Bibliotecas de proteínas de fusión de transferrina.

Una proteína de fusión que comprende una proteína MUC3 humana modificada codificada por el ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 76

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E12157790.

Solicitante: BIOREXIS PHARMACEUTICAL CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 235 EAST 42ND STREET NEW YORK, NY 10017-5755 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: TURNER,Andrew,John, WANG,BAIYANG.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/62 (Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/10 (Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/705 (Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/15 (modificados por la introducción de material genético extraño)

PDF original: ES-2535358_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Bibliotecas de proteínas de fusión de transferrina Solicitudes relacionadas

La presente solicitud está relacionada con la Solicitud Internacional PCT PCT/US2006/023742, presentada el 19 de junio de 2006, que reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/691.229, presentada el 17 de junio de 2005. La presente solicitud también está relacionada con la Solicitud de Patente de Estados Unidos 10/515.429, presentada el 23 de noviembre de 2004; la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/485.404, presentada el 9 de julio de 2003; la Solicitud de Patente de Estados Unidos 10/384.060 presentada el 10 de marzo de 2003; y la Solicitud Provisional de Estados Unidos 60/406.977, presentada el 30 de agosto de 2002.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de fusión, bibliotecas de proteínas de fusión.

Antecedentes de la invención

Sistemas de despliegue de la superficie celular

Los procedimientos combinatorios de cribado y selección de bibliotecas han llegado a ser herramientas de investigación comunes (Phizicky et al. (1995) Microbiological Reviews 59: 94 - 123). Una de las técnicas más extendidas es el despliegue en fago, mediante el cual una protema se expresa en forma de una fusión de polipéptidos a una proteína de recubrimiento de bacteriófago y posteriormente se seleccionan mediante la unión a un ligando inmovilizado o blotlnilado soluble. La presentación de péptidos aleatorios a menudo se lleva a cabo mediante la construcción de proteínas quiméricas expresadas sobre la superficie exterior de bacteriófagos filamentosos tales como M13, fd y f1. El despliegue en fago se ha aplicado de manera exitosa a anticuerpos, proteínas de unión a ADN, inhibidores de proteasa y enzimas. Véase Hoogenboom et al. (1997) Trends in Biotechnol. 15: 62 - 70; Ladner

(1995) Trends in Biotechnol. 13: 426 - 430; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30: 10832 - 10838; Markland et al.

(1996) Biochemistry 35: 8045 - 8057; y Matthews etal. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 1727 -1734.

Además del despliegue en fago, se han desarrollado varios procedimientos de despliegue en la superficie celular bacteriana. Véase Georgiou et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15: 29 - 34. Un planteamiento tomado en los procedimientos de despliegue en la superficie celular bacteriana ha sido usar una proteína de fusión que comprende una proteína pilina (TraA) o una parte de la misma y un pollpéptldo heterólogo que despliega el péptido de la biblioteca en la superficie exterior de una célula huésped bacteriana capaz de formar pelo. Véase la Patente de Estados Unidos 5.516.637.

La biblioteca de péptidos aleatorios FLITRX (Invitrogen Life Technologies) usa la proteína flagelar bacteriana, FliC, and tioredoxina, TrxA, para desplegar una biblioteca de péptidos aleatorios de dodecámeros sobre la superficie de E. coli de una manera conformacional restringida. Véase Lu et al. (1995) BioTechnology 13: 366. Estos sistemas se han aplicado al mapeo de epítopos de anticuerpo, el desarrollo y construcción de sistemas de distribución de vacunas bacterianas y la generación de bioabsorbentes de células enteras para los propósitos de depuración ambiental y diagnóstico. Las secuencias de péptidos que se unen a dianas específicas de tumor sobre las células epiteliales derivadas de tumor también se han identificado usando el sistema FLITRX. Véase Brown et al. (2000) Annals of Surgical Oncology, 7(10): 743.

Se han desarrollado sistemas de despliegue sobre la superficie celular de levaduras para la selección de bibliotecas y han superado con éxito algunas de las limitaciones de los sistemas de despliegue en fago y en bacterias. Los sistemas de despliegue sobre la superficie de levaduras, tal como el Kit pYD1 Yeast Display Vector (Invitrogen Life Technologies), usan el receptor de a-aglutinina de S. cerevisiae para desplegar proteínas extrañas sobre la superficie de la célula. El receptor de a-aglutinina consta de dos subunidades codificadas por los genes AGA1 y AGA2. La proteína Aga1 (Agalp, 725 aminoácidos) se secreta de la célula y se llega a unir de manera covalente a p-glucano en la matriz extracelular de la pared celular de levadura La proteína Aga2 (Aga2p, 69 aminoácidos) se une a Agalp mediante dos enlaces disulfuro y después de la secreción se mantiene unida a la célula mediante su contacto con Agalp. La parte N-terminal de Aga2p se requiere para la unión a Agalp, mientras que las proteínas y péptidos se pueden fusionar al extremo C para la presentación sobre la superficie celular de levaduras. La aglutinina es una proteína de levadura natural que normalmente funciona como un contacto de unión específico para fusionar células de levadura durante el apareamiento. Como tal, se ha desarrollado la unión proteína-proteína sin excesivo impedimento estérico de los componentes de la pared celular. Boder et al. en "Yeast Surface Display for Directed Evolution of Protein Expression, Affinlty , and Stability", Applications of Chimeric Genes and Hybrid Proteins, (Jeremy Thorner et al.), Academic Press, 2000, Vol. 328, páginas 430 - 439; documentos de US 6.699.658; y US 6.423.538.

Sin embargo, uno de los inconvenientes de este sistema, es que, como la proteína de fusión Aga2p -y Agalp se requieren para formar un enlace disulfuro con el fin de que la proteína Aga2p se sujete a la pared celular, la eficacia del despliegue es relativamente baja, desplegando de manera eficaz solamente 40% al 60% de las células de levadura la proteína sobre la superficie. Véase Feldhause et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21(2): 163 - 70. Existe una necesidad de un sistema de despliegue en levadura que presente la mayoría de, si no todas, las proteínas de una biblioteca sobre una superficie celular.

Otro inconveniente del sistema de despliegue en levadura de Agalp y Aga2p es que este requiere que el ligando a seleccionar esté unido al extremo C de Aga2p. Como resultado, el sistema no se puede usar para seleccionar péptidos en los que se requiera un extremo N libre para la unión y/o se requiera para actividad. De acuerdo con lo anterior, existe una necesidad de un sistema de despliegue flexible que no requiera la unión del extremo N del ligando a una proteína celular de levadura.

Proteína de fusión de transferrina

La transferrina (Tf) de suero es una glucoprotefna monomérica con un peso molecular de 80.000 daltons que se une al hierro en la circulación y lo transporta a diversos tejidos mediante el receptor de transferrina (TfR) (Aisen et al. (1980) Ann. Rev. Biochem. 49: 357 - 393; MacGillivray et al. (1981) J. Biol. Chem. 258: 3543 - 3553; y la Patente de Estados Unidos 5.026.651). Tf es una de las moléculas en suero más comunes, que comprende hasta aproximadamente 5 -10% de las proteínas en suero totales. La transferrina deficiente en carbohidratos se produce en niveles elevados en la sangre de individuos alcohólicos y muestra una semivida más larga (aproximadamente 14 - 17 días) que la de la transferrina glucosilada (aproximadamente 7-10 días). Véase van Eijk et al. (1983) Clin. Chim. Acta 132: 167 - 171; Stibler (1991) Clin. Chem. 37: 2029 - 2037; Arndt (2001) Clin. Chem. 47(1): 13 - 27; y Stibler et al. en "Carbohydrate-deficient consumption", Advances in the Biosciences, (Ed Nordmann et al.), Pergamon, 1988, Vol. 71, páginas 353 - 357). La estructura de Tf se ha caracterizado bien y se han elucidado los mecanismos de unión al receptor, unión a hierro y liberación y unión del ion carbonato. Véanse las Patentes de Estados Unidos 5.026.651, 5.986.067 y MacGillivray etal. (1983) J. Biol. Chem. 258(6): 3543 - 3546.

Las mucinas son una familia de proteínas altamente glucosiladas. Las mucinas y proteínas de tipo mucina se han usado para elevar un dominio de ligando de una proteína... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una proteína de fusión que comprende una proteína MUC3 humana modificada codificada por el ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 76.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un resto de anclaje.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 2, en la que la proteína de anclaje es un glucisil-fosfatidil-inositol (GPI).

4. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico que comprende la SEC ID NO: 76.

5. La célula huésped de la reivindicación 4, en la que la célula huésped es una célula huésped de levadura.

6. Una biblioteca que comprende una pluralidad de proteínas de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.