Bacillus subtilis no esporulante que tiene partes del gen que codifica Sigma G eliminadas.

Una cepa no esporulante de Bacillus subtilis, caracterizada por que comprende:

una supresión de al menos 300 nucleótidos en su gen sigG

, por lo cual la supresión comprende al menos parte deambas regiones funcionales del gen sigG que codifican los aminoácidos 67 a 80 o 229 a 248, respectivamente, de laproteína sigG, y que dicha cepa tiene la capacidad de producir un polipéptido recombinante.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FI2002/000861.

Solicitante: Synthetic Biologics, Inc.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 617 Detroit Street Ann Arbor, MI 48104 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: KOSKI,PERTTI, KÄÄRIÄINEN,SUSANNA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/09 (Tecnología del ADN recombinante)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/75 (para Bacillus)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > EQUIPOS PARA ENZIMOLOGIA O MICROBIOLOGIA (instalaciones... > Equipos para enzimología o microbiología > C12M1/107 (con medios para recoger los gases de fermentación, p. ej. metano (producción de metano por tratamiento anaerobio de lodos C02F 11/04))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/21 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > C12P21/00 (Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas;... > C07K14/32 (de Bacillus (G))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/86 (actúan sobre los enlaces amida de las amidas cíclicas, p. ej. penicilinasa)

PDF original: ES-2452292_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Bacillus subtilis no esporulante que tiene partes del gen que codifica Sigma G eliminadas Campo de la invención La invención se refiere a una cepa de Bacillus subtilis no esporulante, a un método para su preparación y a su uso como un organismo de producción. Además, la invención se refiere a un método para la preparación de un producto preparado biológicamente usando una bacteria no esporulante.

Fundamento de la invención Las bacterias del género Bacillus se usan de forma extensiva en la producción de diferentes enzimas industrialmente significativas. Los huéspedes de producción más significativos son B. amyloliquefaciens y B. licheniformis que se usan como productores de proteasas y amilasas, por ejemplo. Los procedimientos industriales generan cantidades significativas de masa bacteriana que necesita desactivarse antes de su descarga en el medioambiente, especialmente si la bacteria es una bacteria manipulada genéticamente. La destrucción de células de producción esporuladas necesita un procesado más intensivo que las células asporógenas. Las esporas de Bacillus resisten al calor mucho mejor que las células vegetativas y por lo tanto, destruirlas por calentamiento necesita temperaturas altas y tratamientos de larga duración. Estos tratamientos aumentan invariablemente el equipo y costes de operación en la producción. Esto es por lo que es deseable usar una cepa no esporulante de Bacillus. La presente invención proporciona una solución al problema de la esporulación que mejora significativamente el uso de B. subtilis como un organismo de producción.

La esporulación es un suceso multietapa (I a VII) que se inicia en ciertas condiciones de cultivo en que primero se crea una pre-espora dentro de la célula madre. Finalmente, la célula madre muere y la espora adulta se libera. La espora resiste a mayor sequedad y calor que la célula madre y así asegura la supervivencia de la bacteria en condiciones desfavorables. En condiciones favorables, la espora se activa y la división de la célula bacteriana se reinicia. Las diferentes etapas de esporulación se han establecido por medio de mutaciones genéticas que afectan a la esporulación, y por el momento, se conocen más de 125 genes que afectan a la esporulación (Stragier y Losick, 1996) .

La producción de proteínas usando una bacteria Bacillus incapaz de la esporulación se describe en el documento WO97/03185, por ejemplo, que propone la omisión de la esporulación mutando los genes de esporulación. La publicación describe la supresión del gen de esporulación spoIIAC de Bacillus licheniformis. La supresión se realizó usando una plásmido sensible a la temperatura al que se introdujo un producto PCR preparado por la técnica SOE (empalme por extensión de solapamiento) , en cuyo producto las regiones de ambos lados del gen spollAC se unieron de tal manera que el gen spoIIAC del medio se excluyó. La técnica SOE se describe en la patente de EE.UU. 5.023.171, por ejemplo. La estructura de supresión in vitro puede introducirse dentro de la célula bacteriana por medio del plásmido, y la replicación del plásmido libre puede evitarse elevando la temperatura, revelando así la bacteria recombinante en que está insertado el plásmido en un cromosoma. La supresión del gen deseado tiene lugar cuando el plásmido se separa del cromosoma de una cierta manera. En dicha publicación de patente WO, la técnica descrita fue, sin embargo, incapaz de eliminar el gen spoIIAC de la bacteria B. subtilis. La recombinación en la etapa de separación del plásmido siempre se da de manera que el gen spoIIAC permanece intacto.

Las cepas de B. subtilis no esporulantes, se describen, sin embargo, en otra parte. El documento EP 164.117 se refiere a una cepa de B. subtilis con una mutación en el gen spoIIA, el documento EP 492.274 se refiere a una cepa de B. subtilis con una mutación en el gen spoIID, y los documentos US 4.450.235 y US 4.450.236 se refieren a una cepa de B. subtilis con una supresión en el gen spoOA. Dichos genes se asocian con la etapa II esporulante o antes.

Uno de los genes conocidos de la siguiente etapa esporulante (III) es el gen sigG (=gen spoIIIG) que codifica el factor sigma-G que se une a una ARN polimerasa que a su vez puede unirse al promotor de ciertos genes esporulantes en la pre-espora. Este factor sigma-G es necesario en la tercera etapa de esporulación, y se conoce por controlar al menos 19 transcripciones génicas (Ishii et al., 2001) . Los productos de los genes asociados con el sistema de control Sigma-G mejoran la capacidad de supervivencia y re-germinación de las esporas (Haldenwang, 1995) .

Fougler y Errington (1989) han descrito una cepa B. subtilis 646 que es un mutante de sigG formado espontáneamente. La única cosa conocida de la mutación es que está fuera del promotor y los 30 primeros codones. Esta información se ha obtenido a partir de una fusión activa spoIIIG-lacZ que se insertó en un cromosoma. En el caso de dichos mutantes espontáneos o provocados de forma aleatoria, la posición o acción exacta de la mutación no se conoce normalmente. La posibilidad de mutación inversa, es decir, la inversión de la esporulación tal como era, de dichas cepas, no puede controlarse y la posibilidad de varias mutaciones del supresor es además alta. Como la posición de la mutación no se conoce, normalmente no es posible, además, saber si se crea una proteína cambiada. Además, una mutación en otro gen puede suprimir, por ejemplo, el efecto de la mutación original. También se han hecho intentos de desactivar el gen sigG haciendo inserciones, por ejemplo. Illing et al. (1990) , por ejemplo, clonaron un fragmento Hindlll-Pstl de 320 pares de bases de sigG a un plásmido de integración y obtuvieron como resultado de la integración una cepa B. subtilis no esporulante N15 (trpC2 spoIIIG::pSGMU422) . El plásmido de integración, sin embargo, se separó del cromosoma sin una presión de selección con cloranfenicol, y posteriormente, este tipo de cepa no es adecuada como un huésped de producción.

Karmazyn-Campelli et al. (1989) han descrito la desactivación del gen sigG insertando un casete de resistencia al cloranfenicol de 1, 5 kb (cat) entre los codones 166 y 167 (spoIIIG::cat) . Esta inserción se hizo, sin embargo, de tal

manera que el gen sigG aún permaneció, incluso aunque se cortó, en el cromosoma. Así, hay un riesgo de mutación inversa. Incluso aunque una cepa inactiva por inserción cat no pueda recombinarse, la supresión puede devolver la actividad del gen sigG y la esporulación de la cepa de vuelta a normal.

Karmazyn-Campelli et al. (1989) ha eliminado además un fragmento del gen sigG, 70 pares de bases, entre los codones 18 y 42. El efecto de esta supresión (spoIIIGΔ1) en la esporulación permanece, sin embargo, confuso, 10 porque durante la supresión, un fragmento extra HaeIII de 18 pares de bases apareció inesperadamente entre dichos codones a partir del pUC8 usado como el vector de clonación. Este fragmento extra tenía un codón de parada justo al principio, así que no hay certeza de que la supresión de 70 pares de bases sea suficiente para finalizar la esporulación. Sin el fragmento extra, al menos un factor sigma que funciona parcialmente podría crearse incluso después de la supresión, especialmente ya que la supresión no incluye regiones que se cree que son significativas en la unión a los promotores diana. En otras palabras, no quedó claro si la desactivación del gen sigG se provocó por la supresión o meramente por el codón de parada extra.

Kim J. H. et al. 2001 han descrito un mutante B. subtilis con una supresión en el gen spoIIIG. La supresión en cuestión fue solo de un nucleótido de largo y que se encontraba fuera de las regiones funcionales del gen (nucleótido 397 del gen... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Una cepa no esporulante de Bacillus subtilis, caracterizada por que comprende:

una supresión de al menos 300 nucleótidos en su gen sigG, por lo cual la supresión comprende al menos parte de ambas regiones funcionales del gen sigG que codifican los aminoácidos 67 a 80 o 229 a 248, respectivamente, de la proteína sigG, y que dicha cepa tiene la capacidad de producir un polipéptido recombinante.

2. La cepa B. subtilis según la reivindicación 1, en donde el polipéptido recombinante es beta-lactamasa.

3. La cepa B. subtilis según la reivindicación 1 o 2, caracterizada por que la supresión comprende al menos 600 nucleótidos del gen sigG.

4. La cepa B. subtilis según la reivindicación 3, caracterizada por que la supresión comprende al menos 670 nucleótidos del gen sigG.

5. La cepa B. subtilis según la reivindicación 4, caracterizada por que la supresión comprende el gen sigG entero.

6. Un método para la preparación de una cepa de Bacillus subtilis no esporulante, caracterizado por que al menos 300 nucleótidos se eliminan del gen sigG de una cepa de Bacillus subtilis, por lo que la supresión comprende al menos parte de ambas regiones funcionales del gen sigG que codifican los aminoácidos 67 a 80 o 229 a 248, respectivamente, de la proteína sigG, y se inserta ADN que codifica un polipéptido recombinante, por lo que dicha cepa tiene la capacidad de producir un polipéptido recombinante.

7. El método según la reivindicación 6, en donde el polipéptido recombinante es beta-lactamasa.

8. El método según la reivindicación 6 o 7, caracterizado por que al menos 600 nucleótidos se eliminan del gen sigG.

9. El método según la reivindicación 8, caracterizado por que al menos 670 nucleótidos se eliminan del gen sigG.

10. El método según cualquiera de las reivindicacione.

6. 9, caracterizado por preparar por medio de técnica SOE una inserción que contiene las regiones flanqueadoras de la región génica a suprimir y un gen marcador de selección, transformar la cepa B. subtilis a eliminar con la inserción, y después seleccionar los transformantes, en donde la inserción se ha integrado en el cromosoma de la bacteria de tal manera que la región génica deseada se ha eliminado.

11. El método según la reivindicación 10, caracterizado por preparar por medio de técnica SOE una inserción de ADN lineal que contiene el gen marcador de selección entre las regiones flanqueadoras de la región génica a eliminar, transformar la cepa B. subtilis a eliminar con la inserción, y después cribar los transformantes, en donde la inserción se ha integrado como resultado de una recombinación doble de homólogos, por lo que la región génica deseada se ha eliminado.

12. El método según la reivindicación 11, caracterizado por que la técnica SOE usa cebadores que tienen regiones de solapamiento de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de largo.

13. El método según la reivindicación 12, caracterizado por que usa una inserción de ADN lineal que tiene antes del gen marcador de selección una región de solapamiento de al menos 20 nucleótidos de largo que se repite después del gen marcador de selección.

14. El método según la reivindicación 12 o 13, caracterizado por que usa una inserción de ADN lineal en que la región flanqueadora corriente arriba de la región a eliminar, el gen marcador de selección, y la región flanqueadora corriente abajo de la región a eliminar son todas de esencialmente la misma longitud.

15. El método según la reivindicación 14, caracterizado por que usa una inserción de ADN lineal que tiene una longitud de aproximadamente 3 kb.

16. El uso de la cepa no esporulante de Bacillus subtilis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como un organismo de producción para producir polipéptido recombinante.

17. El uso según la reivindicación 16, caracterizado por que la cepa no esporulante de Bacillus subtilis se usa para producir beta-lactamasa.

18. Un método para la preparación de un polipéptido recombinante, caracterizado por que el polipéptido se prepara usando la cepa no esporulante de Bacillus subtilis según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y se recupera el polipéptido recombinante formado.

19. El método según la reivindicación 18, caracterizado por que se prepara beta-lactamasa.