Bacterias corineformes con actividad de escisión de glicina.

Método para la producción de L-metionina en una corinebacteria, seleccionada del grupo que consiste en la especie Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium melassecola y Corynebacterium effiziens, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida productor de metionina que es una corinebacteria de tipo salvaje o una corinebacteria que ya posee alteraciones genéticas en comparación con la corinebacteria de tipo salvaje, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina

(GCS) está incrementado en dicho microorganismo en comparación con el organismo de partida, y en el que la cantidad y/o actividad de ácido lipoico sintasa (lipA), lipoil tansferasa (lipB) o lipA y lipB están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11193520.

Solicitante: EVONIK DEGUSSA GMBH.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: RELLINGHAUSER STRASSE 1-11 45128 ESSEN ALEMANIA.

Inventor/es: SCHRODER, HARTWIG, ZELDER, OSKAR, PERO, JANICE G., HAEFNER,Stefan, HEROLD,Andrea, KLOPPROGGE,Corinna, YOCUM,R.,Rogers, PATTERSON,THOMAS A.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/52 (Genes que codifican enzimas o proenzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P13/12 (Metionina; Cisteína; Cistina)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/77 (para Corynebacterium; para Brevibacterium)

PDF original: ES-2517394_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Bacterias corineformes con actividad de escisión de glicina Campo de la invención La presente invención se refiere a métodos para producir L-metionina y a bacterias corineformes que presentan un sistema de escisión de glicina funcional.

Antecedentes de la invención Actualmente, la producción anual mundial de metionina es alrededor de 500.000 toneladas. La metionina es el primer aminoácido limitante en el ganado de aves de corral y en el pienso, y, debido a esto, se aplica principalmente como suplemento del pienso.

En contraste con otros aminoácidos industriales, la metionina se aplica casi exclusivamente como un racemato de Dy L-metionina, que se produce mediante síntesis química. Puesto que los animales pueden metabolizar ambos estereoisómeros de metionina, es posible la alimentación directa de la mezcla racémica producida químicamente (D’Mello y Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animals: Amino Acids, Rechgigl (Ed.) , CRC Handbook Series in Nutrition and Food, 441-490, 1978) .

Sin embargo, existe todavía un gran interés en la sustitución de la producción química existente mediante un procedimiento biotecnológico que produzca exclusivamente L-metionina. Esto es debido al hecho de que, a menores niveles de suplementación, L-metionina es una mejor fuente de aminoácidos de azufre que D-metionina (Katz y Baker (1975) Poult. Sci. 545: 1667-74) . Además, el procedimiento químico usa sustancias químicas más bien peligrosas, y produce corrientes residuales sustanciales. Todas estas desventajas de producción química se podrían evitar mediante un procedimiento biotecnológico eficiente.

La producción fermentativa de sustancias químicas finas, tales como aminoácidos, compuestos aromáticos, vitaminas y cofactores, se lleva a cabo típicamente hoy en microorganismos tales como Cor y nebacterium glutamicum (C. glutamicum) , Escherichia coli (E. coli) , Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) , Schizzosaccharomycs pombe (S. pombe) , Pichia pastoris (P. pastoris) , Aspergillus niger, Bacillus subtilis, Ashbya gossypii, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus o Gluconobacter oxydans.

Los aminoácidos tales como glutamato se producen así usando métodos de fermentación. Para estos fines, se ha mostrado que ciertos organismos tales como Escherichia coli (E. coli) y Cor y nebacterium glutamicum (C. glutamicum) son particularmente adecuados. La producción de aminoácidos mediante fermentación también tiene, entre otras, la ventaja de que sólo se producen L-aminoácidos, y que se evitan sustancias químicas medioambientalmente problemáticas tales como disolventes, ya que se usan típicamente en síntesis química.

Algunos intentos en la técnica anterior para producir sustancias químicas finas tales como aminoácidos, lípidos, vitaminas o hidratos de carbono en microorganismos tales como E. coli y C. glutamicum han intentado lograr esta meta incrementando, por ejemplo, la expresión de genes implicados en las rutas biosintéticas de las sustancias químicas respectivas.

Los intentos para incrementar la producción de por ejemplo lisina al aumentar la expresión de genes que están implicados en la ruta biosintética de la producción de lisina se describen, por ejemplo, en los documentos WO 02/10209, WO 2006008097, WO2005059093, o en Cremer et al. (Appl. Environ. Microbiol, (1991) , 57 (6) , 17461752) .

Krömer et al. (Metabolic Engineering 8 (2006) 353-369) analizan rutas metabólicas teóricas para la producción de Lmetionina mediante E. coli y C. glutamicum. A fin de mejorar la producción de metionina a partir de sustratos de azúcar mediante C. glutamicum, los autores proponen introducir el sistema de escisión de glicina en C. glutamicum.

Sin embargo, existe todavía una fuerte necesidad para identificar dianas adicionales en las rutas metabólicas que se puedan usar para influir beneficiosamente en la producción de metionina en microorganismos tales como C. glutamicum.

Objeto y sumario de la invención Es un objeto de la presente invención proporcionar métodos para la producción de L-metionina en microorganismos.

Es un objeto además de la presente invención proporcionar microorganismos que producen L-metionina.

Estos y otros objetos de la invención, según se manifestarán a partir de las descripciones que se suceden, se logran mediante la materia objeto de las reivindicaciones independientes.

Otras realizaciones de la invención se definen por las reivindicaciones dependientes.

El método usa un microorganismo del género Cor y nebacterium. Se prefiere particularmente el uso de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

La presente invención se refiere a métodos en los que se cultiva un microorganismo, a saber, una corinebacteria, que se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina (GCS) está incrementada en comparación con el organismo de partida.

Esto se puede lograr mediante modificación genética de un organismo de partida de manera que la cantidad y/o actividad de glicina descarboxilasa dependiente de PLP (gcvP, proteína P) , aminometil transferasa que contiene lipoamida (gcvH, proteína H) y enzima sintetizadora de N5, N10-metileno-THF (gcvT, proteína T) están incrementadas en comparación con el organismo de partida. Estas modificaciones genéticas aseguran que la glicina acumulada se convierta en NH4+, CO2 y N5, N10-metileno-THF. Los microorganismos se pueden cultivar en presencia de ácido lipoico y/o lipoamida.

Adicionalmente, los microorganismos se modifican además genéticamente de manera que presentan una mayor cantidad y/o actividad biológica de ácido lipoico sintasa (lipA) , lipoil transferasa (lipB) , y/o ácido lipoico sintetasa (lplA) .

Los microorganismos cultivados se pueden modificar adicional o alternativamente de forma genética para presentar una mayor cantidad y/o actividad de una lipoamida deshidrogenasa (lpd) que requiere FAD, dependiente de NAD+.

Se describe además un método que permite producir L-metionina cultivando microorganismos que se han modificado genéticamente de manera que se incrementa la cantidad y/o actividad biológica de formiato-THFsintetasa, y de manera que se ha establecido un sistema de escisión de glicina funcional. Tales microorganismos presentarán típicamente una mayor cantidad y/o actividad biológica de formiato-THF-sintetasa, gcvH, gcvP y gcvT (gcvHPT) . En un aspecto, estos últimos microorganismos se cultivarán en presencia de ácido lipoico y/o lipoamida. Como alternativa, o adicionalmente, los microorganismos se pueden modificar además genéticamente para presentar una mayor cantidad y/o actividad de lipA, lipB y/o lplA. Los microorganismos también pueden presentar una mayor cantidad y/o actividad biológica de lpd.

Las realizaciones descritas anteriormente de métodos según la invención se llevan a cabo preferiblemente cultivando microorganismos de la especie C. glutamicum. Las modificaciones genéticas descritas anteriormente se pueden introducir en una cepa de tipo salvaje de C. glutamicum. En realizaciones preferidas, estas alteraciones genéticas se introducen en una cepa de C. glutamicum que ya se considera que es una cepa productora de metionina.

Las secuencias codificantes para las formiato-THF-sintetasa gcvP, gcvT, gcvH, lplA, lipA y lipB mencionadas anteriormente derivan preferiblemente de C. jeikeium o E. coli. Se han de considerar particularmente las secuencias de C. jeikeium en caso de que el método se lleve a cabo cultivando cepas de C. glutamicum.

Se describen además microorganismos que se han derivado mediante modificación genética a partir de un microorganismo de partida para producir más... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la producción de L-metionina en una corinebacteria, seleccionada del grupo que consiste en la especie Cor y nebacterium glutamicum, Cor y nebacterium acetoglutamicum, Cor y nebacterium acetoacidophilum, Cor y nebacterium thermoaminogenes, Cor y nebacterium melassecola y Cor y nebacterium effiziens, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida productor de metionina que es una corinebacteria de tipo salvaje o una corinebacteria que ya posee alteraciones genéticas en comparación con la corinebacteria de tipo salvaje, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina (GCS) está incrementado en dicho microorganismo en comparación con el organismo de partida, y en el que la cantidad y/o actividad de ácido lipoico sintasa (lipA) , lipoil tansferasa (lipB) o lipA y lipB están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética de un organismo de partida de manera que la cantidad y/o actividad de

glicina descarboxilasa dependiente de PLP (gcvP) ,

enzima sintetizadora de N5, N10-metileno-THF (gcvT) y

aminometil transferasa que contiene lipoamida (gcvH)

están incrementadas en dicho microorganismo en comparación con el organismo de partida.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de C. jeikeium.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de E. coli.

5. Corinebacteria seleccionada del grupo que consiste en la especie Cor y nebacterium glutamicum, Cor y nebacterium acetoglutamicum, Cor y nebacterium acetoacidophilum, Cor y nebacterium thermoaminogenes, Cor y nebacterium melassecola y Cor y nebacterium effiziens, en la que dicha corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida productor de metionina que es una corinebacteria de tipo salvaje o una corinebacteria que ya posee alteraciones genéticas en comparación con la corinebacteria de tipo salvaje, de manera que la actividad enzimática de un sistema de escisión de glicina (GCS) está incrementada en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida, y en la que la cantidad y/o actividad de lipA, lipB o lipA y lipB están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

6. Corinebacteria según la reivindicación 5, en la que la corinebacteria es una cepa de C. glutamicum.

7. Corinebacteria según las reivindicaciones 5 ó 6, en el que la corinebacteria se obtiene mediante modificación genética a partir de un organismo de partida de manera que la cantidad y/o actividad de gcvP, gcvT y gcvH están incrementadas en dicha corinebacteria en comparación con el organismo de partida.

8. Corinebacteria según la reivindicación 7, en la que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de C. jeikeium.

9. Corinebacteria según la reivindicación 7, en la que las secuencias codificantes para gcvP, gcvT, gcvH, lipA y lipB son de E. coli.

Figura 1