BETABLOQUEANTE FLUORESCENTE (+/-) RCTM-3 DE LOS RECEPTORES ADRENERGICOS DE TIPO BETA.

Betabloqueante fluorecente (+/-)-RCTM-3 y sus formas enantioméricas de los receptores andrenérgicos de tipo Beta que corresponde a la estructura química del propanolol sustituyéndose el anillo 1-naftol por el 9-hydroxy-4-methoxyacridine.

El compuesto resultante es una base débil con una liposolubilidad elevada y una estructura que lo hace fuertemente fluorescente y estable químicamente. Además presenta una eficiencia cuántica lumínica muy alta. Es un marcador de organelas secretoras muy eficiente para su uso en microscopía de epifluorescencia estándar. Su enorme eficiencia cuántica hace posible obtener imágenes de gran calidad con los láseres habituales en microscopía confocal o de onda evanescente

Betabloqueante fluorescente (+/-)-RCTM-3 de los receptores adrenérgicos de tipo ß.

Sector de la técnica

Biomedicina, farmacéutica.

Introducción

Los betabloqueantes son medicamentos utilizados para disminuir la presión arterial, reducir los trastornos del ritmo cardiaco y ralentizar el corazón. Como su nombre indica, "bloquean" la acción estimulante de moléculas presentes de forma natural en el cuerpo como la adrenalina, ocupando en su lugar su zona de acción, los receptores "beta" (1).

Los betabloqueantes se distinguen según si su eliminación se realiza por el hígado o los riñones, y según el tipo de receptores beta en los que se fijan: los receptores beta 1 predominan en los tejidos cardiacos y el riñón, los beta 2 en los vasos y los bronquios. Estos receptores reconocen específicamente ciertas moléculas denominadas catecolaminas, como la adrenalina o la noradrenalina, que estimulan el aparato cardiovascular, la respiración y el metabolismo. Al bloquear la acción de estas catecolaminas, los betabloqueantes pueden tratar la hipertensión, la taquicardia y la insuficiencia cardiaca crónica, así como la migraña y el glaucoma (en forma de colirio). Pueden tener efectos secundarios: trastornos cardiacos, constricción de los bronquios e hipoglucemias (1).

Los fármacos bloqueantes de los receptores beta-adrenérgicos se acumulan en el interior de las vesículas secretoras de las neuronas simpáticas (2,3). Probablemente sea este su mecanismo de acción hipotensor. Sin embargo, estos compuestos no se han podido visualizar debido a que sólo son fluorescentes en el ultravioleta lejano. A esas longitudes de onda muchos componentes celulares también lo son.

Referencias

1- Goodman LS, Gilman A, Bruton LL, et al. The pharmacological basis of therapeutics. New York: McGraw-Hill; 2006.

2- Boksa P. Studies on the uptake and release of propranolol and the effects of propranolol on catecholamines in cultures of bovine adrenal chromaffin cells. Biochem Pharmacol. 1986; 35(5):805-815.

3- Bagwell EE, Webb JG, Walle T, et al. Stereoselective uptake of atenolol into storage granules isolated from PC12 cells. J Pharmacol Exp Ther. 1989; 249(2):476-482.

Estado de la técnica

Son conocidos métodos y composiciones como el descrito en el documento US2004137611 donde se utiliza la emisión luminosa para monitorizar el comportamiento celular.

Sin embargo, no existe, en nuestro conocimiento ningún beta-bloqueante fluorescente en el ultravioleta cercano ni en el visible, circunstancia que cumple el RCTM-3 (figura 2). Entendemos que el compuesto (±)-RCTM-3 es novedoso tanto en su estructura, su aplicación y la descripción del mecanismo de acción de esta familia farmacológica.

El RCTM-3 además, por sus características físico-químicas, es captado por las vesículas secretoras constituyendo un excelente marcador fluorescente de las mismas. Esta circunstancia puede ser utilizada para la monitorización de la secreción por métodos fluorescentes, para la localización de beta-bloqueantes en tejidos y en sus fracciones y en general para el seguimiento de los mismos. Las propiedades fluorescentes servirían para estudios de fijación de fármacos eliminando la necesidad de utilizar compuestos radiactivos.

Descripción de la invención

La estructura química y el método de síntesis de muestran en la figura 1. Este compuesto está relacionado con la estructura química del propranolol sustituyéndose el anillo de 1-naftol por el 9-hydroxy-4-methoxyacridine (Aldrich). El compuesto resultante es una base débil con una liposolubilidad elevada y una estructura que lo hace fuertemente fluorescente y estable químicamente (Figura 1).

El (±)-RCTM-3 tiene acciones ß-bloqueantes no selectivas (ß_1-3). La potencia bloqueadora ß₁ es algo inferior (IC50=18 µM) (figura 3) al de otros fármacos comerciales pero se acumula en las vesículas secretoras con enorme afinidad. La figura 3 muestra que la frecuencia cardiaca espontánea (240 ± 10 l.p.m.) se incrementó notablemente con 300 nM de adrenalina (342 ± 12 l.p.m). El ±RCTM-3 produjo una inhibición concentración dependiente con una IC50 de 18 µM. Este efecto es reversible si se mantiene la adrenalina y se elimina el RCTM-3 del medio.

Además, el RTCM-3 presenta una alta eficiencia cuántica lumínica muy alta 200 veces labetalol y 20 veces quinacrina. Esta acumulación selectiva hace a las vesículas muy brillantes cuando se iluminan células con luz de ? 424 nm. Es un marcador de organelas secretoras muy eficiente para su uso en microscopía de epifluorescencia estándar. Su enorme eficiencia cuántica hace posible obtener imágenes de gran calidad con los láseres habituales en microscopía confocal o de onda evanescente cuyas líneas espectrales de excitación son más altas (? 458 nm) y donde sólo se excita el 2% del total. Se observa la co-localización del RCTM-3 con gránulos cromafines bovinos que sobreexpresan cromogranina A de ratón marcada con quimera con la variante mejorada de la proteína verde fluorescente de medusa (EGFP). Las imágenes muestran una célula cromafín transfectada e incubada con el fármaco, tomando fotografías con un microscopio de onda evanescente Zeiss 200. En verde CgA-EGFP y en azul el RCTM-3. Sólo son visibles las estructuras fluorescentes situadas a menos de 150 nm de la membrana celular. Igualmente, al co-liberarse con los neurotransmisores puede ser utilizado para la detección (por la medida directa de la fluorescencia) de la actividad secretora celular.

Descripción de las figuras

Figura 1. Estrategia de síntesis del (±)-RCTM-3

Figura 2. Espectros de fluorescencia del RCTM-3. En el panel superior se muestra es el de excitación (emisión fijada a 485 nm) y en el inferior el de emisión (excitado a 424 nm). El recuadro en la gráfica superior muestra la banda de excitación de la línea de láser utilizada en la figura 4, cuya eficiencia sería de sólo 2-5%.

Figura 3. Inhibición de la frecuencia cardiaca en aurícula de rata pre-estimulada con adrenalina. Los datos muestra media ± error estándar.

Modos de realización de la invención

En la figura 1 se muestra la estrategia de síntesis. En la figura 2 se muestran los espectros de excitación y emisión del (±)-RCTM-3. El estudio se llevó a cabo en cubetas de cuarzo en un espectrofluorímetro Varian Eclipse. Las propiedades fluorescentes de la molécula no se ven influenciadas por el pH del medio. Los recuadros indican la línea de excitación del láser y de corte del dicroico en excitación y en emisión respectivamente.

1. Betabloqueante fluorescente (±)-RCTM-3 de los receptores adrenérgicos de tipo Beta que corresponde a la estructura química del propranolol sustituyéndose el anillo de 1-naftol por el 9-hydroxy-4-methoxyacridine según:

2. Forma enantiomérica (R)-RCTM-3 del betabloqueante fluorescente (±)-RCTM-3 de los receptores adrenérgicos de tipo Beta que corresponde a la estructura química del propranolol sustituyéndose el anillo de 1-naftol por el 9-hydroxy-4-methoxyacridine según:

3. Forma enantiomérica (S)-RCTM-3 del betabloqueante fluorescente (±)-RCTM-3 de los receptores adrenérgicos de tipo Beta que corresponde a la estructura química del propranolol sustituyéndose el anillo de 1-naftol por el 9-hydroxy-4-methoxyacridine según: