Procedimientos basados en OLA para la detección de secuencias de ácidos nucleicos objetivo.

Procedimiento para determinar la presencia, ausencia o cantidad de una secuencia de nucleótidos diana en una muestra de ácido nucléico, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:

a) proporcionar a una muestra de ácido nucléico una primera sonda

(1) para cada secuencia diana (T) a detectar en la muestra, de manera que la primera sonda tiene una primera sección (4) específica de la diana que es complementaria de una primera parte de la secuencia diana (5) y una segunda sonda (2) para cada secuencia diana a detectar en la muestra, de manera que la segunda sonda tiene una segunda sección (6) específica diana, que es complementaria de una segunda parte de la secuencia diana (7), de manera que la primera y la segunda partes de la secuencia diana están situadas adyacentes entre sí (3), y de manera que la segunda sonda comprende además una sección de etiqueta (8) que es esencialmente no complementaria de la secuencia diana, de manera que la sección de etiqueta comprende una primera sección de unión a cebador (10);

b) permitir que la primera y segunda secciones específicas diana de la primera y segunda sondas se reasocien a la primera y segunda partes de cada secuencia diana que se encuentra presente en la muestra, de manera que la primera y la segunda secciones específicas diana de las sondas son reasociadas de forma adyacente en la secuencia diana;

c) proporcionar medios para conectar la primera y segunda secciones específicas diana reasociadas de forma adyacente a la secuencia diana, y permitiendo que la primera y segunda secciones específicas diana sean conectadas para producir una sonda conectada (11) correspondiente a una secuencia diana de la muestra;

d) proporcionar a la mezcla resultante de la etapa c) un cebador compuesto (12) que comprende una sección (15) que es complementaria a, por lo menos, una parte de la primera sección específica diana y una segunda sección de unión a cebador (14);

e) permitir que el cebador compuesto se reasocie a, como mínimo, una parte de la primera sección específica diana

f) alargar el cebador compuesto;

g) proporcionar un conjunto de cebadores que comprenden un cebador (18) que tiene una secuencia esencialmente idéntica a la primera sección de unión a cebador de la sonda conectada, y un segundo cebador (17) que es esencialmente idéntico a la segunda sección de unión a cebador del cebador compuesto;

h) amplificar la mezcla resultante para producir una muestra amplificada que comprende amplicones (19) que son representaciones de las sondas conectadas;

i) determinar la presencia, ausencia o cantidad de una secuencia diana en la muestra detectando la presencia, ausencia o cantidad del amplicón correspondiente.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2004/000604.

Solicitante: KEYGENE N.V..

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: AGRO BUSINESS PARK 90 6708 PW WAGENINGEN PAISES BAJOS.

Inventor/es: HOGERS,RENE,CORNELIS,JOSEPHUS.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)

PDF original: ES-2539784_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimientos basados en OLA para la detección de secuencias de ácidos nucléicos objetivo Sector de la invención La presente invención se refiere al sector de la biología molecular y de la biotecnología. En particular, la invención se refiere al sector de la detección de ácido nucléico, más en particular al diseño y composición de (colecciones) de sondas que pueden ser utilizadas para la detección de los ácidos nucléicos. La invención se refiere también a procedimientos para la detección de ácidos nucléicos que utilizan estas sondas y las composiciones. La invención da a conocer además sondas que son capaces de hibridar a una secuencia diana de interés, cebadores para la amplificación de sondas ligadas, utilización de estas sondas y cebadores en la identificación y/o detección de secuencias de nucleótidos que se refieren a una amplia variedad de trazos genéticos y genes, así como kits de cebadores y/o sondas adecuadas para su utilización en el procedimiento de acuerdo con la invención.

Antecedentes de la invención Existe un interés rápidamente creciente en la detección de secuencias específicas de ácido nucléico. Este interés se ha suscitado no solamente por la secuencia de nucleótido del genoma humano y la presencia en el mismo, así como en los genomas de muchos otros organismos, de una abundante cantidad de polimorfismos de nucleótidos individuales (SNP) , sino también de las tecnologías de marcadores tales como AFLP y el reconocimiento general de la relevancia de la detección de secuencias específicas de ácido nucléico como indicación, por ejemplo, de enfermedades heredables genéticamente. La detección de los diferentes alelos del gen BRCA 1 de cáncer de mama para cribar la susceptibilidad de cáncer de mama es solamente uno de los numerosos ejemplos. El reconocimiento de que la presencia de sustituciones de nucleótidos individuales (y otros tipos de polimorfismos genéticos tales como pequeñas inserciones/deleciones; indelos) en genes proporciona una amplia variedad de información, ha contribuido a este interés incrementado. Se reconoce actualmente de manera general que estas sustituciones de nucleótidos individuales son una de las causas principales de un número significativo de enfermedades monogénicamente y multigénicamente heredadas, por ejemplo, en humanos, o que por otra parte están involucrados en el desarrollo de complejos fenotipos tales como trazos de comportamiento en plantas y especies de animales de granja. De este modo, las sustituciones de nucleótidos individuales están relacionadas también en muchos casos a o como mínimo son indicativas de importantes trazos en humanos, plantas y especies de animales.

El análisis de estas sustituciones de nucleótidos individuales e indelos resultará en una riqueza de información valiosa, que tendrá implicaciones amplias en la medicina y en la agricultura en los términos más amplios posibles. Se prevé, por ejemplo, de manera general, que estos desarrollos resultarán en medicación específica para los pacientes. Para analizar estos polimorfismos genéticos, hay una necesidad creciente de procedimientos adecuados, fiables y rápidos que posibiliten la manipulación de un gran número de muestras, y grandes números de SNP (predominantemente) en una forma de producción elevada, sin comprometer significativamente la calidad de los datos obtenidos. Uno de los procedimientos principales utilizados para el análisis de los ácidos nucléicos de una secuencia conocida se basa en la reasociación de dos sondas a una secuencia diana y, cuando las sondas están hibridadas de forma adyacente a la secuencia diana, efectuar el ligado de las sondas. Este concepto es designado de manera común como Ensayo de Ligado de Oligonucleótidos o Amplificación de Ligado de Oligonucleótidos (OLA) .

El principio OLA ha sido descrito, entre otros, en el documento US 4.988.617 (Landegren y otros) . Esta publicación da a conocer un procedimiento para determinar la secuencia de ácido nucléico en una región de una secuencia de ácido nucléico conocida que tiene una posible mutación conocida. Para detectar la mutación, se seleccionan oligonucleótidos para reasociar a segmentos inmediatamente adyacentes de la secuencia a determinar. Una de las sondas de oligonucleótidos seleccionada tiene una región extrema, de manera que uno de los nucleótidos de la sección extrema es complementario del nucleótido normal o el nucleótido mutado en la posición correspondiente en la secuencia de ácido nucléico conocida. Se da a conocer una ligasa que conecta de manera covalente las dos sondas cuando se corresponden correctamente en pares de bases y están situadas de manera inmediatamente adyacente entre sí. La presencia, ausencia o cantidad de las sondas enlazadas es una indicación de la presencia, ausencia o cantidad de la secuencia conocida y/o de la mutación.

Abbot y otros, en el documento WO 96/15271 desarrollaron un procedimiento para un proceso de amplificación de ligado múltiplex que comprende la hibridación y ligado de sondas adyacentes. Estas sondas están dotadas de un segmento de longitud adicional, cuya secuencia, de acuerdo con Abbot y otros, es poco importante. La introducción deliberada de diferencias de longitud, intenta facilitar la discriminación en base a la longitud del fragmento en técnicas basadas en gel.

Los documentos WO 97/45559, W097/31256, W098/03673, W000/56929, W000/56927, W000/40755 (Barany y otros) describen procedimientos para la detección de diferencias de secuencias de ácido nucléico utilizando combinaciones de reacciones de detección de ligasa (LDR) y reacciones de cadena de polimerasa (PCR) . Se dan a conocer procedimientos que comprenden la reasociación de pares de sondas alelo-específicas a una secuencia diana y subsiguiente ligado con ligasa termoestable. La amplificación de los productos ligados con cebadores etiquetados de forma fluorescente tiene como resultado un producto amplificado etiquetado de forma fluorescente. La detección de los productos se basa en la separación por tamaño o en la movilidad electroforética o en un conjunto direccionable.

Se han dado a conocer otras variantes de técnicas basadas en OLA, entre otros en Nilsson y otros. Human mutation, 2002, 19, 410-415; Science 1994, 265: 2085-2088; US 5.876.924; WO 98/04745; WO 98/04746; US6.221.603; WO 03/054511, US5521065, US5962223, EP185494, EP246864, US6027889, EP745140, EP964704, US20030119004, US2003190646, EP1313880.

Publicaciones recientes (Hardenbol y otros, Nat. Biotechnology 2003, 21, 673-678; Baner y otros, Nucleic Acids Research, 2003, 31, e103) han mostrado que el principio OLA puede ser altamente multiplexado, haciendo del mismo una técnica atractiva para genotipado de SNP de alto rendimiento, especialmente en combinación con plataformas de detección basadas en la secuencia, tal como las utilizadas por los autores de este documento. No obstante, en combinación con plataformas de detección basadas en longitud, la elevada capacidad multiplex de la técnica OLA es difícil de explotar, debido a la distribución limitada de tamaños de los productos de amplificación obtenidos a partir de sondas ligadas que pueden ser separadas de forma detectable utilizando instrumentos de secuenciación corrientes (capilares) cuando se utilizan sondas de ligado sintetizadas por medios químicos. La razón de ello es que el límite superior de las técnicas de síntesis de oligonucleótidos de tipo químico disponibles se encuentra aproximadamente en 100 a 150 pares de bases, que es mucho menor que el rango de dimensiones cubierto por la mayor parte de instrumentos de secuenciación (capilares) . No obstante, los instrumentos de secuenciación o placas de gel son plataformas potentes de detección debido a su facilidad de utilización, tiempo manual limitado y costes... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para determinar la presencia, ausencia o cantidad de una secuencia de nucleótidos diana en una muestra de ácido nucléico, comprendiendo el procedimiento las siguientes etapas:

a) proporcionar a una muestra de ácido nucléico una primera sonda (1) para cada secuencia diana (T) a detectar en la muestra, de manera que la primera sonda tiene una primera sección (4) específica de la diana que es complementaria de una primera parte de la secuencia diana (5) y una segunda sonda (2) para cada secuencia diana a detectar en la muestra, de manera que la segunda sonda tiene una segunda sección (6) específica diana, que es complementaria de una segunda parte de la secuencia diana (7) , de manera que la primera y la segunda partes de la secuencia diana están situadas adyacentes entre sí (3) , y de manera que la segunda sonda comprende además una sección de etiqueta (8) que es esencialmente no complementaria de la secuencia diana, de manera que la sección de etiqueta comprende una primera sección de unión a cebador (10) ; b) permitir que la primera y segunda secciones específicas diana de la primera y segunda sondas se reasocien a la primera y segunda partes de cada secuencia diana que se encuentra presente en la muestra, de manera que la primera y la segunda secciones específicas diana de las sondas son reasociadas de forma adyacente en la secuencia diana; c) proporcionar medios para conectar la primera y segunda secciones específicas diana reasociadas de forma adyacente a la secuencia diana, y permitiendo que la primera y segunda secciones específicas diana sean conectadas para producir una sonda conectada (11) correspondiente a una secuencia diana de la muestra; d) proporcionar a la mezcla resultante de la etapa c) un cebador compuesto (12) que comprende una sección (15) que es complementaria a, por lo menos, una parte de la primera sección específica diana y una segunda sección de unión a cebador (14) ; e) permitir que el cebador compuesto se reasocie a, como mínimo, una parte de la primera sección específica diana f) alargar el cebador compuesto; g) proporcionar un conjunto de cebadores que comprenden un cebador (18) que tiene una secuencia esencialmente idéntica a la primera sección de unión a cebador de la sonda conectada, y un segundo cebador (17) que es esencialmente idéntico a la segunda sección de unión a cebador del cebador compuesto; h) amplificar la mezcla resultante para producir una muestra amplificada que comprende amplicones (19) que son representaciones de las sondas conectadas; i) determinar la presencia, ausencia o cantidad de una secuencia diana en la muestra detectando la presencia, ausencia o cantidad del amplicón correspondiente.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la proporción molar del primero, el segundo o el primero y el segundo cebadores con respecto al cebador compuesto está comprendida entre 10 y 1000.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, en el que se facilitan el primer y el segundo cebadores a la mezcla resultante de la etapa c) antes del alargamiento del cebador compuesto en la etapa f) .

4. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el cebador compuesto comprende además una sección que es complementaria de la segunda sección específica diana.

5. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que los lugares de unión de cebador son lugares de unión de cebador universales.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que, como mínimo, uno de dichos primer y segundo cebadores es un cebador selectivo.

7. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que un amplicón correspondiente a una secuencia diana de la muestra difiere en longitud, masa o etiqueta de un amplicón que corresponde a una secuencia diana diferente de la muestra.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la sección de etiqueta comprende una secuencia identificadora.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que para cada secuencia diana de la muestra se facilita al correspondiente amplicón una única secuencia identificadora.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la presencia, ausencia o cantidad de una secuencia diana en una muestra es detectada al detectar los amplicones que representan las sondas conectadas basándose en la masa molecular, longitud, etiqueta o secuencia.

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que el identificador proporciona la diferencia de masa molecular, longitud o secuencia.

12. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la secuencia diana es seleccionada del grupo de ADN, ARN, ARNm, poliA+ ARN, ADNc, ADN genómico, ADN organular tal como ADN mitocondrial o ADN cloroplástico, ácidos nucléicos sintéticos, bibliotecas de ADN, bancos de clones o cualquier selección o combinación de los mismos.

13. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la primera sonda comprende además una primera sección de cierre (“clamp section”) , y una segunda sonda comprende además una segunda sección de cierre, en el que la primera y segunda secciones de cierre son capaces de hibridarse una a otra.

14. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera o la segunda sonda comprenden otra región adicional que no es capaz de reasociarse a la secuencia de ácido nucléico diana, estando situada dicha región adicional en el extremo de la primera o segunda sonda, en la posición del lugar de unión entre la primera y segunda secciones de la secuencia de ácido nucléico diana.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, en el que la otra región adicional es capaz de crear una estructura de segmentación, y en el que al exponer la estructura de segmentación a un agente de segmentación, tendrá como resultado la segmentación de la estructura de segmentación cuando dichos estructura de segmentación y agente de segmentación son incubados en condiciones en las que pueda tener lugar la segmentación.

16. Utilización de un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para detección de alta producción de una multiplicidad de secuencias de nucleótidos diana.

17. Utilización, según la reivindicación 16, para la detección de polimorfismos, preferentemente polimorfismos de nucleótido único.

18. Utilización, según las reivindicaciones 16 ó 17, para determinar el perfilado de transcritos, para la detección de la abundancia cuantitativa de secuencias de ácido nucléico diana, para mapeado genético, descubrimiento de genes, selección asistida por marcador, control de la calidad de simiente, selección de híbrido, mapeado QTL, análisis segregante en masa, establecimiento de huella dactilar de ADN y para dar a conocer información relativa a trazos, resistencia a la enfermedad, rendimiento, vigor híbrido, y/o función de gen.

19. Conjunto de primera y segunda sondas de oligonucleótidos, en el que la primera sonda tiene una primera sección (4) específica de diana que es complementaria de una primera parte de la secuencia diana (5) y en el que la primera sonda no comprende una secuencia de unión a cebador, y en el que la segunda sonda tiene una sección específica diana (6) que es complementaria de una segunda parte de la secuencia diana de manera que la segunda sonda comprende una sección de etiqueta (8) que es esencialmente no complementaria de la secuencia diana y comprende una secuencia de unión a cebador (10) , y un conjunto de cebadores y un cebador compuesto adecuados para llevar a cabo el procedimiento definido en las reivindicaciones 1-15.

20. Conjunto de cebadores y cebador compuesto adecuados para llevar a cabo el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

21. Kit que comprende las sondas de oligonucleótidos y cebadores de la reivindicación 19 o los cebadores de la reivindicación 20.

22. Utilización de un cebador compuesto en un procedimiento, según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-15.

23. Kit, según la reivindicación 21 y 22, que comprende cebadores y/o sondas de oligonucleótidos, y/o sondas combinadas para utilización en un procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.