fisiológicos de BMP durante el período de tiempo necesario hace que el tratamiento con BMP sea más costoso y puede conducir a efectos secundarios perjudiciales tales como formación de hueso ectópico o reacciones alérgicas o la formación de anticuerpos neutralizantes.

Existen problemas similares con otros implantes tales como reemplazos de tendón y ligamento, reemplazos de piel, prótesis vasculares, marcapasos cardiacos, válvulas cardiacas artificiales, implantes de mama, implantes de pene, cánulas, catéteres, desviadores, guías de crecimiento nervioso, lentes intraoculares, apósitos para heridas y selladores de tejido. Así como con implantes ortopédicos, la cirugía implicada en estos implantes a menudo da lugar a problemas similares con la curación lenta de heridas y cuando es deseable, la integración inadecuada del implante en el tejido circundante.

Por lo tanto, sigue siendo necesario desarrollar métodos de coste eficaz para injertar biomoléculas activas en la superficie de materiales usados como implantes o junto con implantes para promover la curación post-quirúrgica y, cuando es deseable, la integración del implante en los tejidos circundantes, tales como, por ejemplo, el hueso adyacente.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un recubrimiento mejorado para las superficies de implantes médicos. El recubrimiento comprende al menos un biomaterial interfacial (IFBM) constituido por al menos un módulo de unión que se une a la superficie de un implante o de un material relacionado con un implante ("módulo de implante") y al menos un módulo de unión que se une a un analito diana o que está diseñado para tener un efecto deseado ("módulo de analito"). El módulo de analito comprende un péptido que tiene la secuencia Tap-X-X-Phe-X-X- Leu (SEC ID Nº: 73) o (Leu o Val)-X-Phe-Pro-Leu-(Lys o Arg)-Gly (SEC ID: Nº 28). Los módulos están conectados por un enlazador. En algunas realizaciones, el recubrimiento del IFBM actúa para promover el reconocimiento y adhesión de analitos diana a la superficie del dispositivo. El recubrimiento del IFBM mejora el rendimiento de los dispositivos médicos implantados promoviendo la osteointegración del implante, acelerando la curación y/o reduciendo la inflamación en el sitio del implante.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una comparación de la unión de fagos que presentan péptidos representativos de unión a titanio con respecto a perlas de titanio (véase el Ejemplo 1). La señal del ensayo para la unión a perlas de titanio (eje vertical) se muestra para diversos fagos (eje horizontal).

La Figura 2 muestra una comparación de la unión de péptidos con un resto biotina C-terminal con respecto al titanio (véase el Ejemplo 1). La absorbancia (eje vertical) se muestra como una función de la concentración de péptido (µM, en el eje horizontal).

La Figura 3 muestra una comparación de la unión a titanio de dos péptidos (véase el Ejemplo 2). Se muestra una señal de 405 nm (eje vertical) como una función de concentración de péptido (µM, en el eje horizontal). Las líneas muestran en el gráfico de arriba abajo puntos de unión de datos para péptidos AFF6007 y AFF6010, respectivamente.

La Figura 4 muestra una comparación de la unión de diversos péptidos a BMP-2 (véase el Ejemplo 3). Se muestra la señal (proporción AP) para diversos péptidos (identificados en el eje horizontal).

La Figura 5 muestra el efecto de BMP sobre la unión de los IFBM a una esponja de colágeno (véase Ejemplo 4). Se muestra la señal (eje vertical) como una función de la concentración de BMP en nM (eje horizontal).

Las Figuras 6A, 6B, 6C y 6D muestran los resultados de un experimento descrito en el Ejemplo 4 que demuestra que la unión de BMP a colágeno mediante un IFBM depende tanto de la cantidad de BMP puesta en la esponja como también de la cantidad del IFBM presente. La absorbancia (eje vertical) se muestra como una función de la concentración de BMP (eje horizontal).

La Figura 7 muestra los resultados de un análisis de todas las secuencias peptídicas de las Tablas 3 y 4 que se unen a BMP-2 y contienen el Motivo 1 (véase el Ejemplo 3). Para cada posición analizada la Figura muestra el número de veces que se encontró cada aminoácido en esa posición en las secuencias peptídicas analizadas, por ejemplo, "G2" en la posición 1 significa que la Glicina se encontró dos veces en esa posición.

La Figura 8 muestra el casete oligonucleotídico que se diseñó para expresar un péptido que contenía el Motivo 1 de unión al núcleo en el contexto de una secuencia peptídica que también contenía restos consenso identificados para otras posiciones en la secuencia (véase el Ejemplo 3).

La Figura 9 muestra resultados de un ELISA convencional realizado para evaluar la afinidad relativa de péptidos de unión a BMP (véase el Ejemplo 3). La señal del ELISA (lectura a 405 nm) se presenta en el eje vertical como una función de microlitros de fago en el eje horizontal. En los puntos de datos correspondientes a 0,10 microlitros de fago, las líneas muestran en el gráfico de arriba a abajo puntos de unión de datos para: APO2-61, APO2-40, APO2-41, APO2-26, APO2-35, APO2-59, APO2-44, mAEK, y el control sin fago, respectivamente.

La Figura 10 muestra lo resultados de un análisis de todas las secuencias peptídicas de las tablas 3 y 5 que se unen a BMP-2 y que contienen el motivo 2. Para cada posición analizada la figura muestra el número de veces que se encontró cada aminoácido en esa posición en las secuencias peptídicas analizadas; por ejemplo, "G7" en la posición 1 significa que la Glicina se encontró siete veces en esa posición. También se muestra una secuencia consenso derivada de un alineamiento de los péptidos de las Tablas 3 y 5 que contienen el Motivo 2. Esta secuencia representa el aminoácido predominante encontrado en cada posición después de alinearse todos los péptidos. Entre las secuencias examinadas, los aminoácidos más conservados forman un motivo de unión al núcleo denominado "Motivo 2a".

La Figura 11 muestra resultados representativos de un ensayo alterno para la actividad de unión a BMP en la que la unión aparece en la fase de solución (véase el Ejemplo 3). La absorbancia a 405 nm (eje vertical) se muestra como una función de picomoles de BMP (eje horizontal). Estos resultados se usaron para calcular la afinidad de cada péptido de unión a BMP para BMP-2 (véase la Tabla 6). En los puntos de datos correspondiente a un picomol de BMP, las líneas muestran en el gráfico de arriba a abajo puntos de unión de datos para: 2006, 2007, 2008, 2009, 2011 y 2012, respectivamente.

La Figura 12 muestra resultados de un ensayo en el que se ensayaron varios péptidos respecto a su capacidad para unirse a BMP-2, BMP-4 y BMP-7 (véase el Ejemplo 3). Los péptidos 2007 y 2011 se identificaron originalmente como péptidos de unión a BMP-2, mientras que el péptido 9001 se identificó originalmente como de unión a una diana no relacionada.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un recubrimiento mejorado para superficies de dispositivos médicos para promover la adhesión de péptidos, proteínas, fármacos o células al dispositivo. El recubrimiento es un biomaterial interfacial (IFBM) que comprende múltiples módulos de unión que están conectados. El IFBM comprende al menos un módulo de unión que se une a la superficie del implante ("módulo de implante") y al menos un módulo de unión que se une a un analito diana o tiene un efecto deseado ("módulo de analito"). Los módulos de unión a analito comprenden las secuencias peptídicas proporcionadas en la lista de secuencias (SEC ID Nº: 28 y 73). Los módulos están conectados por un enlazador. En algunas realizaciones, la unión del módulo de unión de un IFBM a la superficie de un implante es no-covalente. De manera similar, en algunas realizaciones, la unión de un módulo de analito a un analito diana es no-covalente. De acuerdo con una realización, el módulo de implante y el modulo de analito comprenden dos moléculas peptídicas separadas de manera que el módulo de implante se une a un material de implante y el módulo de analito se une específicamente a un factor de crecimiento o célula. En algunas realizaciones, el módulo de implante y el módulo de analito están conectados por una macromolécula central. Estos módulos de unión típicamente se unen no covalentemente al material de implante o analito diana, respectivamente. En realizaciones en las que el módulo de analito no se une a un analito diana pero sin embargo tiene un efecto deseado, el módulo de analito puede, por ejemplo, simular la acción de un factor de crecimiento actuando para reclutar células para la localización del implante. El método de selección y la estructura del IFBM se describen en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/300.694, presentada el 20 noviembre del 2002 y publicada el 2 de octubre del 2003 como número de publicación 20030185870.

Por "se une específicamente" o "unión específica" se refiere a que el módulo de implante o el módulo de analito se une a un material de implante seleccionado o a un analito seleccionado. En algunas realizaciones, un módulo que se une específicamente a un material o analito de implante particular se une a este material o analito al menos el 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o un porcentaje superior más de lo que el módulo se une a un control apropiado tal como, por ejemplo, un material diferente que se usa en implantes, un material que no se usa en implantes o una proteína típicamente usada para dichos propósitos tal como albúmina de suero bovina. Por "analito" se refiere a cualquier sustancia o resto que mejora la osteointegración de un implante o promueve o acelera la curación de los tejidos circundantes después de la cirugía del implante. Los analitos adecuados que son dianas de unión para módulos de analito incluyen, pero sin limitación, factores de crecimiento tales como proteínas morfogénicas óseas (BMP, tales como, por ejemplo, BMP-7 y BMP-2), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento transformante-ß (TGF-ß), factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1), factor de crecimiento similar a insulina 2 (IGF-2), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento nervioso (NGF) y el factor de crecimiento placentario. Los analitos adecuados también incluyen hormonas, enzimas, citocinas y otras sustancias o restos bioactivos que son útiles en la obtención de los objetivos de la invención; es decir, para promover la osteointegración de un implante y/o promover la curación de los tejidos circundantes después de cirugía de implante. Los analitos adecuados también incluyen células, por ejemplo, osteoblastos, condrocitos, células madre, células progenitoras, plaquetas y otras células que realizan funciones en la osteointegración y curación. En algunas realizaciones, los módulos de analito pueden comprender secuencias peptídicas que se unen a células o que tienen bioactividad mediante la unión a células o receptores tales como, por ejemplo, las secuencias peptídicas RGD, YIGSR e IKVAV, que se conocen en la técnica por tener actividades biológicas particulares. Véase, por ejemplo, Hersel et al. (2003) Biomaterials 24: 4385-4415; Grant et al. (1990) Ann. N.Y. Acad. Sci. 588: 61-72; Hosawaka et al. (1999) Dev. Growth Differ. 41: 207-216. En algunas realizaciones, los módulos de analito comprenden secuencias peptídicas que se unen a y/o imitan el efecto de BMP-2, tales como las secuencias ejemplares indicadas en las SEC ID Nº: 28 ó 73. Un módulo de analito que se une a células puede comprender un péptido que comprende una secuencia de adhesión celular general que se une a muchos tipos de células diferentes o puede comprender un péptido que se une a un tipo de célula específica tal como un osteoblasto, un condrocito, una célula osteoprogenitora o una célula madre.

El término "implante" generalmente se refiere a una estructura que se introduce en el cuerpo de un ser humano o animal para restaurar una función de un tejido dañado o para proporcionar una nueva función. Un dispositivo de implante puede crearse usando cualquier material biocompatible a los que pueden unirse específicamente agentes de unión como se describe en este documento. Los implantes representativos incluyen pero sin limitación: endoprótesis de cadera, articulaciones artificiales, implantes mandibulares o faciales, reemplazos de tendón y ligamentos, reemplazos de piel, reemplazos óseos y tornillos óseos artificiales, dispositivos de injerto óseo, prótesis vasculares, marcapasos cardiacos, válvulas cardiacas artificiales, implantes de mama, implantes de pene, endoprótesis, catéteres, desviadores, guías de crecimiento nervioso, lentes intraoculares, apósitos para heridas y selladores de tejido. Los implantes están fabricados por una diversidad de materiales que se conocen en la técnica e incluyen pero sin limitación: un polímero o una mezcla de polímeros que incluyen, por ejemplo, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido-poliglicólico, polianhídridos, poliortoésteres, poliestireno, policarbonato, nilon, PVC, colágeno (incluyendo, por ejemplo, colágeno procesado tal como colágeno reticulado), glucosaminoglucanos, ácido hialurónico, alginato, seda, fibrina, celulosa, y goma; plásticos tales como polietileno (incluyendo, por ejemplo, polietileno de alta densidad (HDPE)), PEEK (polieteretercetona) y politetrafluoroetileno; metales tales como titanio, aleación de titanio, acero inoxidable, y aleación de cromo cobalto; óxidos metálicos; óxidos no metálicos; silicona; vidrio bioactivo, material de cerámica tal como, por ejemplo, óxido de aluminio, óxido de circonio, y fosfato de calcio; otros materiales adecuados tales como matriz ósea desmineralizada; y combinaciones de los mismos. El término "polímero" como se usa en este documento se refiere a cualquiera de los numerosos compuestos naturales y sintéticos de peso molecular normalmente elevado constituidos por hasta millones de unidades repetidas conectadas, cada una a una molécula relativamente simple. El término "implante" como se usa en este documento incluye materiales relacionados con un implante que están asociados con el implante y también están introducidos en un cuerpo humano o animal junto con el implante.

En una realización de la invención, un IFBM crea una interfaz de unión que media la adhesión de factores de crecimiento a la superficie de un implante. En algunas realizaciones, los implantes preparados de acuerdo con los métodos de invención tendrán factores de crecimiento específicamente adheridos a la superficie del implante; la velocidad de difusión del factor de crecimiento fuera del sitio del implante puede variar dependiendo de la afinidad del módulo de analito para el factor de crecimiento en cuestión y por tanto los implantes pueden prepararse con diversas velocidades de difusión de factores de crecimiento. En realizaciones que implican la adhesión de factores de crecimiento a la superficie de un implante, el factor de crecimiento tendrá un efecto positivo tal como, por ejemplo, aceleración del proceso de curación, reducción de la cantidad de factor de crecimiento necesario para la curación y minimización de los efectos secundarios causados por el uso de dosis suprafisiológicas del factor de crecimiento. Los factores de crecimiento de interés particular como módulos de analito o como factores que se unen a módulos de analito incluyen, por ejemplo, BMP-2, BMP-7, PDGF, FGF y TGFß.

Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos para preparar un implante que se coloca quirúrgicamente en un paciente en el que el dispositivo se recubre con una capa que comprende al menos un IFBM, En algunas realizaciones, el método comprende los pasos de: (a) aplicar un recubrimiento de IFBM al implante, en el que el IFBM comprende un módulo de implante que se une específicamente al implante y un módulo de analito que se une específicamente al factor de crecimiento; (b) aplicar el factor de crecimiento a la superficie del implante por inmersión, pulverización o cepillado de una solución que contiene el factor de crecimiento sobre el implante; (c) colocar el implante en el sujeto usando técnicas quirúrgicas apropiadas que conocerán los expertos en la materia.

Como alternativa, un método para recubrir un implante de manera que el dispositivo implantado promueva la adhesión del factor de crecimiento comprende los pasos de: (a) aplicar un recubrimiento de IFBM al implante, en el que el IFBM comprende un módulo de implante que se une específicamente al implante y un módulo de analito que se une específicamente al factor de crecimiento en un sitio del implante; y (b) colocar el implante en un sujeto en el sitio del implante; mediante el cual el factor de crecimiento producido en el hospedador se une al implante mediante el IFBM. La presencia potenciada del factor de crecimiento en el sitio de implante potencia la curación del tejido adyacente y la integración del implante en el tejido adyacente.

En otra realización de la invención, un implante se recubre con más de un tipo de IFBM para proporcionar un recubrimiento con funcionalidades múltiples. Por ejemplo, un recubrimiento del implante puede comprender un primer IFBM que tiene un módulo de analito que se une a una célula y un segundo IFBM que tiene un módulo de analito que se une a un factor de crecimiento. Un recubrimiento que comprende estos IFBM se uniría tanto a las células como al factor de crecimiento de la superficie del implante. En algunas realizaciones, estos IFBM se entremezclarían en el recubrimiento de manera que el factor de crecimiento unido está muy próximo a las células unidas. En una realización, un recubrimiento comprende un IFBM que se une a células madre mesenquimales y un IFBM que se une al factor de crecimiento BMP-2; el BMP-2 desencadenaría la diferenciación de las células madre en osteoblastos. En otras realizaciones, un recubrimiento de implante puede comprender una mezcla de al menos dos IFBM diferentes que se diferencian en cualquiera o ambos de sus módulo de implante y módulo de analito. En otra realización, un recubrimiento comprende un IFBM multi-funcional que tiene dos módulos de analito, uno de los cuales se une a una célula y el otro se une a un factor de crecimiento.

Los módulos de unión (es decir, módulos de implante y/o módulos de analito) pueden ser péptidos, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, polinucleótidos, oligonucleótidos, complejos que comprenden cualquiera de éstos o diversas moléculas y/o compuestos. Los módulos de unión que son péptidos pueden identificarse como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos en trámite Nº 10/300.604, presentada el 20 noviembre de 2002 y publicada el 2 octubre de 2003 como número de publicación 20030185870. En algunas realizaciones, los módulos de unión pueden identificarse explorando bibliotecas de presentación de fagos para detectar la unión a materiales que incluyen materiales biocompatibles (es decir, "biomateriales") tales como titanio, acero inoxidable, aleación de cobalto-cromo, poliuretano, polietileno o silicona.

En algunas realizaciones de la invención, el módulo de analito es un péptido bioactivo o se une a un péptido bioactivo. Estos péptidos bioactivos pueden ser fragmentos de proteínas nativas que conservan el efecto biológico de la proteína nativa, como se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, TP508 es un péptido sintético derivado de trombina que representa 183-200 aminoácidos de trombina humana y se ha observado que acelera la curación de las fracturas (véase, por ejemplo, Wang et al. (2002) Trans ORS 27: 234). Se piensa que la función de TP508 está mediada por una secuencia RGD dentro del péptido que se une a las integrinas presentes en la superficie celular (véase, por ejemplo, Tsopanoglou et al., (2004) Thromb Haemost. 92(4): 846-57). De manera similar, P-15 es un péptido de 15 aminoácidos derivado del colágeno de Tipo I que representa el dominio de unión a célula del colágeno (véase, por ejemplo, Yang et al. (2004) Tissue Eng. 10 (7-8): 1148-59). Se ha demostrado que P-15 potencia la formación de hueso nuevo (véase, por ejemplo, Scanaro et al. (2003). Implant Dent. 12(4): 318-24). Los péptidos bioactivos también pueden ser fragmentos de factores de crecimiento. Por ejemplo, Saito et al. (J Biomed Mater Res A 2005 72A (1): 77-82) han demostrado que un péptido sintético que representa 73-92 aminoácidos de BMP-2 conserva actividades biológicas de BMP-2 incluyendo la unión a un receptor de BMP-2, activando la expresión génica e induciendo la formación de hueso ectópico.

Cualquier módulo de implante puede combinarse con cualquier módulo de analito para crear un IFBM de la invención siempre que se proporcione la actividad deseada; es decir, siempre que el IFBM se una específicamente a un implante adecuado y tenga un efecto adecuado conferido por el módulo de analito, es decir, la capacidad para unirse a BMP-2. Un experto en la materia apreciará que para crear un IFBM de la invención una diversidad de tipos y números de módulos de implante pueden combinarse con una diversidad de tipos y números de módulos de analito. Por tanto, para crear un IFBM por ejemplo, uno o más módulos de implante pueden unirse con uno o más módulos de analito. Un experto en la materia será capaz de seleccionar de manera adecuada módulo (o módulos) de implante y módulo (o módulos) de analito dependiendo del material del cual está fabricado el implante y de la actividad deseada a conferir por el módulo (o módulos) de analito.

El término "anticuerpo" como se usa en este documento incluye anticuerpos monocatenarios. Por tanto, un anticuerpo útil como un módulo de unión puede ser un anticuerpo de fragmento variable monocatenario (scFv). Un anticuerpo monocatenario es un anticuerpo que comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable que están unidas entre sí, directamente o mediante un enlazador peptídico, para formar un polipéptido continuo. La expresión "anticuerpo monocatenario" como se usa en este documento incluye una proteína de inmunoglobulina o una parte funcional de la misma, incluyendo pero sin limitación, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo híbrido, un anticuerpo mutagenizado, un anticuerpo humanizado, y fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de unión a antígeno (por ejemplo, fragmentos de anticuerpo Fab y Fv).

La tecnología de presentación de fagos se conoce bien en la técnica. Usando presentación de fagos, una biblioteca de péptidos diversos puede presentarse a un sustrato diana y los péptidos que se unen específicamente al sustrato pueden seleccionarse para uso como módulos de unión. Pueden usarse rondas de selección en series múltiples, denominadas "selección". Como se conoce en la técnica, para identificar un módulo de unión que es útil en los métodos de la invención. puede emplearse cualquiera de una diversidad de bibliotecas y métodos de selección Por ejemplo, pueden usarse bibliotecas de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos para identificar anticuerpos o fragmentos que se unen a poblaciones celulares o a virus en particular (véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.174.708; 6.057.098; 5.922.254; 580.479; 5.78.225; 5.702.892 y 5.667.988). Los métodos de selección pueden incluir, por ejemplo, exploración en fase de solución, exploración en fase sólida, o exploración basada en células. Una vez identificada una molécula de unión candidata, puede usarse la mutagénesis dirigida o aleatoria de la secuencia para optimizar las propiedades de unión del módulo de unión. Los términos "bacteriófago" y "fago" son sinónimos y en este documento se usan de manera intercambiable.

Una biblioteca puede comprender una colección aleatoria de moléculas. De manera alternativa, una biblioteca puede comprender una colección de moléculas que tienen un sesgo para una secuencia, estructura, o conformación particular. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.264.563 y 5.824.483. En la técnica se conocen métodos para preparar bibliotecas que contienen varias poblaciones de diversos tipos de moléculas, y también se encuentran disponibles en el mercado numerosas bibliotecas. Por ejemplo, en Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins (San Diego, Academic Press); Barbas (2001) Phage Display: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) pueden encontrarse métodos para preparar fagotecas.

Un módulo de unión (es decir, módulo de implante o módulo de analito) es un péptido que comprende aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200 o hasta 300 aminoácidos. Los péptidos útiles como un módulo de unión pueden ser lineales, ramificados o cíclicos y pueden incluir restos no peptidílicos. El término "péptido" se refiere en general a una cadena de aminoácidos que incluye aminoácidos de origen natural, aminoácidos sintéticos, aminoácidos codificados genéticamente, aminoácidos modificados no genéticamente y combinaciones de los mismos. Los péptidos pueden incluir aminoácidos tanto en forma L como en forma D.

Un péptido útil como un módulo de unión puede someterse a diversos cambios, sustituciones, inserciones y deleciones cuando dichos cambios proporcionan ciertas ventajas en su uso. Por tanto, el término "péptido" incluye cualquiera de una diversidad de formas de derivados peptídicos que incluyen, por ejemplo, amidas, conjugados con proteínas, péptidos ciclón, péptidos polimerizados, variantes conservativamente sustituidas, análogos, fragmentos, péptidos modificados químicamente y péptido miméticos. En la práctica de esta invención puede usarse cualquier péptido que tenga las características de unión deseadas.

Los aminoácidos representativos codificados no genéticamente incluyen pero sin limitación ácido 2-aminoadípico; ácido 3-aminoadípico; ácido ß-aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico; ácido 4-aminobutírico (ácido piperidínico); ácido 6-aminocaproico; ácido 2-aminoheptanoico; ácido 2-aminoisobutírico; ácido 3-aminoisobutírico; ácido 2-aminopimélico; ácido 2,4-diaminobutírico; desmosina; ácido 2,2'-diaminopimélico; ácido 2,3-diaminopropionico; N-etilglicina; N-etilasparagina; hidroxilisina; alo-hidroxilisina; 3-hidroxiprolina; 4-hidroxiprolina; isodesmosina; alo-isoleucina; N-metilglicina (sarcosina); N-metilisoleucina; N-metilvalina; norvalina; norleucina y ornitina.

Los aminoácidos derivatizados representativos incluyen, por ejemplo, aquellas moléculas en las que dos grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de amina, grupos p-tolueno sulfonilo, grupos carbobenzoxi, grupos t-butiloxicarbonilo, grupos cloracetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, metil y etil ésteres u otros tipos de ésteres o hidracidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados O-acilo u O-alquilo. El nitrógeno imidazol de histidina puede derivatizarse para formar N-im-bencilhistidina.

La expresión "variante conservativamente sustituida" se refiere a un péptido que tiene una secuencia de restos aminoacídicos sustancialmente idéntica a una secuencia de un péptido de referencia en el que uno o más restos se han sustituido conservativamente con un resto funcionalmente similar tal como la "variante conservativamente sustituida" que se unirá al mismo compañero de unión con sustancialmente la misma afinidad que la variante parental e impedirá la unión de la variante parental. En una realización, una variante conservativamente sustituida presenta una especificidad de unión similar cuando se compara con el péptido de referencia. La frase "variante conservativamente sustituida" también incluye péptidos en los que se sustituye un resto con un resto químicamente derivatizado.

Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un resto no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro; la sustitución de un resto aromático tal como triptófano, tirosina o fenilalanina por otro; la sustitución de un resto polar (hidrófilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, entre glicina, alanina, treonina y serina; la sustitución de un resto básico tal como lisina, arginina o histidina por otro o la sustitución de un resto ácido tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro.

Aunque en este documento se describen las secuencias peptídicas preferidas para usar como módulos de unión en los IFBM de la invención (por ejemplo, en la lista de secuencia en la SEC ID Nº 73 o 28), un experto en la materia apreciará que la unión u otras propiedades conferidas por aquellas secuencias puede ser atribuibles únicamente a algunos de estos aminoácidos que comprenden estas secuencias. Los péptidos que son módulos de unión de la presente invención también incluyen péptidos que tienen una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de restos relativos a la secuencia de una secuencia peptídica ejemplar como se describe en este documento, siempre que se conserven las propiedades de unión deseadas del módulo de unión. Por tanto, los módulos de unión de la invención incluyen péptidos que se diferencian de las secuencias ejemplares descritas en este documento en aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos, pero conservan la capacidad de la correspondiente secuencia ejemplar para unirse a un material particular o para actuar como un módulo de analito. Una molécula de unión de la invención que difiere de una secuencia ejemplar descrita en este documento conservará al menos el 25%, 50%, 75% o 100% de la actividad de un módulo de unión que comprende una secuencia ejemplarmente entera descrita en este documento como se mide usando un ensayo apropiado.

Es decir, los módulos de unión de la invención incluyen péptidos que comparten identidad de secuencia con las secuencias ejemplares descritas en este documento de al menos el 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o identidad de secuencia superior. La identidad de secuencia puede calcularse manualmente o puede calcularse usando una aplicación por ordenador de un algoritmo matemático, por ejemplo, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete informático Wisconsin Genetics del Grupo Genetics Computer, Versión 10 (disponible en Accelrys, 9685 Scranton Road, San Diego, CA, 92121, Estados Unidos). La matriz de puntuación usada en la Versión en 10 del paquete informático Wisconsin Genetics es BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89: 10915). Los alineamientos que usan estos programas pueden realizarse usando los parámetros por defecto.

Un péptido puede modificarse, por ejemplo, por acilación NH2-terminal (por ejemplo, acetilación o amidación con ácido tioglicólico) o por carboxilamidación terminal (por ejemplo, con amoniaco o metilamina). Las modificaciones terminales son útiles para reducir la susceptibilidad por digestión proteinasa, y para prolongar por lo tanto una vida media de los péptidos en las soluciones, particularmente en los fluidos biológicos donde pueden estar presentes las proteasas.

La ciclación de péptidos es también una modificación útil debido a las estructuras estables formadas por ciclación y en vista de las actividades biológicas observadas en dichos péptidos cíclicos. Schneider y Eberle (1993) Peptides. 1992: Proceedings of the Twenty-Second European Peptide Symposium, 13-19 de septiembre de 1992, Interlaken, Suiza, Escom, Leiden, Países Bajos, describen métodos de para ciclar péptidos.

Opcionalmente, un péptido de módulo de unión puede comprender uno o más aminoácidos que se han modificado para contener uno o más halógenos, tales como flúor, bromo o yodo, para facilitar la unión a una molécula enlazadora. Como se usa en este documento, el término "péptido" también incluye un péptido en el que uno o más de los enlaces peptídicos están sustituidos por enlaces pseudopeptídicos que incluyen pero sin limitación un enlace carba (CH2-CH2), un enlace depsi (CO-O), un enlace hidroxietileno (CHOH-CH2), un enlace cetometileno (CO-CH2), un enlace metileno-oxi (CH2-O), un enlace reducido (CH2-NH), un enlace tiometileno (CH2-S), un enlace N-modificado (-NRCO-), un enlace tiopéptido (CS-NH). Véase por ejemplo, Gargay-Jaureguiberry et al. (1922) Int. J. Pept. Protein Res. 39: 523-527; Tung et al. (1992) Petp. Res. 5: 115-118; Urge et al. (1992) Carbohydr. Res. 235: 83-93; Corringer et al. (1993) J. Med. Chem. 36: 166-172; Pavone et al. (1993) Int. J. Pept. Protein Res. 41: 15-20.

Los péptidos representativos que se unen específicamente a superficies de interés (incluyendo titanio, acero inoxidable, colágeno y ácido poliglicólico (PGA)) y por lo tanto son adecuados para usar como módulos de unión en los IFBM de la invención se exponen en la lista de secuencias y se describen adicionalmente más abajo en este documento. Aunque en este documento se describen secuencias peptídicas ejemplares, un experto en la materia apreciará que las propiedades de unión conferidas por aquellas secuencias pueden ser atribuibles únicamente a algunos de los aminoácidos que comprenden las secuencias. Por tanto, una secuencia que sólo comprende una parte de una secuencia ejemplar descrita en este documento puede tener sustancialmente las mismas propiedades de unión que la secuencia ejemplar de longitud completa. Por tanto, también son útiles como módulos de unión las secuencias que sólo comprenden 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 de los aminoácidos en una secuencia ejemplar particular, y dichos aminoácidos pueden ser contiguos o no contiguos en la secuencia ejemplar. Dichos aminoácidos pueden concentrarse en el extremo amino-terminal del péptido ejemplar (por ejemplo, pueden concentrarse 4 aminoácidos en los primeros 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 aminoácidos del péptido) o pueden estar dispersos a lo largo del péptido ejemplar pero sin embargo ser responsables de las propiedades de unión del péptido. Por ejemplo, un péptido que se une específicamente a BMP-2 puede comprender la totalidad o parte de un motivo de secuencia tal como se describe en el Ejemplo 3 y se expone en la SEC ID Nº: 28. Por tanto, un péptido que se une específicamente a BMP-2 puede tener una secuencia que cumpla con cada requisito del motivo de secuencia expuesto en la SEC ID Nº: 28 o puede tener una secuencia que cumpla con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 de los requisitos del motivo de secuencia.

En algunas realizaciones, el IFBM se ha construido para imitar los efectos biológicos de los factores de crecimiento de la proteína. En estas realizaciones, el módulo de analito comprende un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se une al receptor de BMP, BMPRI y también comprende una secuencia de aminoácidos que se une al receptor de BMP, BMPRII (véase, por ejemplo, el Ejemplo 6). Estos receptores se conocen bien en la técnica y también se encuentran disponibles en el mercado (por ejemplo, en R&D Systems, Minneapolis, MN, Cat. Nº 315-BR y 811-BR). En estas realizaciones, el módulo de analito tiene una actividad BMP como se mide, por ejemplo, por técnicas conocidas en la técnica y descritas en el Ejemplo 6. Aunque la invención no se ciñe a ningún mecanismo operativo particular, se piensa que al unirse a cada uno de BMPRI y BMPRII, el módulo de analito fomentará la heterodimerización de estos receptores, desencadenando por lo tanto la señalización mediante la ruta de BMP-SMAD. De esta manera, podría construirse un IFBM y usarse para recubrir la superficie de un implante para desencadenar la señalización mediante la ruta de BMP-SMAD sin la adición de BMP en sí misma. Generalmente, en la ruta nativa de BMP-SMAD, se requiere la heterodimerización de los receptores de BMP de tipo I y de tipo II para la señalización (véase, por ejemplo, Chen et al. (2004) Growth Factors 22: 233-241). La dimerización hace que los dominios citoplásmicos de los receptores de tipo I y de tipo II se aproximen, permitiendo que el receptor quinasa de tipo II constitutivamente activo fosforile al receptor de tipo I. La fosforilación del dominio citoplásmico del receptor de tipo I activa su actividad quinasa latente que a su vez activa proteínas Smad. Después de liberarse del receptor, las proteínas Smad fosforiladas se asocian con Smad4 y este complejo se transloca en núcleo para actuar con otras proteínas como factores de transcripción y regular genes sensibles (Chen et al. (2004) Growth Factors 22: 233-241). En conjunto, esto puede denominarse la ruta de transducción de señal Smad aguas abajo o BMP-SMAD y por la misma activarse los genes. Las proteínas producidas como resultado de la activación de la ruta Smad o BMP-SMAD pueden denominarse productos de proteína aguas abajo activados por Smad.

Las moléculas de unión de la presente invención que son péptidos pueden sintetizarse mediante cualquiera de las técnicas de síntesis peptídica que conocen los expertos en la técnica. Pueden encontrarse técnicas representativas, por ejemplo, en Stweart y Young (1969) Solid Phase Peptide Synthesis, (Freeman, San Francisco, California); Merrifield (1969) Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 32: 221-296; Fields y Noble (1990) Int. J. Pept. Protein Res. 35: 161-214; y Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis, 2ª Rev. Ed. (Springer-Verlag, Berlin). Pueden encontrarse técnicas de síntesis en fase sólida representativas en Anderson et al. (2000) Biopolymers 55: 227-250, referencias citadas en ese documento y en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.015.561; 6.015.881; 6.031.071; y 4.244.946. La síntesis peptídica en solución se describe en Schöder y Lübke (1965) The Peptides (Academic Press, New York, New York). En los textos anteriores y en McOmie (1973) Protective Groups in Organic Chemistry (Plenum Press, Londres) se describen grupos protectores apropiados útiles para la síntesis peptídica. Los péptidos, incluyendo péptidos que comprenden aminoácidos codificados no genéticamente, también pueden producirse en un sistema de traducción acelular, tal como el sistema descrito por Shimizu et al. (2001) Nat Biotechnol 19: 751-755. Además, a partir de fuentes comerciales (por ejemplo, Biopeptide Co., LLC de San Diego, California y PeptidoGenics de Livermore, California) pueden adquirirse péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos especificada.

Los módulos de unión están conectados por al menos un enlazador para formar un IFBM de la invención. En algunas realizaciones, los IFBM constituidos por módulos de unión que son péptidos se sintetizan como un sólo péptido continuo; en estas realizaciones, el enlazador es simplemente uno de los enlaces en el péptido. En otras realizaciones de la invención, un enlazador puede comprender un polímero, incluyendo un polímero sintético o un polímero natural. Los polímeros sintéticos representativos que son útiles como enlazadores incluyen pero sin limitación: poliéteres (por ejemplo, polietilenglicol; PEG), poliésteres (por ejemplo, ácido poliláctico (PLA) y ácido poliglicólico (PGA), poliamidas (por ejemplo, nilon), poliaminas, ácidos poliacrílicos, poliuretanos, poliestirenos y otros polímeros sintéticos que tienen un peso molecular de aproximadamente 200 daltons a aproximadamente 1000 kilodaltons. Los polímeros naturales representativos que son útiles como enlazadores incluyen pero sin limitación: ácido hialurónico, alginato, condroitin sulfato, fibrinógeno, fibronectina, albúmina, colágeno y otros polímeros naturales que tienen un peso molecular de aproximadamente 200 dalton a aproximadamente 20.000 kilodaltons. Los enlazadores poliméricos pueden comprender un polímero dibloque, un copolímero multi-bloque, un polímero en peine, un polímero estrellado, un polímero dendrítico, un polímero híbrido dendrítico-lineal, o un copolímero aleatorio.

Un enlazador también puede comprender un ácido mercapto(amido)carboxílico, un ácido acrilamidocarboxílico, un ácido acrilamido-amidotrietileno y derivados de los mismos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos Nº 6.280.760. Cuando un enlazador comprende un péptido, el péptido puede incluir secuencias conocidas para tener funciones biológicas particulares, tal como YGD y GSR.

Los métodos para enlazar una molécula enlazadora a un dominio de unión variarán de acuerdo con los grupos reactivos presentes en cada molécula. Los expertos en la técnica conocen protocolos para enlazar usando grupos reactivos y moléculas. Véase, por ejemplo, Goldman et al. (1997) Cancer Res. 57: 1447-1451; Cheng (1996) Hum. Gene Therapy 7: 275-282; Neri et al. (1997) Nat. Biotechnol. 19: 958-961; Nabel (1997) Current Protocols in Human Genetics, vol. en CD-ROM (John Wiley & Sons, New York); Park et al. (1997) Adv. Pharmacol. 40: 399-435; Pasqualini et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 542-546; Bauminger y Wilchek (1980) Meth. Enzymol. 70: 151-159; las Patentes de Estados Unidos Nº 6.280.760 y 6.071.890 y las Patentes europeas Nº 0 439 095 y 0 712 621.

Las superficies de los dispositivos médicos se recubren por cualquier método adecuado, por ejemplo, por inmersión, pulverización o cepillado del IFBM sobre el dispositivo. El recubrimiento puede estabilizarse, por ejemplo, por secado con aire por liofilización. Sin embargo, estos tratamientos no son exclusivos y pueden emplearse otros métodos de recubrimiento y estabilización. En la técnica se conocen métodos adecuados. Véase, por ejemplo, Harris et al. (2004) Biomaterials 25: 4.135-4148 y la Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 10/644.703 presentada el 19 de agosto del 2003 y publicada el 6 de mayo del 2004 con el Nº de Publicación 20040087505.

Experimental

Ejemplo 1

Aislamiento de Péptidos que se Unen a Titanio

Se exploraron diez bibliotecas de presentación de fagos diferentes con respecto a la unión a perlas de titanio. Se lavaron perlas de titanio (Ti6Al4V), de aproximadamente un diámetro de 5/32 pulgadas (3,97 mm), con etanol al 70%, ácido nítrico al 40%, agua destilada, etanol al 70%, y acetona para eliminar cualquier contaminante de la superficie. Se colocó una perla de titanio en cada pocillo de una placa de polipropileno de 96 pocillos (Nunc).

Los sitios de unión no específicos en el titanio y en la superficie del polipropileno se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Cat. Nº P-3813). La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación a 50 rpm. Después se lavaron los pocillos 5 veces con 300 µl de PBS. Cada biblioteca se diluyó en PBS + BSA al 1% y se añadió a una concentración de 1010 ufp/ml en un volumen total de 250 µl. Después de 3 horas de incubación a temperatura ambiente y agitación a 50 rpm, los fagos no unidos se eliminaron lavando 3 veces con 300 µl de solución salina tamponada con fosfato -TweenTM 20 (PBS-T; Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, cat. Nº P-3563). Para recuperar los fagos unidos a las perlas de titanio, los fagos unidos se liberaron por tratamiento con glicina 50 mM, pH 2 durante 10 minutos seguido de un tratamiento de 10 minutos con etanolamina 100 mM, pH 12. Los fagos eluidos se agruparon, se neutralizaron con 200 µl de NaPO4 200 mM pH 7. Los fagos eluidos y las perlas se añadieron directamente a células DH5aF' de E. coli en medio YT2x. La mezcla se incubó durante una noche en un agitador a 37ºC a 210 rpm. Los fagos sobrenadantes después se recogieron después de centrifugar a 8500 xg durante 10 minutos. La segunda y tercera ronda de selección se realizaron de una manera similar a la de la primera ronda, usando los 50 µl de fago amplificado a partir de la ronda anterior como entrada diluidos con 200 µl de PBS + BSA al 1%. La cuarta ronda de selección se realizó de una manera similar; sin embargo, los lavados se modificaron. Después de una reacción de unión de 4 horas, las perlas se lavaron cinco veces con PBS-T (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, Nº P-3563), las perlas se pasaron a una placa de polipropileno transparente con pocillos de 2 ml, se añadió 1 ml de PBS + BSA al 1% a cada pocillo y el lavado se incubó durante una noche a temperatura ambiente con agitación a 50 rpm. A la mañana siguiente los fagos se eluyeron y se amplificaron de la misma manera descrita para las rondas 1-3. Después se aislaron fagos clonales individuales y se ensayaron sembrando en placa diluciones de grupos de fagos para obtener placas individuales.

Para detectar fagos que se unían específicamente a titanio, se realizaron ELISA convencionales usando un anticuerpo anti-fago M13 conjugado con HRP, seguido por la adición de agente cromogénico ABTS. Las fuerzas de unión relativas de los fagos se determinaron ensayando diluciones en serie de los fagos con respecto a la unión a titanio en un ELISA.

Se determinó la secuencia de ADN que codificaba péptidos que se unían específicamente a titanio. La secuencia que codificaba al inserto peptídico se localizó en el genoma del fago y se tradujo para obtener la correspondiente secuencia de aminoácidos mostrada sobre la superficie del fago.

Los péptidos representativos que se unen específicamente a titanio se indican en la Tabla 1. La unión de fagos presentando estos péptidos a perlas de titanio se muestra en la Figura 1.

TABLA 1 Péptidos de Unión a Titanio

Los péptidos presentados después se sintetizaron con un resto biotina C-terminal y se ensayaron con respecto a la unión a titanio. Los resultados se muestran en la Figura 2. Resumiendo, se prepararon soluciones madre peptídicas disolviendo el polvo en DMSO al 100% para preparar una solución de péptido 1 mM. Se prepararon en PBS-T diluciones en serie del péptido. Se incubaron perlas de titanio bloqueadas con leche seca desgrasada al 1% en PBS con diversas concentraciones de péptido durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las perlas se lavaron 3 veces con PBS-T. Se añadió fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (SA-AP) de USB (United States Biochemical, catálogo Nº 11687) (1:1000 en PBS-T) y se incubaron 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las perlas se lavaron 3 veces con PBS-T y se determinó la cantidad de péptido: SA-AP añadiendo PNPP (comprimidos Sigma-Aldrich, Inc., SigmaFast, catálogo Nº N1891) y se permitió que se desarrollase el color durante aproximadamente 10 minutos. La cuantificación se realizó transfiriendo la solución a una placa de microtitulación transparente y leyendo la absorbancia a 405 nm en un lector de placa Molecular Dynamics. En la técnica se conoce el péptido "9003". Este péptido se identificó por presentación de fagos como de unión a la enzima hexoquinasa; sirve como un control negativo para este experimento (véase, por ejemplo, Hyde-DeRuyscher et al. (2000) Chem. Biol. 7: 17-25).

Ejemplo 2

Función de Restos Cisteína en el Péptido 6007 de Unión a Titanio

Para explorar la función de los restos cisteína y la formación disulfuro en la unión del péptido 6007 a titanio, se sintetizó un péptido AFF6010 (Tabla 2) en el que restos cisteína presentes en el péptido de unión a titanio AFF6007 se cambiaron por restos serina. La secuencia de péptido AFF6010 es SSSDKSHKHWYSYESKYGGSGSSGK, mientras que la secuencia del péptido AFF6007 es SSSDKCHKHWYCYESKYGGSGSSGK. Los péptidos AFF6007 y AFF6010 después se conjugaron con biotina y se compararon con respecto a la unión a perlas de titanio de la siguiente manera.

Se bloquearon perlas de titanio con BSA al 1% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se prepararon soluciones madre de péptido AFF6007 y AFF6010 disolviendo 1-2 mg de péptido en agua. La concentración final de cada péptido se determinó usando la densidad óptica a 280 nm y el coeficiente de extinción de cada péptido. AFF6007 y AFF6010 se prepararon a 200 µM. Después se prepararon series de dilución para cada muestra de péptido. Cada péptido se sometió a una dilución triple en BSA al 1% en PBS.

Los péptidos se incubaron con las perlas de titanio durante 1 hora a temperatura ambiente. Las perlas después se lavaron dos veces con PBS/TweenTM 20. Después se añadió a las perlas fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina a 1:500 durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se lavaron dos veces con PBS/TweenTM 20. Se usó PNPP para desarrollar el ensayo y se registró la absorbancia a 405 nm.

Los resultados, que se muestran en la Figura 3, demuestran que los dos péptidos AFF6007 y AFF6010 se unen a titanio. Una estimación de la afinidad relativa de un péptido para titanio puede realizarse determinando la concentración de péptido que proporciona la mitad de la señal máxima (Tabla 2). La eliminación completa de los restos cisteína en AFF6007 disminuye la afinidad del péptido para el titanio en aproximadamente 10 veces, pero no la elimina (Tabla 2). Por lo tanto, los restos cisteína no son necesarios para la unión a titanio aunque aumentan la afinidad del péptido para el titanio.

TABLA 2 Afinidad Relativa de Péptidos de unión a Titanio

Ejemplo 3

Péptidos que se Unen Específicamente a Proteína Morfogénica Ósea 2 ("BMP-2")

Aislamiento y Análisis de Péptidos

Se exploraron diez bibliotecas de presentación de fagos diferentes con respecto a la unión a BMP-2. BMP-2 (Medtronic) se biotiniló con NHS-biotina (Pierce) para producir una proteína marcada con un promedio de una biotina por molécula de proteína. Esta proteína se inmovilizó en placas cubiertas con estreptavidina (SA) y se usó como diana para la presentación de fagos. Como un método alternativo para presentar la proteína, la BMP-2 también se unió a perlas de sefarosa usando química NHS-succinimida de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Amersham-Pharmacia, Ref. Nº 18-1022-29, titulado "Coupling through the Primary Amine of a Ligand to NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow", págs. 105-108) y las perlas se usaron como una fase sólida para separar los fagos libres de los no unidos. Después de 3 rondas de selección, se ensayaron clones individuales de cada formato para la unión con respecto a BMP-2 en placas cubiertas con SA utilizando un ELISA convencional usando un anticuerpo anti-fago M13 conjugado con HRP, seguido de la adición de agente cromogénico ABTS.

Se determinó la secuencia de ADN que codifica péptidos que se unen especialmente a BMP-2. La secuencia que codifica el inserto peptídico se localizó en el genoma del fago y se tradujo para obtener la correspondiente secuencia de aminoácidos mostrada en la superficie del fago. Los péptidos representativos que se unen específicamente a BMP-2 se enumeran en la Tabla 3. En algunas realizaciones, un módulo de unión ejemplar de la invención comprende únicamente esta parte de la secuencia mostrada en letras mayúsculas.

TABLA 3 Péptidos que se Unen Específicamente a BMP-2

Los péptidos que se identificaron se incluyeron en 2 "agrupaciones de secuencia" diferentes. Cada agrupación de secuencia contiene un motivo de secuencia común. Para la primera agrupación de secuencia de péptidos de unión a BMP, el motivo común (denominado "Motivo 1" es aromático-X-X-Phe-X-"Small"-Leu (Aromático= Trp, Phe o Tyr; X = cualquier aminoácido; "Small" = Ser, Thr, Ala o Gly). El segundo motivo de agrupación de secuencia comprende la secuencia (Leu o Val)-X-Phe-Pro-Leu-(Lys o Arg)-Gly. Este motivo, denominado motivo 2, se expone en la SEC ID Nº 28. Las moléculas de unión ejemplares también comprenden secuencias que cumplen los requisitos de estos u otros motivos de secuencia identificados en este documento (es decir, que contienen una secuencia que se incluye dentro de estos motivos).

Se realizaron experimentos adicionales para determinar características adicionales de secuencias que se unen a BMP-2. Específicamente, con objeto de determinar si había aminoácidos adicionales preferidos alrededor de estos motivos, se realizaron exploraciones adicionales. Se diseñaron bibliotecas enfocadas y clonadas en el vector de presentación de fagos mAEK y el fago resultante se exploró para determinar la unión a B

Reivindicaciones:

1. Un biomaterial interfacial para recubrir una superficie de un implante, comprendiendo el biomaterial:

(a) al menos un módulo de unión que se une a la superficie de un implante, comprendiendo el módulo de unión un péptido que se une específicamente a un material de la superficie de un implante;
(b) al menos un módulo de unión que se une a un factor de crecimiento, en el que un módulo de unión comprende un péptido que tiene una secuencia Trp-X-X-Phe-X-X-Leu (SEC ID Nº: 73) o (Leu o Val)-X-Phe-Pro-Leu-(Lys o Arg)-Gly (SEC ID Nº: 28) en el que el al menos un módulo de unión que se une a la superficie de un implante y el al menos un módulo de unión que se une a un factor de crecimiento están unidos por un enlazador.

2. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la superficie de implante, para el cual el al menos un módulo de unión tiene especificidad de unión, comprende un material seleccionado del grupo constituido por polímero, cerámica, plástico, metal y una combinación de los mismos.

3. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el material de la superficie, para el cual el al menos un módulo de unión tiene especificidad de unión, comprende un polímero que comprende colágeno.

4. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el material de la superficie, para el cual el al menos un módulo de unión tiene especificidad de unión, comprende un polímero que comprende politetrafluoroetileno.

5. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el material de la superficie, para el cual el al menos un módulo de unión tiene especificidad de unión, comprende un metal que comprende aleación de titanio.

6. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el material de la superficie, para el cual el al menos un módulo de unión tiene especificidad de unión, comprende una cerámica que comprende óxido de zirconio.

7. El biomaterial de la reivindicación 1, en el que el al menos un módulo de unión que se une a la superficie de un implante y el al menos un módulo de unión que se une a un factor de crecimiento son un péptido continuo y el enlazador es uno de los enlaces en el péptido.

8. El biomaterial de la reivindicación 1, en el que el enlazador comprende un polímero, incluyendo un polímero sintético o un polímero natural.

9. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el factor de crecimiento, para el cual el al menos un módulo de unión tiene especificidad de unión, comprende proteína morfogenética ósea.

10. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende adicionalmente al menos un módulo de unión que comprende un péptido que se une a una célula.

11. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la célula es un osteoblasto.

12. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el al menos un módulo de unión que se une a una célula comprende una secuencia de aminoácidos de RGD.

13. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el al menos un módulo de unión que se une a una célula comprende una secuencia de aminoácidos de YIGSR.

14. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el al menos un módulo de unión que se une a una célula comprende una secuencia de aminoácidos de IKVAV.

15. Un implante cubierto con un biomaterial de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14.

16. Un módulo de unión que se une a un factor de crecimiento, comprendiendo el módulo de unión un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 73 o en la SEC ID Nº: 28.






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