Aumento de los niveles de alcaloides nicotínicos.

Un procedimiento para aumentar la nicotina en una planta de Nicotiana que comprende la expresión en exceso del gen A622 con respecto a una planta de control

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Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2006/004043.

Solicitante: 22nd Century Limited, LLC.

Inventor/es: HASHIMOTO,TAKASHI, KAJIKAWA,M.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA > NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION;... > A01H5/00 (Plantas con flores, es decir, angiospermas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/82 (para células vegetales)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > TABACO; PUROS; CIGARRILLOS; ARTICULOS PARA FUMADORES > FABRICACION O PREPARACION DEL TABACO PARA FUMAR O... > Características químicas o tratamiento del tabaco;... > A24B15/18 (Tratamiento del tabaco o de los sucedáneos del tabaco)

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Fragmento de la descripción:

DESCRIPCIÓN

Aumento de los niveles de alcaloides nicotínicos

CAMPO DE LA INVENCIÓN 5

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular y la regulación de la síntesis de alcaloides nicotínicos. Por lo tanto, la invención se refiere, por ejemplo, a metodología y construcciones para aumentar el nivel de alcaloides nicotínicos en una planta de Nicotiana. También se desvelan células que se manipulan por ingeniería genética para producir alcaloides nicotínicos y compuestos relacionados, cuando de otro 10 modo no los producirían.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente se conocen varias enzimas de la biosíntesis de nicotina. Por ejemplo, se ha clonado el 15 gen de la quinolato-fosforribosiltransferasa de tabaco (QPT) , véanse la patente de los EE. UU. nº 6.423.520 y Sinclair y col., Plant Mol. Biol. 44: 603-17 (2000) , y su supresión proporciona reducciones significativas de nicotina en plantas transgénicas de tabaco. Xie y col., Recent Advances in Tobacco Science 30: 17-37 (2004) . Igualmente, se ha observado que la supresión de una secuencia endógena de putrescina-metiltransferasa (PMT) reduce los niveles de nicotina pero aumenta los niveles de anatabina de dos a seis veces. Hibi y col., Plant Cell 6: 723-35 20 (1994) ; Chintapakorn y Hamill, Plant Mol. Biol. 53: 87-105 (2003) ; Steppuhn y col., PLoS Biol. 2:8:e217: 1074-1080 (2004) .

Mientras que los esfuerzos de investigación anteriores se han centrado en el uso de enzimas de la biosíntesis de nicotina para reducir la nicotina en las plantas, muy pocas investigaciones han abordado el papel de 25 las enzimas de la biosíntesis de nicotina en el aumento de la síntesis de alcaloides nicotínicos. Esta falta de datos de regulación por aumento puede atribuirse al hecho de que la expresión en exceso de un gen conocido de la biosíntesis de alcaloides nicotínicos, como PMT o QPT, no tiene necesariamente que aumentar la producción y acumulación de metabolitos secundarios en la planta. Es decir, no necesariamente porque la regulación por disminución de un gen de la biosíntesis de alcaloides nicotínicos reduzca la producción y acumulación de alcaloides, 30 la expresión en exceso de este mismo gen de biosíntesis de alcaloides nicotínicos va a aumentar la producción y acumulación de alcaloides nicotínicos.

Debido a la escasez de investigación, existe la necesidad de identificar genes que aumenten la biosíntesis y acumulación de la nicotina. Por ejemplo, dado que los alcaloides nicotínicos desempeñan un papel 35 importante en la protección de las plantas contra insectos y herbívoros, probablemente sea ventajoso aumentar la síntesis de alcaloides nicotínicos en una planta huésped. Desde el punto de vista de los herbívoros, el aumento de la síntesis y acumulación de nicotina proporcionará un modo respetuoso con el medio ambiente de intervenir en las interacciones entre planta y plaga.

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Desde el punto de vista de la industria tabaquera, en que la nicotina es el componente física y fisiológicamente activo del humo de los cigarrillos, puede ser ventajoso aumentar el contenido de nicotina en el tabaco por ingeniería genética. Los estudios de investigación demuestran que cuando se añade físicamente nicotina adicional al tabaco de los cigarrillos de una fuente externa, los fumadores inhalan menor cantidad de los componentes más dañinos del humo como alquitrán y monóxido de carbono. Véase Armitage y col., 45 Psychopharmacology 96: 447-53 (1988) , Fagerström, Psychopharmacology 77: 164-67 (1982) , Russell, Nicotine and Public Health 15: 265-84 (2000) y Woodman y col., European Journal of Respirator y Disease 70: 316-21 (1987) . Asimismo, un informe del Instituto de Medicina (IOM) de los EE. UU. sobre productos potenciales de exposición reducida (PREP) concluyó que otra estrategia general para reducir el daño del tabaco es la retención de nicotina a niveles agradables o adictivos mientras se reducen los componentes más tóxicos. Véase CLEARING THE SMOKE, 50 ASSESSING THE SCIENCE BASE FOR TOBACCO HARM REDUCTION, IOM, en la página 29 (2001) ; publicación a la que la industria del tabaco normalmente hace referencia como â??informe del IOMâ??.

Además de las aplicaciones más tradicionales para productos con aumento de nicotina, como cigarrillos y otros productos de tabaco, algunos estudios farmacológicos recientes sugieren un papel terapéutico 55 para la nicotina y compuestos relacionados. Por ejemplo, varios grupos de investigación están estudiando actualmente fármacos que reconocen selectivamente receptores de nicotina como un modo de tratar deficiencias cognitivas como la enfermedad de Alzheimer, la esquizofrenia y la pérdida de memoria relacionada con la edad. Singer, â??The Upside to Nicotineâ??, Technology Review (28 de julio de 2006) . Se ha demostrado que ligandos de receptores de acetilcolina, como la nicotina, tienen efectos sobre la atención, la cognición, el apetito, la drogadicción, 60 la memoria, la actividad extrapiramidal, la actividad cardiovascular, el dolor y la motilidad y actividad gastrointestinal. Patente de los EE. UU. nº 5.852.041. Por lo tanto, existen beneficios terapéuticos de la nicotina y los compuestos relacionados y por lo tanto existe la necesidad de mejores procedimientos para su producción.

Por consiguiente, existe una necesidad continua de identificar genes adicionales cuya expresión pueda modificarse para aumentar el contenido de alcaloides nicotínicos en las plantas, en particular de nicotina en plantas de N. tabacum, así como para producir nicotina y compuestos relacionados en células no productoras de nicotina.

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RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Existen cuatro genes, A622, NBB1, PMT y QPT, en los que se puede influir para aumentar los niveles de alcaloides nicotínicos en plantas de Nicotiana, así como para sintetizar alcaloides nicotínicos y compuestos relacionados en células no productoras de nicotina. 10

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para aumentar los alcaloides nicotínicos, como nicotina, en una planta de Nicotiana, mediante la expresión en exceso de A622 con respecto a una planta de control. En otra realización, se expresan en exceso A622 y NBB1. En otra realización más, se expresan en exceso A622 y NBB1 y al menos uno de QPT y PMT también se expresa en exceso. En otra realización más, se expresan 15 en exceso QPT y A622.

La presente memoria descriptiva describe una planta con aumento de nicotina y productos derivados de la misma, que se produce por cualquier procedimiento de expresión en exceso de uno o más de A622, NBB1, PMT y QPT. Los productos se seleccionan del grupo que consta de un cigarrillo, un producto farmacéutico y un 20 producto nutracéutico.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de alcaloides nicotínicos, que comprende la expresión heteróloga de NBB1 y A622 en una planta o célula que de otro modo no produce alcaloides nicotínicos. En una realización, la expresión de NBB1 y A622 tiene lugar en una célula 25 seleccionada del grupo que consta de una célula bacteriana, de levadura, hongo filamentoso, alga, mamífero o insecto.

Además se desvela una planta con aumento de alcaloides nicotínicos, producida por la expresión heteróloga de NBB1 y A622 en una planta o célula que de otro modo no produce alcaloides nicotínicos. Un producto 30 con alcaloides nicotínicos puede obtenerse por la expresión heteróloga de NBB1 y A622 en una planta o célula que de otro modo no produce alcaloides nicotínicos.

Además se desvela un procedimiento para la producción comercial de un alcaloide nicotínico que comprende (a) proporcionar una pluralidad de células que expresan A622 y NBB1 y (b)... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para aumentar la nicotina en una planta de Nicotiana que comprende la expresión en exceso del gen A622 con respecto a una planta de control.

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2. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además la expresión en exceso del gen NBB1.

3. El procedimiento de la reivindicación 2 que comprende además la expresión en exceso de al menos uno de los genes QPT y PMT; preferentemente en el que se expresan en exceso los genes QPT y A622.

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4. Un procedimiento para aumentar la nicotina en una planta de Nicotiana que comprende:

(a) la transformación de una planta de Nicotiana con una construcción que comprende, en la dirección 5â? a 3â?, un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima que aumenta la síntesis de nicotina; en que dicho ácido nucleico es el gen A622 y el gen A622 se expresa en exceso. 15

(b) la regeneración de plantas transgénicas de Nicotiana a partir de la planta transformada; y

(c) la selección de una planta transgénica de Nicotiana con un aumento del contenido de nicotina con respecto a una planta de control. 20

5. Un procedimiento para aumentar la nicotina y el rendimiento en una planta de Nicotiana de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende:

(a) la transformación de una planta de Nicotiana con (i) una primera construcción que comprende, en la dirección 5â? 25 a 3â?, un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima que aumenta la síntesis de nicotina; y (ii) una segunda construcción que comprende, en la dirección 5â? a 3â?, un promotor unido operativamente a un ácido nucleico heterólogo que codifica una enzima que aumenta el rendimiento; en que dicha primera construcción comprende un ácido nucleico que codifica la enzima A622 y el gen A622 se expresa en exceso; 30

(b) la regeneración de plantas transgénicas de Nicotiana a partir de la planta transformada; y

(c) la selección de una planta transgénica de Nicotiana con aumento un del contenido de nicotina y aumento del rendimiento con respecto a una planta de control. 35

6. Una planta de Nicotiana producida por cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha planta expresa en exceso el gen A622 y presenta un aumento del nivel de nicotina con respecto a una planta de control.

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7. Uso de la planta de la reivindicación 6 para la producción de un producto seleccionado del grupo que consta de un cigarrillo, un producto farmacéutico y un producto nutracéutico.